PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERZITY V BRNĚ Ústav experimentální biologie Molekulární příčiny hyperkinetické poruchy DISERTAČNÍ PRÁCE Brno 2007 RNDr. Radim Štaif
Bibliografická identifikace Jméno a příjmení autora: Radim Štaif Název disertační práce: Molekulární příčiny hyperkinetické poruchy Název disertační práce anglicky: Molecular causes of hyperkinetic disorder Studijní program: PřF D-BI Biologie, doktorský studijní program Studijní obor (směr), kombinace oborů: PřF FYZZ Fyziologie živočichů Školitel: doc. RNDr. Omar Šerý, Ph.D. Rok obhajoby: 2007 Klíčová slova v češtině: ADHD, hyperkinetická porucha, gen, polymorfizmus, asociační studie Klíčová slova v angličtině: ADHD, hyperkinetic disorder, gene, polymorphism, association study
Příroda své zákony neporušuje. Leeonardo da Vinci Radim Štaif, Masarykova univerzita v Brně, 2007
Děkuji panu prof. RNDr. Vladimíru Šimkovi, CSc., doc. RNDr. Omarovi Šerému, Ph.D., Renátě Pitelové a Haně Šulcové za vedení, podporu, finanční zázemí a čas, který mi věnovali během mé experimentální práce. Mé poděkování patří také všem spoluřešitelům z Oddělení dětské psychiatrie FN Brno Bohunice pod vedením prof. MUDr. Ivany Drtílkové, CSc. a doc. RNDr. Vladimíru Znojilovi, CSc. za pomoc při zpracování statistických výsledků.
Obsah: Souhrn Summary 1. Úvod 1 2. Základní informace 3 2.1. Definice pojmů..3 2.2. Historie, současnost, budoucnost..5 2.3. Základní informace a výskyt hyperkinetické poruchy..7 2.4. Klasifikace a diagnostika...8 2.5. Etiologie hyperkinetické poruchy.12 2.6. Neurobiologie hyperkinetické poruchy.12 2.7. Mechanizmus účinku stimulancií..20 2.8. Enviromentální a negenetické faktory...20 2.9. Molekulárně-genetická podstata...21 2.10. Asociační molekulárně-genetické studie ADHD 23 3. Zkoumané polymorfizmy kandidátních genů, jejich receptory, enzymy a chemokiny...29 3.1. TaqI A polymorfizmus genu pro dopaminový receptor D2 (DRD2) 29 3.2. 3 UTR VNTR 40 bp polymorfizmus genu pro dopaminový přenašeč (DAT1)...31 3.3. Val158Met polymorfizmus genu pro katechol-o-methyltransferázu (COMT).33 3.4. A/G polymorfizmus ve 13. intronu genu pro monoaminoxidázu B (MAOB)..34 3.5. M235T polymorfizmus genu pro angiotensinogen (AGT) 34 3.6. I/D polymorfizmus genu pro angiotensinkonvertázu (ACE).35 3.7. - 174 C/G polymorfizmus genu pro interleukin 6 (IL-6)...36 3.8. -330 T/G polymorfizmus genu pro interleukin 2 (IL-2) 38 3.9. -308 A/G polymorfizmus genu pro tumor nekrotizující faktor alfa (TNF-α)...39 3.10. Val66Met polymorfizmus genu pro brain-derived neutrofický faktor (BDNF).40 3.11. Delta 32 polymorfizmus genu pro chemokinový receptor 5 (CCR-5) 41 3.12. Asn40Asp polymorfizmus genu pro µ opioidní receptor (Mu)...42
4. Materiál a metodika 43 4.1. Výběr osob pro studii.43 4.2 Izolace DNA...43 4.2.1. Izolace DNA u hyperkinetického souboru osob.43 4.2.2. Izolace DNA u kontrolního souboru osob..43 4.3. Amplifikace.45 4.4. Restrikční analýza...46 4.5. Gelová elektroforéza...47 4.6. Detekční systém PCR Real Time 47 4.7. HPLC (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie) 48 4.8. Obrázky použitého vybavení pro genotypizaci...49 4.9. Primery a reakční podmínky pro jednotlivé genotypizované polymorfizmy..51 4.9.1. Detekce TaqI A polymorfizmu genu pro DRD2..51 4.9.2. Detekce 40-bp VNTR polymorfizmu genu pro DAT1...52 4.9.3. Detekce Val158Met polymorfizmu genu pro COMT.... 53 4.9.4. Detekce I/D polymorfizmu genu pro ACE..54 4.9.5. Detekce -174 polymorfizmu genu pro IL-6.55 4.9.6. Detekce delta 32 polymorfizmu genu pro CCR-5...56 4.9.7. Detekce -308 A/G polymorfizmu genu pro TNF alfa.57 4.9.8. Detekce M235T polymorfizmu genu pro AGT...58 4.9.9. Detekce A/G polymorfizmu v intronu 13 genu pro MAOB 59 4.9.10. Detekce -330 T/G polymorfizmu genu pro IL-2...60 4.9.11. Detekce Asn40Asp polymorfizmu genu pro Mu receptor.61 4.9.12. Detekce Val66Met polymorfizmu genu pro BDNF..62 4.10. Statistické zpracování výsledků 63 5. Výsledky studie 63 5.1. Celkové výsledky studie 63 5.2. Výsledky genotypizace jednotlivých polymorfních genů a jejich vztah k ADHD...65 5.2.1. TaqI A polymorfizmus genu pro DRD2 65
5.2.2. 3 UTR VNTR 40 bp polymorfizmus genu pro DAT1...66 5.2.3. Val158Met polymorfizmus genu pro COMT 69 5.2.4. A/G polymorfizmus ve 13. intronu genu pro MAOB 70 5.2.5. M235T polymorfizmus genu pro AGT..71 5.2.6. I/D polymorfizmus genu pro ACE.72 5.2.7. -174 C/G polymorfizmus genu pro IL-6 73 5.2.8. -330 T/G polymorfizmus genu pro IL-2.74 5.2.9. -308 A/G polymorfizmus genu pro TNF-α 75 5.2.10. Val66Met polymorfizmus genu pro BDNF.76 5.2.11. Delta 32 polymorfizmus genu pro CCR-5 77 5.2.12. Asn40Asp polymorfizmus genu pro Mu opioidní receptor..78 5.3. Vybrané fotografie detekovaných genotypů...79 5.4. Detekční křivky genotypů získané za pomocí metody Real Time PCR.82 6. Diskuse..84 7. Závěr..92 8. Přílohy 93 8.1. Oslovovací dopis pro kontrolní soubory chlapců 8.2. Informovaný souhlas 8.3. Rodičovský dotazník CPQ 8.4. Učitelský dotazník CTQ 8.5. Označení některých zkoumaných polymorfizmů pomocí rs čísla v databázi GeneBank 9. Seznam zkratek.94 10. Seznam literatury 97 11. Internetové zdroje..111 12. Publikace a výstupy autora ke studii 112
Souhrn Hyperkinetická porucha (ADHD) je multifaktoriální onemocnění s genetickým pozadím. Geny pro dopaminové receptory patří mezi nejvíce zkoumané kandidátní geny, protože psychostimulantní léky, které ovlivňují dopaminový systém jsou využívány při léčbě ADHD. V zájmu výzkumu jsou také ostatní geny ovlivňující neurotransmiterový a imunitní systém. V rámci disertační práce jsem zkoumal, zda existuje vztah mezi hyperkinetickou poruchou a polymorfizmy dvanácti kandidátních genů: DAT1, DRD2, COMT, MAOB, ACE, AGT, CCR- 5, BDNF, Mu, IL-2, IL-6 a TNF-α. Podstatou této asociační studie bylo zjistit, zda ADHD chlapci (118) mají odlišné genotypové a alelické frekvence výše zmíněných polymorfních genů ve srovnání s kontrolní skupinou chlapců (153). V práci nebyly objeveny žádné signifikantní rozdíly v alelické a genotypové frekvenci mezi skupinami chlapců u genů pro COMT, MAOB, ACE, AGT, CCR-5, BDNF, Mu, IL-2, IL-6 a TNF-α (p>0,05). Statistická analýza provedená pomocí Fisher exact testu nepotvrdila souvislost mezi ADHD a dříve zkoumanou 10-repetitivní alelou a 10/10 genotypem 3 UTR VNTR 40 bp polymorfizmu genu pro DAT1 (p=0,531). Při studiu TaqI A polymorfizmu genu pro DRD2 měli ADHD chlapci ve srovnání se skupinou kontrolní častěji zastoupenou alelu A1 a genotyp A1A1 (p=0,0013). Výsledky studie prokázaly, že ADHD je v České populaci chlapců asociována s TaqI A polymorfizmem genu pro DRD2. Přítomnost A1 alely TaqI A polymorfizmu genu pro DRD2 zvyšuje riziko vzniku ADHD.
Summary Attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) is a multifactorial disorder with genetic contribution. Dopamine genes have been the initial candidates based on the site of the action of the psychostimulant drugs. The other genes from neurotransmitter and immune system are in focus too. I have investigated whether there is an association between ADHD and polymorphisms of 12 candidate genes: DAT1, DRD2, COMT, MAOB, ACE, AGT, CCR-5, BDNF, Mu, IL-2, IL-6 and TNF-α in my disertation work. The aim of this case-control study was to determine whether the ADHD boys (118) have different genotype and allelic frequencies of examined polymorphisms of the above mentioned genes compared to controls (153). No significant differences were found between groups of boys in allelic and genotype frequencies of COMT, MAOB, ACE, AGT, CCR-5, BDNF, Mu, IL-2, IL-6, TNF-α genes (p>0.05). The statistical analysis using Fisher exact test did not confirme the association of the previously possitive-investigated 10-repeat allele or 10/10 genotype of DAT1 gene (p=0.531). For TaqI A polymorphism of DRD2, ADHD probands were more likely than controls to have the A1 allele and genotype A1A1 (p=0.0013). The results of the study showed that ADHD in Czech children population is associated with TaqI A polymorphism of DRD2 gene. The presence of DRD2 A1 allele increases the risk of ADHD.