ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE. Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra speciální zootechniky

ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra speciální zootechniky Vlivy působící na kvalitu produkovaných embryí a zabřezávání plemenic v dojených stádech skotu Disertační práce Autor: Školitel: Ing. Zdeňka Hegedűšová prof. Ing. Ladislav Štolc, CSc. Konzultant: prof. Ing. Louda František, DrSc. Praha 2011

Prohlášení: prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Vlivy působící na kvalitu produkovaných embr yí a zabřez ávání plem enic v dojených stádech skotu vypracoval a samostatně a použila jen pramenů, které cit uji a uvádím v použité literatuře. V Šum perku dne 12.12. 2011 Podpis:

Poděk ování: Při příležitosti odevzdání doktorské dis ertační práce chci poděkovat školiteli prof. Ing. Ladislavu Štolcovi, CSc. za cenné připomínky a pomoc při zpracování doktorské disertační práce. Dále bych chtěla poděkovat prof. Ing. Františkovi Loudovi, DrSc. za prakti cké připomínky při zpracování práce a Mgr. Aleši Dufkovi za pomoc při statistickém zpracování výsledků.

OBSAH 1. ÚVOD... 6 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED... 8 2.1 Technologické postupy... 9 2.1.1 Příprava dárkyň... 9 2.1.2 Příprava příjemkyň - synchronizace pohlavních cyklů... 12 2.1.3 Získávání embryí... 13 2.1.4 Přenos embryí... 14 2.1.5 Uchování embryí hlubokým zmrazováním... 14 2.1.6 Uchování embryí hlubokým zmrazováním... 15 2.1.7 Kontrolovaný režim zmrazování a rozmrazování... 16 2.1.8 Vitrifikace embryí... 17 2.1.9 One-step metoda... 17 2.2 Vlivy působící na úspěšnost výplachu... 18 2.2.1 Vliv sezony... 18 2.2.2 Vliv výživy... 18 2.2.3 Vliv superovulačního přípravku... 19 2.2.4 Vliv užitkovosti na kvalitu embryí... 21 2.2.5 Vliv věku... 21 2.2.6 Vliv Cl... 22 2.2.7 Vliv plemene... 22 2.3 Vlivy působící na úspěšnost přenosu... 22 2.3.1 Vliv sezony... 22 2.3.2 Vliv prostředí... 23 2.3.3 Vliv vývojového stadia a kvality embrya... 24 2.3.4 Vliv věku... 24 3. CÍL PRÁCE... 26 4. MATERIÁL A METODIKA... 28 4.1. Zisk a kvalita vypláchnutých embryí... 28 4.2. Sledované plemenné skupiny... 28 4.3. Metodické postupy hormonálního ošetření superovulace... 29 4.3.1. Superovulační ošetření A... 29 4.3.2. Superovulační postup B... 30 4.3.3. Superovulační postup C... 30 4.4. Metodický postup výplachu embryí... 31 4.5. Metodický postup hodnocení získaných embryí... 31 4.6. Metodické postupy přenosu embryí... 32 4.6.1. Postupy přenosu čerstvých embryí... 32 4.6.2. Postupy přenos zmrazených embryí... 32 4.7. Metodické postupy sledování vlivů na zisk a kvalitu embryí... 33 4.7.1. Sledování vlivu použitého superovulačního postupu na zisk a kvalitu embryí... 33 4.7.2. Sledování vlivu velikosti ovárií a počtu Cl na zisk a kvalitu embryí... 33 4.7.3. Sledování vlivu věku na zisk a kvalitu embryí... 34 4.7.4. Sledování vlivu plemene... 34 4.8. Metodické postupy sledování vlivů na zabřezávání po přenosu embryí... 35 4.8.1. Sledování vlivu věku... 35 4.8.2. Vliv přenosu čerstvých a zmrazených embryí... 35

4.8.3. Vliv plemene příjemkyně... 35 4.8.4. Sledování vlivu vývojového stadia a kvality přeneseného embrya... 35 4.9. Použité statistické metody pro vyhodnocení výsledků... 36 5. VÝSLEDKY A DISKUZE... 38 5.1. Výsledky superovulace... 38 5.1.1. Hodnocení vlivu superovulačního přípravku na počet a kvalitu získaných embryí... 38 5.1.2. Hodnocení vlivu velikosti ovárií a počtu žlutých tělísek Cl při rektální kontrole na počet a kvalitu získaných embryí... 41 5.1.3. Hodnocení vlivu kategorie a věku dárkyně na počet a kvalitu získaných embryí... 47 5.1.3.1. Vliv kategorie kráva, jalovice na počet a kvalitu získaných embryí... 47 5.1.3.2. Vliv věku dárkyně na počet a kvalitu získaných embryí... 48 5.2.Výsledky přenosů embryí... 55 5.2.4. Vliv vývojového stádia embrya na zabřezávání... 65 6. ZÁVĚR... 70 7. PŘÍLOHY... 74 4.3.1. Superovulační ošetření A... 74 4.3.2. Superovulační postup B... 75 4.3.3. Superovulační postup C... 76 4.8.5. Sledování vlivu vývojového stadia a kvality přeneseného embrya... 78 8. PŘEHLED LITERATURY... 80 9. OBRAZOVÁ PŘÍLOHA:... 95

1. Ú V O D Přenos embryí v chovu skotu představuje významné šlechtitelské opatření urychlující genetick ý pokrok. Tradice přenosů embryí má v naši ch podmí nkách vysokou technologickou úroveň, první tele se po přenosu embrya narodilo již v roce 1976 a po přenosu zmrazeného embrya v roce 1982. Metoda ET v chovu skotu se provozně používá již pětadvacet let. V období let 1983-2007 bylo provedeno 35.604 výplachů dárkyň a uskutečněno 150.057 přenosů (PETELÍKOVÁ, 2008) Přenos embryí je využíván u masných i dojených plemen skotu. Příprava dárkyň a příjemkyň vychází z obecných principů a z ahrnuje následující postupy: - výběr dárkyň a s ynchroniz aci pohlavního cyklu - superovulační ošetření - inseminaci a reinseminaci - synchronizaci pohlavních cyklů příjemkyň na vývojové stádium embrya - 7. den po 1. inseminaci odběr embryí a přenos čerstvých embryí Využívání ET u dojených plemen je zaměřeno na genetické zvyšování úrovně chovaných plemen, zkrácení generačního intervalu, možnost zisku embryí od jalovi c nezatížených produkcí před zařazováním do reprodukčního procesu Počet přenosů em bryí skotu má ve světě trvale stoupající tendenci, v České republice počty provedených výplachů a přenosů od roku 2004 klesají. V roce 2007 bylo v ČR vypláchnuto 1.002 dárkyň, což je o 208 méně oproti roku 2006. Počet přenosů zaznamenal oproti roku 2006 pokles o 195. Celkem bylo provedeno 5.880 přenosů. Došlo ke zvýšení průměrného počtu přenosuschopných embryí z výplachu o 0,1 proti roku 2006. Znamená to, že od dárkyně bylo v průměru získáno na v ýplach 5,4 přenosuschopných embryí. Tento počet je ovšem stále nízký a limi tuje efektivitu ET (PETELÍKOVÁ, 2008). 6

Podle údajů Evropské společnosti pro přenos y embryí (A.E.T.E.) bylo v roce 2008 provedeno v Evropě 14.894 v ýplachů dárkyň a 88.858 nechirurgických přenosů embryí. Počty přenosů embryí v ČR jsou stále nižší. Z počtu všech vyplachovaných dárkyň v roce 2007 bylo 47,8 % dárkyň mléčn ých plemen. Stav metody přenosů embryí u skotu v ČR komentuje ve své práci PETELÍKOVÁ (2008) - aktivita ET v roce 2007 v porovnání s rokem 2006 byla méně úspěšná. Došlo nejen k poklesu počtu přenosů embryí, ale i ke snížení počtu vyplachovaných dárkyň, z ejména mléčných plemen, k nižšímu počtu získaných přenosuschopných embryí a k poklesu počtu uložených zmrazených embryí. Důvodem tohoto stavu může být skutečnost, že se změnila dotační politika státu vzhledem k ET. Někteří chovat elé přestali s ohledem na vysoké náklady tuto metodu používat. V současné době odpovídají u nás používané technologické postupy a vybavení světovému standardu a i dosahované výsledky jsou s rovnatelné s chovatelsky vyspěl ými zeměmi. I přes klesající počt y přenosů embryí, stále tato metoda předst avuje významnou biotechnologickou metodu v chovu skotu. 7

2. L I T E R Á R N Í P Ř E H L E D Biotechnologie se využívají v chovu skotu k dos ažení vyšš ího počtu potom stva a zlepšení genot ypu (GALLI et al., 2003). Embryotransferem je možné dosáhnout lepšího využití dojnic, dosáhnout genetický pokrok a zkrátit generační interval (DOHY, 1999). P osledních 30 let byl embryotransfer slibný nástroj pro produkci embryí a zvyšování hodnotné genetiky u různých druhů zvířat (MERTON et al., 2003). Embryotransfer nabízí mnoho výhod v chovu hospodářských zvířat, nabízí také možnost zvýšit celkovou míru pokroku ve šlechtění pro zv ýšení produktivit y (GREVE et al., 2005). Hodně let bylo úspěšně věnováno výzkumu nových technologií v rámci embryotransferu, zatímco základní postup superovulace proš el za posledních 20 let jen málo změnami. Největší problém v rámci ET j e nespolehlivost superovulační odpovědi (SZABARI et al., 2008). Stále nejsou úplně známé faktory, které vedou k variabi litě zisku embryí; jde o faktory vnitřní a vnější (ALVAREZ, 1994; KAFI a MCGOWAN, 1997). Mezi vnit řní faktory patří genetika (plemena a jednotlivá zvířata, která jsou více či méně citlivé na gonadotropin), fyziologické vlastnosti (věk, folikulární dominance, a populace folikulů v době superovulace), stav výživy (tělesná kondice a deficit y nebo přemíra živin); podmínky vnitřního prostředí (vaječníků, děloh y a vejcovodu). K vnějším faktorům patří používání různých komerčních přípravků FSH a jejich dávkování, způsob podání, období, a řízení zemědělsk ých podniků (BREUEL et al.; 1991, ALVAR EZ, 1994; KAFI a MCGOWAN, 1997). Široká variabilita superovulační odpovědi výrazně zvyšuje náklady ET. (SZABARI et al., 2008). Pochopení faktorů které se podílejí na produkci embryí je důležité pro využití embryotransferu (SILVA et al., 2009). V období let 1983-2007 bylo provedeno 35.604 výplachů dárk yň a uskutečněno 150.057 přenosů embryí. Přehled aktivit na úseku ET v ČR od roku 1983 podle roků je v tabulce. 8

Tab. Přehled počtu provedených přenosů od roku 1983 v ČR Rok 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 Počet přenosů 72 512 2553 4085 8321 20399 19628 11182 5285 Rok 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 Počet přenosů 4090 2681 3491 3833 4535 4159 4602 4993 4928 Rok 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Počet přenosů 4930 5901 5920 6427 5575 6075 5880 5451 2.1 Technologické postupy 2.1.1 Příprava dárkyň Příprava dárkyň z ahrnuje jej ich výběr, s ynchronizaci říje, superovulační ošetření a insemi naci. Hormonální ošetření dárkyň se provádí v době luteální fáze, nejlépe od 9. do 13. dne estrálního cyklu v luteální fázi je na ovariu určujícím útvarem corpus luteum produkující hormon progesteron. Synchronizace říje ROWSON et al. (1971) dokázal, že s ynchronizaci říje u krav během jejich luteální fáze lze navodit aplikací PGF2 alfa. V dalších letech byl y vyrobeny analogy t y jsou v porovnání s přírodním prostaglandinem účinnější. Předpokladem efektivního výsledku jsou cyklující plemenice, aplikace musí být provedena v době, kdy má corpus luteum receptory na PGF2 alfa. Uvádí se jako vhodný termín od 5. do 17. dne cyklu. Aplikace je účinná, pokud byla detekována říje a ovulace byla potvrzena zjištěním corpus luteum. Říje se dostaví za 3-4 dny, kdy se provádí inseminace. Výsledky s ynchronizace říje preparát y prostaglandinu F2alfa pro účel y přenosu embryí j e možné shrnout asi takto: - ošetření zvířat je jednoduché, - nástup říje je cca 36 až 72 hodin po aplikaci účinné látky, 9

oš etření prost aglandinem umožňuje inseminaci v předem stanovené době, tj. 72 hodin - zabřez ávání po inseminaci v s ynchronizované říji j e srovnatelné s fertilitou po i nseminaci ve spontánní říji. Podle názoru řad y našich i zahraničních autorů široké použití PGF2alfa a jeho s yntetických analogů vyřešilo uspokojivě otázku s ynchronizace cyklu dárkyň a příjemk yň. Úspěšná superovulace je v současné době limitujícím faktorem pro ši roké uplatnění přenosů embryí u skotu (MAPLETOFT et al., 2002). Základním princi pem superovulace je stimulace folikulární ho s ystém u parenterálním podáním vyšších dávek FSH, než jsou jeho endogenní hladiny KUMMER et al. (1981). V průběhu asi 30 let byl y v ypracovány různé modifikace ošetření FSH, jejichž cíl em byla stabilizace výsledků superovulace PETELÍKOVÁ (2004). Výsledky superovulace se vyznačují velkou variabilitou, která je dána řadou faktorů s větším či menším významem (kvalita preparátu, citlivost zvířete, optimální fyziologický stav a vnitřní prost ředí dárkyn ě, roční období, úroveň užitkovosti, chov, pl emenná příslušnost a další). Výzkumu superovulace a všech souvislostí (folikulogeneze, oplození a dalšího vývoje) je věnována velká pozornost. Jedním z možných důvodů variabilit y superovulace je u skotu stav folikulů v době, kdy je zahájeno ošetření gonadotropinu - M APLETOFT et al. (2002). Je nezbytné předcházet j akýmkoli stresovým situacím, dokonalé sledování říje je zárukou úspěchu superovulace. Dárkyně mus í být ve výborné kondi ci, aby jejich regulační endokrinní mechanizm y zvládl y nefyziologickou situaci při superovulaci (PETELÍKOVÁ, 2004). GOULDING et al. (1996) uvádí, že 9. den nebo 10. den estrálního cyklu je vhodný pro superovulační ošet ření. Podle konvenčního superovulačního protokolu je při ošetření gonadotropiny léčba zahájena 8-12 den po ovulaci. Tento přístup přináší obtíže, protože v yžaduje det ekci říje před zahájení m ošetření, dochází 10

k individuálním rozdílům mezi zvířat y, toto může nepříznivě ovlivnit superovulační odpověď -(MAP LETOFT et al., 2002). Několik studií prokázalo, že je důležité zahájit léčbu gonadotropiny v době vzniku folikulární vlny (MAP LETOFT et al., 2002, ADAMS et al., 1994). NASSER et al.(1993) získali vyšší superovulační odpověď, pokud superovulační oš etření bylo zahájeno v den vzniku folikulární vlny, oproti superovulačnímu ošetření provedeném o 1-2 dny později. K vyvolání superovulace se v našich podmínkách nejčastěj i používá FSH (ŘÍHA, 2000). Protož e jeho doba působení je krát ká, je podáván podle většiny protokolů po dobu 3 až 4 dnů, obvykle 2x denně. Někteří autoři doložili, že stačí aplikace jedenkrát denně (GODKE, 1991, ŘÍHA, 1998). BÓ (2009) uvádí stále přetrvávající potřebu zjednodušit superovul ační protokol, aniž by byla ohrožena produkce embryí. Poměrně vysoká pracnost ošetření a tém ěř 100 %ní variabilita výsledků staví superovulaci do role nejslabšího a nejméně st abilního článku metod y ET (ŘÍHA et al. 1999). Superovulaci můžem e vyvolat i aplikací dalších preparátů PMSG, HMG všechny mají své přednosti i nedostatky. PMSG pregnant mare serum gonadot ropin se získává ze séra březích klisen. Hormon se objevuje v krvi kli sen mezi 37. až 47. dnem gravidit y. Tento superovulační prostředek byl dříve hojně využíván, předností je, že v s ystému ošetření stačí jedna aplikace, obsahuje oba gonadotropiny, tj. FSH a LH. PMSG má dlouhý 120 hodinový poločas rozpadu, to má za nás ledek tvorbu cyst a tím negativní dopad na oplozenost oocytů, moti litu vejcovodu a také kvalitu získaných embryí. K odst ranění tohoto nedostatku byl vyvinut postup využívají cí anti-pms G sérum, které je aplikováno dárkyním v době začátku říje (ŘÍHA, et al., 1999). Řada autorů publikovala zl epšené výsl edk y při zařazení ant i-pmsg (SAUMANDE, CHUPIN, 1981; GONZALES, 1994; BEVERS et al., 1993). 11

Jako další gonadotropin lze použít k vyvolání s uperovulace HMG human menopausa gonadotropin. Tento hormon se získává z moče žen po menopause ( FSH a LH). SUGENO et al. (2002) používali k ošetření hormon menopauzálního původu (humánní menopauz ální hormon - HMG). Ověřovali dva t ypy ošetření. První skupina byla ošetřena dávkou HMG 750 I.U. a druhá skupina dávkou HMG 600 IU. U první skupiny bylo zís káno více celkem a přenosuschopných embryí. ALC IVAR et al. (1992) sledovali vliv superovulační přípravy a prováděli anal ýzu koncentrace hormonu po ošetření hormonu menopauzál ního původu a hypofyz árního foli kulostimulujícího horm onu. Nebyly zjištěny rozdíl y. V posledních letech se nejčastěji používá FSH. 2.1.2 Příprava příjemkyň - synchronizace pohlavních cyklů Důležitá je také příprava příjemkyň. Často js ou jako příjemkyně používány z hlediska plodnosti problémové jalovice nebo krávy. Pří prava příjemkyň vychází z toho, že příjemkyně mají být v říji současně s inseminací dárkyně. Říje u příjemkyň před přenosem může být buď spontánní nebo indukovaná prostaglandinem. Ošetření prostaglandinem se provádí buď 7.- 17. den po známé říji nebo při rektálním zjištění přítom nosti Cl na vaječníku. Vlastní proces luteol ýz y působením PGF2alfa není plně objasněn. (DOSTÁL, et al. 1989) vysvětlují úlohu prostaglandinu následovně: - PGF2alfa (za účasti dalších prost aglandinů) způsobuje primární snížení hladiny progesteronu, což vede v důsledku existence zpětné vazb y až k regresi Cl; - prostaglandiny se přímo účastní regrese Cl, a to přím ým účinkem na luteální tkáň a v yvoláním konstrikce krevního řečiště zásobujícího vaječník, které ve svých důsledcích vede k omezení funkce Cl a jeho regresi. Je nutno si uvědomit že bez řádného sledování říje a vedení dokum entace o ní nelze spolehlivě připravit příjemkyně. Týk á se to zejména 12

indukce říje za použití jedné dávky PGF2alfa. Tomuto ošetření musí vždy předcházet vyšetření ovarií na zjištění Cl (ŘÍHA et al. 1999). Hormonální stimulací dárkyň a příjemk yň nesmí b ýt znemožněno jejich další chovatelské využití (ROFFEIS,ZELFEL, 1990). Při sledování snášenlivosti Oestrophanu inj. po podání desetinásobně zvýšené dávk y při opakované aplikaci nebyl prokázán negativní vliv na dojnice. Zvýšení pulsové frekvence bylo pouze přechodného charakteru. Biochemické ukazatele se významně nezměnily. Po uplynutí 24 hodin od aplikace Oestrophanu nebyla v mléce ošetřených dojnic zjištěna vyšší koncentrace cloprostenolu (REICHEL et al., 1985). V literatuře domácí i zahraniční je věnováno poměrně málo pozornosti vlivu přípravy dárkyň a příjemkyň na jejich další plodnost (KNE ISSL, 1991; ŘÍHA, 1990). U jalovic - příjemkyň embryí neb yl v dostupné literatuře sledován vliv ošetření přípravkem Oestrophan inj. S pofa na plodnost v následných laktacích (MAKOVEC, 1991). 2.1.3 Získávání embryí Základní metoda chirurgi ckého získávání embryí byla popsána ROWSONEM, et al. (1969); způsob odběru je spolehlivý, ale není možné ho provádět v běžn ých chovat elských podmínkách. Chirurgický způsob odběru embryí u krav na stojícím zvířeti popisují LAMPETER (1977), HOLÝ, et al. (1977). Tento způsob odběru lze provést v podmínkách chovu. Chirurgické metod y limitoval y možnost opakování odběrů em bryí. Proto se soustředila pozornost na vypracování vhodných a spolehlivých nechirurgických postupů odběru embryí. Byly vyvinut y úspěšně používané metody kontinuálního výplachu (při použití trojces tného) nebo ve frakcích (při použ ití dvojcestného katetru). Katetr j e v rohu děložním fixován dilatabilním balónkem s 10-20 ml vzduchu, jehož poloha je kontrolována rukou z rekta. K výplachu se používá jednoduché medium, zpravidla P BS vžd y s přídavkem 1 % ultrafiltrovaného telecího séra nebo bovinního sérového albuminu. Teplota vyplachovacího media se udržuje asi na 30 o C (ŘÍHA et al., 1999). 13

2.1.4 Přenos embryí Chirurgický způsob přenosu embryí se provádí buď po celkové narkóze laparotomií v linea alba na ležícím zví řeti (operační postup obdobný jako při získávání popsaném v práci ROWSONA, et al. (1969)) nebo na stojícím zvířeti při paravertebrálním znecitlivění. K nechirurgickému přenosu lze použít skleněné inseminační kapiláry, při dosažení 40 %ní březosti nebo Cas sou - pejet (0,25 ml) a katetru Cassou nebo WÖRRLEIN; s výsledky od negativních do 60 %ní i vyšší - LAWSON et al., 1975. Děloha je v období přenosu náchylná k infekci. Proto musí být technika přenosu aseptická a v mediu by mělo být malé množství antibiotik. V řadě prací zabývajících se nechirurgickým přenosem embryí je podtržena nutnost aseptického, šetrného a rychlého provedení přenosu. Na úspěšnost přenosu má vliv řada faktorů. S ynchronnost cyklu je důležit ý faktor v úspěšnosti přenosů embryí. V literatuře jsou dále diskutovány otázky významu adekvátní výživy a věku příjemkyň, schopnosti pracovníků a umístění embr ya při přenosu a další. 2.1.5 Uchování embryí hlubokým zmrazováním Stále častěji se přistupuje ke zmrazování embryí buď z důvodu obchodu s nimi nebo pro nedostačující počet příj emkyň v podniku. Rizika při zmrazování embryí jsou toxicita kryoprotektiva, poškození chladem, fyzi kální poškození extracelulárním ledem, toxicita koncentrovaných elektrol yt ů, formování a růst intracelulárního ledu. Ve většině případů b ylo zjištěno, že buňky, které přežívají zmrazení a rozmrazení podle kritérií in vitro se jeví jako plně funkční i podle všech ostatních kritérií. Vyskytl y se však případy, kdy zm razením bylo indukováno fyziologické poškození nezpůsobující smrt buněk. Při teplotě -196 o C by měly buňky zůstat živé po dobu až 10000 let, protože jediným zdrojem poškození v tomto stavu je základní ionizační radiace (LOUDA, ČEŘOVSKÝ 1994, ŘÍHA,LANDA, 1986). Nejvhodnějším stadiem pro udržení vysoké přežitelnosti při kryokonzervaci, ať už klasickým zmrazováním nebo vitrifikací je morula a 14

časná blastocysta. Byla sledována vyšší citlivost na kryokonzervaci u in vivo blastocyst nežli morul (MIYAKE et. al.,1993; ZHU et. al.,1993; ISHIMORI et al.,1993). Při kontrolované metodě, která je dnes k dispozici, je možno zmrazovat morul y a blastocyst y s dobrým úspěchem, zatím co expandované blastocyst y získané 8.den po oplození vykazují nízkou přežitelnost (50 %ní - 60 %ní oproti 25 %nímu -30 %nímu zabřezávání). Po rozmrazení vedou embrya ohodnocená jako "velmi dobrá" nebo "dobrá" k vyšš ímu zabřezávání než embrya ohodnocená pouze jako "us pokojivá", tzn. byl y u nich pozorovány větší morfologické odchylky. 2.1.6 Uchování embryí hlubokým zmrazováním Metod y kryokonzervace a dlouhodobého uchovávání embryí mají své pevné místo v praxi týmů pro přenos embryí a zaujímají významné post avení při jednoduchém exportu materiálu. Teoretickými předpoklady a možnost mi metod kryokonzervace se v našich podmínkách zabývali (Ř ÍHA, LANDA, 1987; ŘÍHA et al.; 1988; Ř ÍHA, LANDA, 1989; Ř ÍHA et al., 1991; Ř ÍHA, 1990; Ř ÍHA, 1993, Ř ÍHA, et al., 1999) a v dalších pracech. Vývoj se zaměřil na hledání médií, aditiv a způsobů jejich při dávání, na délku ekvilibrace před zmrazením, na režim zmrazování, seeding, na způsob rozmrazování a v ym ývání kr yoprotektiv (PETELÍKOVÁ, 2004). Ke zm razování jsou vhodná embrya vynikající kvalit y bez nekrotických změn. Zvláštní důraz je kladen na kom paktnost embryí. Vhodná jsou em brya ve stadiích začínající blastocyst y a blastocyst y, optimální stáří embrya je 7 až 8 dní (ŘÍHA et al., 1999). Rizika při zmrazování embr yí jsou toxicita kryoprotektiva, poškození chladem, fyzi kální poškození extracelulárním ledem, toxicita koncentrovaných elektrol ytů, formování a růst intracelulárního ledu, poškození lámáním a osmotické scvrknutí. Kryoprotektiva jsou látky přidávané do zmrazovacího media, které snižují nebo zam ezují poškození buněk při zmrazování a rozmrazování. Jsou 15

známa kryoprot ektiva penetrující (glycerin, dimethylsulfoxid DMSO, propandiol PROH, etanol a jiné alkohol y) a nepenet rující (pol yvinylpyrrol idon, sacharóza, glukóza nebo jiné cukry). Penet rující kryoprotektiva působí ochranně po vniknutí do buňky v multimolární koncentraci (1-4M), čímž je zde značné nebezpečí toxicit y. Nepenetrující kryoprotektiva působí ochranně v extracelulárním prostoru nízkou molární koncentrací (0,01-0,2M) a jsou podstatně m éně toxická (NIEMANN, MEINECKE 1993). Propustnost a toxicita kryoprotektiva je v úzkém vzt ahu k teplotě (ALI, SHELTON, 1993). 2.1.7 Kontrolovaný režim zmrazování a rozmrazování Veškerá manipul ace s embr yi od získání do zmrazování se provádí při teplotě 22 až 24 o C. Embrya jsou před vkládáním do zmrazovacího media uchovávána v kultivačním m ediu, poté se ukládají do zmrazovacího m edia. Ekvilibrační doba se pohybuje kolem 15 minut. Během ekvil ibrační doby se embrya šetrně promývají a plní do označených pejet (ŘÍHA et al., 1999). Po vložení do zmrazovače a zchlazení na teplotu -6 až 7 o C je nezbytné provést seeding (indukce krystalizace a odejmutí skupenského tepla tuhnutí) dot ykem podchlazené pinzet y. U někter ých t ypů zmrazovačů může být seeding vyvolán i automaticky. Doba podržení teploty kolem -7 o C je 5 až 10 minut. Další zchlazování většinou probíhá rychlostí 0,3 o C/min až na teplotu - 30 o C až -40 o C, načež jsou embrya přenesena přímo do tekutého dusíku. Tento postup zmrazování má za následek vytvoření velmi mal ých ledových krystalů, které embryo nepoškozují. Tyto malé krystal y vyžadují r ychlé rozmrazování, ab y se zamezilo rekrystalizaci. Rozmrazování se provádí buď ve vodě o tělesné teplotě nebo na vzduchu při pokojové tepl otě. Po roz mrazení se obsah pejet y přenes e do Petriho misky. R ozmrazená embrya musí být co možná nejryc hleji odstraněna z roztoku s kryoprotektivem. Aby se zabránilo h yperosmolaritě poškozující embryo, musí b ýt odm ývání kryoprotektiva provedeno postupně nebo s 16

přidáním sacharóz y, která díky své molární koncentraci zabraňuje rychlému vstupu vody do embrya (ŘÍHA, 1993; ŘÍHA et al., 1999). 2.1.8 Vitrifikace embryí Vitrifikace embr yí je postup, kdy jsou embrya přenášena přímo do tekutého dusíku bez použití zmrazovače. Během vitrifikace se vytváří v ysoce koncentrovaný roztok, přičemž nedochází ke tvorbě ledových krystalů. Během vystavení embrya vitrifikačnímu roztoku probíhá nejen dehydratace, ale i penetrace kryoprotektiva do buňky. Při vitrifikaci však vzniká nebezpečí toxického působení vitrifikačního roztoku (vysoká koncentrace kryoprotektiv), j ehož působení spolu s ředěním v roztoku s acharóz y snižuje životaschopnost embryí, spí še než vitrifikace samotná (GAJ DA a SMOR AG, 1993, MIYAKE et al., 1993; SMORAG et al.,1990). Důležit ým momentem vitrifikace je rychlost ochlazení a ot eplení. Je nenáročná na technické vybavení, ale je velmi náročná na preciznost při práci, což b ývá někdy v provozní ch podmínkách těžko proveditelné (ŘÍHA et al., 1999). 2.1.9 One-step metoda One-step metoda je modi fikací kontrolovaného zmrazování, popř. vitrifikace a rozmrazování, přičemž jsou vypuštěny vym ývací proces po rozmrazení a následné mikroskopické ohodnocení embrya v laboratoři. Princip je v přidání zmrazovacího a vym ývacího media oddělených vzduchovou bubl inou do pejet y. Po rozmrazení s e třepáním t yto části spolu smísí a po 5 až 10 minutách se pejety umístí přímo do přenosové aparatury a embrya se přenesou. Jako zmrazovací medium se nej častěji používá gl ycerinový roztok, zatímco jako z řeďovací roztok se používá roztok sacharóz y. Tato One-step metoda nabízí značné výhody, pokud jsou embrya dodávána např. do oblastí nebo zemí, kde nejs ou k dispozici dostatečné laboratorní podmínky k odm ývání kr yoprotektiv a ohodnocení embryí po rozmrazení. Metoda one-st ep je stále častěji v yužívána (PETELÍKOVÁ 1996). 17

2.2 Vlivy působící na úspěšnost výplachu 2.2.1 Vliv sezony U doj ených plemen byl y zjištěny některé průkazné vlivy ročního období na počet cyst, žlut ých tělísek a vajíček (P<0,05) a degenerovaných em bryí (P<0,01) - Ř ÍHA (1990). Na základě velmi variabilních v ýsledků z prací KUDLÁČ et al. (1979), SCHILLING et al. (1981), NIBAR T et al. (1979), SAUM ANDE (1977), ŘÍHA et al. (1988), Ř ÍHA (1990) je možné provádět superovulaci, odběr a přenos embryí v průběhu celého roku. Názory na vliv ročního období na úspěšnos t superovul ace se různí a patrně závisí především na úrovni dalších efektů, jako jsou úroveň a kvalita výživy, ošetřovat elská péče a další. PUTNEY et al (1988) uvádí, že embrya by měla být odebírána od dárkyň skotu během chladnějšího období. Tepelný stres působil negat ivně na zís kaná embrya (AL-KATANANI et al., 1999, W OLFENSONEM et al., 2000). Sezónní rozdíl y v plodnosti byl y zaznamenány v tropickém a subtropickém prostředí (BADINGA et al., 1985). PRADHAN (2007) uvádí výsledky, kde celkový počet vajíček a embryí byl ovlivněn ročním obdobím. Celkový počet embryí byl vyšší v zimě než v jiných ročních obdobích. RUTLEDGE et al. (1999) zdůraznil, že produkce embryí u skotu byla nižší v období pozdního léta a během zimy. Celkový počet vajíček a embryí byl nižší v lét ě než na jaře a na podzim, ale žádné významné rozdíl y nebyl y pozorovány. REHMAN et al. (1994) uvádí, že vys oké teploty a vlhkost mají negativní účinky na schopnost zrání ooc ytů. 2.2.2 Vliv výživy Výživa dárkyně může ovlivnit zisk a kvalitu embryí. Těžká podv ýživa ohrožuje vývoj folikulů. Oproti tomu překrmování má negativní účinky, dochází ke změnám, např. zvýšení glukózy. Sacharidy, mastné kyseliny (FA) můžou ovlivnit životaschopnost embrya. Výživa dárkyň by měla být optimální v přísunu živin k uspokojení potřeb- SANTOS (2007). 18

SIDDIQUI (2002) sledoval vliv výživ y a vliv kondičního skóre na výs ledky superovulace u krav. Zjistil, že vyrovnaná výživa a kondiční skóre u zvířat s hodnotami BCS 2.5-3 bylo vhodné pro úspěšnou superovulaci, kráv y s dietou vyšší energetické hodnot y - BCS 4-4.5 m ěl y neuspokojivé výs ledky superovulace a byl u nich potvrzen vyšší výskyt cyst na vaječnících. 2.2.3 Vliv superovulačního přípravku FSH SZABARI et al. (2008) sledovali vliv ošetření FSH na zis k embryí. Sledovali rozdíl y mezi dvěma rozdílnými ošetřeními. V prvními případě byl y dárkyně ošetřeny použitím standardního množství FSH (2,5 m l / dávka), druhé ošetření zahrnovalo dávku (-0,5ml / den, 8,8 mg FSH) vžd y během 4 dnů. Rozdíl y v zisku embryí nebyl y zjištěny významné. Autoři zjistili, že hormonální ošetření má vliv na účinnost ET. MUSTAPHA et al. (2008) ověřovali zisk embryí po ošetření pfsh u původních plemen v Alžíru. Získali průměrně 2,33 přenosuschopných embryí. BOLAND et al. (1991) uvádí, že Folltropin při použití dávek od 10 do 30 m g celkové dávky, vyvolal ovulaci a přijatel né počt y přenosuschopných embryí. Zisk embryí uvádí na nízké úrovni, i když vyhovují cí ve srovnání s vybranými původními plemeny afrického skotu. Pro lepší výsledk y, je nezbytné další s tudium st anovení optimální dávky k použití u místních plemen skotu. SUMRETPRASONG et al. (2008) hodnotili odezvu na dva různé postup y (dávky) Folltropinu V u mléčného skotu. U prvního postupu použili k ošetření - 360 mg (skupina 1, n = 34); u druhého pak snížili dávku na 260 mg (Skupina 2, n = 53); dávky byl y intramuskulárně podány dárci dvakrát denně. Údaje naznačují, že dávky ošetření můžou být sníženy na 260 mg Folltropinu-V, a to bez ovlivnění výnosu embryí. Velmi vysoké dávky FSH způsobují zhoršení ovulace (KANITZ et al., 2002). Vysoké dávky FSH mohou narušit proces ovulace. YAAKUB, et al. (1998) rovněž uvádí, že přebytek gonadotropinu není vhodný pro produkci embryí. Snížená dávka 19

superovulačního přípravku Folltropin-V až na 260 mg minimalizuje náklady při provádění embryo transferu - SUMR ETPRASONG (2008). KELLY et al. (1997) v experimentu porovnávali superovulační odpověď při využití přípravků Folltropin (Vetrepharm), kter ý obsahuje nízké hladiny LH a Pluset (Servet), který má FSH: LH 1:1. Superovulační odpověď byla vyšší při ošetření přípravkem Pluset ve srovnání s Folltropinem. Bylo také získáno více neoplozen ých a degenerovaných embryí (P <0,05). SILVA et al. (2009) ve své práci zjistili neprůkazný vliv na počet a kvalitu embryí (P> 0,05) při využití různých superovulačních prostředků ( (Pluset TM, Super-OV TM, Ovagen TM, FSH-P TM). Produkce embryí nebyla ovlivněna (P> 0,05) druhem ani dávkou při užití různých obchodních značek FSH, které byly použity. PMSG GONZALEZ et al. (1994) sledovali účinky sérového gonadotropinu březích klisen (PMSG) a PMSG antiséra na superovulaci. V experim entu ošetřovali tři skupiny zvířat dávkami 1200 IU, 2400 IU nebo 3600 IU PMSG. Průměrný počet Cl a celkem embryí byl zjištěn u vyšší dávky PMSG. Procento přenosuschopných embryí byl nejnižší při ošetření nejvyšší dávkou (P <0,05). Došli k závěru, že superovulace vyvolaná PMSG a využití antiséra PMSG vyvolá vyšší superovulační odpověď. ELSDEN et al. (1979) zjistili, že vyšší superovulační odpověď byla získána při využití FSH oproti PMSG. Ve spolupráci s VÚBVL Bi opharm prováděl prof. Ing. J. Říha, DrSc. v 90.t ých letech několik experimentů, které směřoval y ke zlepšení úrovně superovulace, snížení pracnosti a stresu ošetřovaných zví řat. Porovnávali lékovou a protrahovanou formu pfsh. Experiment byl zam ěřen na snížení pracnosti a stresovanosti dárkyň embryí. Místo původních os mi aplikací FSH bylo možné použitím vhodného Vehikula snížit počet aplikací na dvě. Vehikulum byl v ývojový preparát testovaný pro ředění Folicotropinu, Spofa; zpomaluje (protrahuje) uvolňování FSH (ŘÍHA et al, 1997). 20

2.2.4 Vliv užitkovosti na kvalitu embryí V současné době se klade důraz na zvýš ení produkce mléka. Nicméně, toto úzce souvisí s poklesem jejich reprodukční schopnosti (ROYAL et al., 1999), a to především u těch krav s více jak 6 000 kg mléka za laktaci. Špatná kvalita oocyt ů a degenerovaná embrya byla zaznamenaná u krav s vysokou produkci mléka a slabé fyzické kondice (YAAKUB et al., 1997). Autoři (BOLAND et al., 2003 ; LOZANO 2000; PRVCE, 1999; WASHBURN, 2002) poukazují na m ožný negativní vliv vysoké produkce mléka na kvalitu embryí a superovulaci u krav a ovcí. NOVOTNÝ F. et al. (2005) zjistili neznatelně vyšší výnos embryí u skupin y krav s nižší produkcí mléka. U skupiny krav s vysokou produkci mléka, došlo k zisku embryí výrazně nižší kvalit y a počtu přenosuschopných embryí a vyššího počtu degenerovaných embryí v porovnání s dárci se střední a nižší produkcí mléka. 2.2.5 Vliv věku Celkový počet vajíček, embryí a přenosuschopných embryí b yl vyšší u 5let ých a starších krav, počet zmrazitelných embr yí byl významně vyšší u 4-5let ých. AX et al (2005) uvádí, že podíl jalovic, které produkoval y přenosuschopná embrya se výrazně neliší, úspěšnost se ale zvyšuje s rostoucím věkem. V této s tudii počet využit ých embryí, přenosuschopných embryí byl vyšší u více než čt yř let ých plemenic, i když významné rozdíl y nebyl y zjištěny. HASLER et al. (1983) uvádí, že počet získaných vajíček kl esl u krav starší ch než 10 let. WALTERS et al. (2002) prokázal, že ve věku prvního otelení krav byla kvalita em bryí nejnižší. SILVA et al. (2009) anal yzovali význam vnitřních a vnější ch faktorů souvisejících s produkcí embryí u krav Nelore (Bos taurus indicus). Studovali v Brazílii výsledky superovulace u krav v rozmezí věku od 2 do 21 let, v šesti chovech. Věk dárkyně negativně ovlivnil počet a kvalitu embryí. Od krav ve věku nad 14 let bylo získáno v průměru o 5,0 ± 0,2 méně embryí celkem a 3,0 ± 0,1 méně embryí k přenosu než od mladých krav (P <0,01). 21

2.2.6 Vliv Cl Rektální vyšetření Cl se využívá pro odhad zisku embryí. Cl hodnotí HASLER et al. (1987) podle následující stupnice: Cl 1. kvality má v průměru u základny 1,5 cm a více se zřetelnou korunkou. Cl 2. kvality má v průměru méně než 1,5 cm a nemá palpovatelnou korunku. Cl 3. kvality bylo cystické, z něhož během palpace byla občas vytlačena tekutina. Koncentrace progesteronu měřené v den implantace b yly v kladné korelaci s velikostí palpovatelného žlutého tělís ka (JASKOWSKI et al., 1994). 2.2.7 Vliv plemene LIBORIUSSEN et al. (1995) uvádí významný vliv plemene. Porovnávali plemena dánské Red & White, Jersey. Zjistili vyšší hodnot y u plemene dánské Red & White. 2.3 Vlivy působící na úspěšnost přenosu BROADBENT et al. (2003) ve své práci uvádí, že existuje mnoho faktorů, které s e podílejí na úspěšnosti embryotransferu. Popisují účinky genot ypu, věku, fyziologického stavu organismu zvířete, zdraví a stresu; t yto vlivy jsou považovány společně s nutri čními faktory a prostředím příjem ce za důležité pro úspěšný přenos embryí. THIBIER, NIBART (1987) uvádí, že některé faktory podíl ející se na správném výběru příjemců byl y již přezkoumávány. První krok vedoucí k úspěšnosti embryotransferu zahrnuje pečlivý výběr jedinců ze stáda. Dále je důležitá fyzická kondice, zdravotní stav a reprodukční znaky jednotlivce. Ve své práci uvádí procento březosti mezi 55 a 70 % u skotu. Přiměřená výživa a odstranění stresu patří mezi důležité faktory při v ýběru příjemkyň. Důležit ým bodem je také diagnóza subklinické endometritid y, která může být obtížné zjistitelná. 2.3.1 Vliv sezony Vliv ročního období na zabřezávání příjem kyň je závisl ý na podmí nkách prostředí ve sledovaném chovu a proto jsou uváděné literární údaje často prot ichůdné. Ř ÍHA (1990) zjistil lepší výsledk y zabřezávání v 22

zimě (69,3%) oproti letnímu období (44,4%), KNEISS L (1990) zjistil nejvyšší zabřezávání v dubnu, květnu, září a listopadu, nejnižší v lednu a únoru, MARŠÁLEK (1989) naopak nejnižší v květnu a červnu. HASLER et al. (1987) neuvádí významnější rozdíl y mezi roky 1980-1986 v kvalitě, vývojové fázi, stáří přenášených embryí nebo v počtu použit ých příjem kyň, objevil y se určité extrém y způsobené nástroj ovým vybavením. Při přenosu in vitro bovinních embryí jalovicím holšt ýnského plemene nebo křížencům s plemenem holšt ýn byl zjištěn význam ný rozdíl mezi procentem březosti po letním přenosu (52%) a po zimním přenosu (21%) (LONERGAN et al., 1995). MARŠÁLEK et al. (1991) neshledali významný vliv sezon y na zabřezávání. 2.3.2 Vliv prostředí Pro dobrou plodnost příjemkyně je v době říje a ET důležit ý stav organismu bez stresu, při nutné manipulaci se nesm í projevi t u zvířete strach a leknutí (RÜSSE 1992). Důležité jsou i tepelné podmínky, příliš nízká teplota způsobuje zvýšené nároky na energii, v ysoká teplota může být příčinou vzniku anestrie a špatné březosti. V období ET by měl y být zachovány standardní podmínky. Pokud jsou jalovice nakupovány z různých míst, měl by být jejich transport proveden minimálně 14 dní před přenos em. Vliv podmínek chovu na úspěšnost přenosu prokázali DONALDSON (1985), Ř ÍHA (1990). Na zhoršování reprodukčních ukazatelů se podílí nízká motivace pracovníků v chovu jalovic a dojnic, jejich nízké společenské ohodnocení a domnělá neperspektivnost jejich činnosti (Ř ÍHA 1996). SILVA et al. (2009) anal yzovali v ýznam vnitřních a vnějších faktorů souvisejících s produkci embryí u krav Nelore (Bos taurus i ndicus). Došli k závěru, že hlavní vliv na úspěšnost měl y podmínk y v zemědělského podniku a věk dárce. 23

2.3.3 Vliv vývojového stadia a kvality embrya Při přenosu embryí výborné kvalit y b yl o dosaženo zabřezávání vyšší než u embryí uspokojivé kvality (DRONIN a BYSTROVA, 1988; HASLER et al., 1995). NIEMANN a MEINECKE (1993) uvádějí u embryí výborné a dobré kvalit y zabřezávání 60-65 %ní oproti embryím horší kvalit y (25-30 %ní). ŘÍHA (1990) uvádí od nejkvalitnějších embryí průkazně nejvyšší zabřezávání (morul y 72%, časné blastocyst y 69,9%, blastocyst y 66,7%). Při přenosu stádií raná a střední blastocysta bylo zjištěno vyšší zabřezávání než při přenosu embryí stádia - morul a, expandovaná blastocysta a klubající se blastocysta (HASLER et al., 1987). I JANOWITZ (1994) prokázal nejvyšší zabřezávání při přenosu stádia - blastocysta, KIM aj. (1992) po přenosu embr yí stadia - expandovaná blastocyst a. MARŠÁLEK et al. (1991) nezjistil průkazný vli v vývojového stadia embrya ani kvalit y embrya na zabřezávání příjemk yň. KNEISS L (1990) na základě vlastních výsledků a literárních údajů konstatuje, že v ýběr embryí po zmrazení může výrazně ovlivnit výsl edky přenosů. MASAHIKO, NISHIGAI (2003) sledovali vliv embryonální vývojové fáze a morfologické kvalit y po rozmrazení na zabřezávání u krav plemene holšt ýn. Významně vyšší (P <0,05) procento březosti bylo zjiš těno po přenosu stádia blastocyst y než po přenosu embr ya stádia kompaktní m orul y. 2.3.4 Vliv věku HASLER (2006) uvádí vyšší březost u jalovic (P <0,001) po přenosu embryí než dojni c, sledování probíhalo u příjemkyň holšt ýnského plemene. WILSON (1999) zjistil březost vyšší u jalovic (73,05%). Krávy ve věku dva a tři roky měly procento březosti nižší - 56,01 a 58,62 %, resp. čtyř a pětileté krávy dosahovaly březosti v hodnotách 66,07 a 68,84 %. Jalovice ve věku 6-9 měsíců jsou ve fázi stabilizace ovariálního cyklu. Po první ovulaci a růstu Cl nastává c ykličnost, která se přibližně po třech cyklech projeví i klinickými příznaky říje. Výraznost těchto příznaků závisí 24

na velikosti vaječníků. Na nástup první ovulace m á větší vl iv živá hmotnost než věk. Plnohodnotná funkčnost pohlavního aparátu jalovic je od 11-12 měsíců věku. Při nálezu mal ých vaječníků s m alou cyklickou aktivit ou u jalovic ve věku 13 až 15 měsíců se zvyšuje počet inseminací nutných pro úspěšné zabřeznutí (KADEČ KOVÁ, 1997). Živá hmotnost jako velmi vlivn ý biologický faktor působí velmi význam ně na nástup první ovulace a na termín prvního možného zapouštění (KOLOMAZNÍK et al., 1991). 25

3. C Í L P R Á C E V současné době odpovídají u nás používané technologické postupy a technika embryot ransferu skotu světovému standardu. Již od počátku přenosu embryí u savců je řešena otázka vlivu organismu příjemkyně na biologickou hodnotu přeneseného embrya. U stále počet ně se snižujících populací krav českého strakatého skotu a holšt ýnského plem ene a u dosud nízkého počtu krav masných plemen v České republice se zvyšuje význam budování MOET - nukleových stád. Přenos embryí se v rámci využívání biotechnologií stává v posledních letech základem šlechtitelského i ekonomického zefektivnění šlechtitelských programů v chovu skotu. Hodně let bylo úspěšně věnováno v rám ci biotechnologie přenosů embryí výzkumu nových postupů, zatímco základní post up superovulace prošel za posledních 20 let jen málo změnami. Největší problém v rámci přenosů embryí a úspěšnos ti této metody je nespolehlivos t superovulační odpovědi na počet získaných embryí a j ejí náročnost. Cílem práce je v yhodnotit různé vlivy působící na kvalitu získaných embryí a výsledky zabřezávání po provedeném embryotransferu ve stádech dojeného skotu. Bude studována kvalita produkovaných embryí před konzervací, vliv y působící na zisk a kvalitu embryí. Dál e budou sledovány faktory věku a plem ene příjemkyň na výs ledky zabřezávání. Součástí sledování bude studium vnějších činitelů ovlivňujících proces zabřezávání. Ověřit nové preparáty využ ívané k superovulaci a inovovat metodické postup y ET s cílem získat stabilních výsledků Hypotéza ET jako biotechnická metoda používaná ve vybraných chovech skotu k urychlení šlechtitelského pokroku stále nedosahuje požadovaných výsl edků v zabřezávání příjemkyň. Konečný výs ledek ovlivňuje řada činitelů vnit řních a vnějších, které se projeví úspěšným nebo neúspěšným zabřeznutím 26

příjemkyně. Průběžné a podrobné studium vybraných vnějších činitelů ovlivňujících biologickou kvalitu dárkyň embryí a příjemkyň, kvalitu embryí, zabřezávání můž e přispět k určení vhodnějších metodických postupů pro provádění ET. Lze předpokládat že výsledky embryotransferu (kvalita a počet embr yí) a následné zabřezávání bude v yšší při zohlednění vlivů působí cích na kvalitu a zabřezávání. 27

4. M AT E R I Á L A M E TO D I K A 4.1. Zisk a kvalita vypláchnutých embryí Bylo hodnoceno celkem 600 výplachů ve 33 chovech od dárkyň sledovaných plem en. Rektální kontrolou byla zjišťována odezva na stimulaci. Prům ěrný věk sledovaných zvířat (dárkyň) byl 4, 35 let. Byl sledován zisk, kvalita embryí a stadia vypláchnut ýc h embryí. Pozdních morul bylo vypláchnuto 38,0 %; velmi časných blastocyt 23,5 %; morul 13 %; časných blastocyt 8,7 %, blastocyst 5,6 %, časných morul 4,7 %. Do pokusu byl y zařazovány plemenice, které byl y v dobrém zdravotním stavu a požadované tělesné kondici. 4.2. Sledované plemenné skupiny Do sledovaného experimentu byl y zařazeny krávy a jalovice dojených plemen. V tab. 1 jsou uvedeny počt y zvířat jednotlivých plem enných skupin, krav a jalovic. Tab. 1 holštýnský skot český strakat ý skot montbeliarde krávy n jalovice n n n n 416 103 81 423 177 a) jako dárkyně embryí byl y použit y krávy, čistokrevné plemenice mléčných plemen: holšt ýnský skot, český strakat ý skot, montbeliarde. b) jako dárkyně embryí byly použity jalovice v období před zařazením do reprodukčního cyklu plemen: holšt ýnský skot, český strakat ý skot, montbeliarde. 28

Výplachy byly prováděny v letech 2006 až 2008. Superovulační ošetření bylo provedeno v průběhu celého roku. 4.3. Metodické postupy hormonálního ošetření superovulace K hormonálnímu ošetření za účelem vyvolání superovulace byly použit y 3 rozdílné postupy tab. 2: Tab. 2 Superovul. ošetření A Superovul. ošetření B Superovul. ošetření C 221 324 55 4.3.1. Superovulační ošetření A Superovulační oš etření - foli kulostimulujícím hypofyzárním hormonem - FSH Folicotropin, Spofa Podrobný popis superovulačního ošetření viz příloha-metodik ad.4.3.1. Superovulační oš etření zahrnovalo: 1) s ynchronizaci pohlavních cyklů jednou aplikací prostaglandinu PGF2alfa (Oestrophan, léčiva Praha). 2) následující říje b yla u dárkyně označena jako 0. den. 3) po kontrole vývoje žlutého tělíska (C L) byl y dárk yně od 9. až 11. dne pohlavního cyklu ošetřeny preparátem folikulostimulují cího hypofyzárního hormonu p-fsh Folicotropin, Spofa Praha po 4 dny ráno a večer. 4) třetí den superovulačního ošetření ráno, tj. spolu s pátou dávkou FSH byl dárkyním aplikován analog prostaglandinu PGF2alfa. 5) pát ý a šest ý den superovulačního ošetření b yl y dárkyně inseminovány. 6) odběr byl proveden 7. den po 1.inseminaci. Tabulka rozpisu ošetření viz část příloha 29

4.3.2. Superovulační postup B Superovulační oš etření - foli kulostimulujícím hypofyzárním hormonem - FSH Pluset, Bioniche Animal Health Superovulační oš etření zahrnovalo: 1) s ynchronizaci pohlavních cyklů jednou aplikací prostaglandinu PGF2alfa (Oestrophan, léčiva Praha). 2) následující říje b yla označena jako 0. den. 3) po kontrole vývoje žlutého tělíska (C L) byl y dárk yně od 9. až 11. dne pohlavního cyklu ošetřeny preparátem folikulostimulují cího hypofyzárního hormonu FSH Pluset po 4 dny ráno a večer. 4) třetí den superovulačního ošetření ráno, tj. spolu s pátou dávkou FSH byl dárkyním aplikován analog prostaglandinu PGF2alfa. 5) pát ý a šest ý den superovulačního ošetření b yl y dárkyně inseminovány. 6) odběr byl proveden 7. den po 1.inseminaci. Tabulka rozpisu ošetření viz část příloha. 4.3.3. Superovulační postup C Superovulační oš etření - folikulostimulujícím hypof yzárním hormonem - Folicotropin -protrahovaná forma pfsh Superovulační oš etření zahrnovalo: 1) s ynchronizaci pohlavních cyklů jednou aplikací prostaglandinu PGF2alfa (Oestrophan, léčiva Praha). 2) následující říje b yla označena jako 0. den 3) po kontrole vývoje žlutého tělíska (C L) byl y dárk yně od 9. až 11. dne pohlavníhocyklu ošetřeny preparátem folikulostimulují cího hypofyzárního hormonu p-fsh. Folicotropin, Spofa Praha rozpuštěném ve vehikulu po 2 dn y ráno. 30

4) třetí den superovulačního oš etření ráno byl dárkyním aplikován analog prostaglandinu PGF2alfa. 5) pátý a šestý den superovulačního ošetření byly dárkyně inseminovány. 6) odběr byl proveden 7. den po 1.inseminaci. Tabulka rozpisu ošetření viz část příloha První experiment y superovulačního ošetření protrahovanou formou Folicotropinu proběhl y v 90. letech ve Výzkumném ústavu pro chov skotu v Rapotíně. Prof. Ing. J. Říha, DrSc ve spolupráci s VÚBL Biopharm provedl experiment y s porovnáním aplikačních schémat pro klasickou lékovou (vodnou) a protrahovanou formu (vehikulární). Tato forma ošet ření byla méně náročná pro zvířata a ekonomicky výhodná. 4.4. Metodický postup výplachu embryí Nechi rurgický odběr embryí byl proveden vždy 7. den po 1. inseminaci (ŘÍHA et al., 1988) výplachem kraniálních částí děložních rohů 300 ml vyplachovacího media, doplněného Krebs-Ringer fosfátu s 1 % inaktivovaného bovinního s éra (BOS, Bioveta Ivanovice na Hané ČR). Byl použit dvoucestn ý foley katetr. Celkem bylo hodnoceno 600 odběrů (výplachů) embryí provedených v průběhu let 2006-2008. 4.5. Metodický postup hodnocení získaných embryí Morfologické hodnocení embryí bylo provedeno pod steromikroskopem se zvětšením od 4x do 100x. Toto zvětšení umožňovalo orient ační posouzení kvalit y embryí a jejich fixaci a manipulaci manipulační kapilárou. Sedm ý den po říji se embrya nacházela ve stadiu kompaktních morul nebo blastocyst. Stádia vývojově méně nebo více pokročilá jsou pro přenos nevhodná (Ř ÍHA, 1996). 31

4.6. Metodické postupy přenosu embryí Získaná embrya byl a po určení stádi a rozdělena na embrya určená k přenosu a ke zmrazení. Zmrazování embryí probíhalo podle metodických postupů (Ř ÍHA, 1993). 4.6.1. Postupy přenosu čerstvých embryí Čerstvá embrya byla přenesena do recipientek - dojené populace. Embr ya byla získána 7. den po provedené inseminaci od dárkyň (krav a jalovic) stimulovaných popsaným režim em FSH (superovulační přípravk y A, B a C). Současně se stimulačním ošetřením dárkyň byl y v chovech s ynchronizovány příjemkyně. Embrya b yla pro transport naplněna do pejet po jednom (kondiciované médium H-MEM D s 20 % fetálního séra). Po transportu byla přenášena do ipsilaterálního děložního rohu k vaječníku s dostatečně vyvinut ým Cl. 4.6.2. Postupy přenos zmrazených embryí Embrya v pejetě byla 7s na vzduchu a poté ponořena do vodní lázně 35 C teplé a mírným kýváním byl y rozpuštěny ledové krys tal y. Odm ývání embryí zahrnovalo 5 min pobyt embryí v komplet ním médiu PM-199 s 6,6 % gl ycerolu a 0,3 M sacharóz ou, 5 min. v médiu M-199 s 3,3 % gl ycerolu a 0,3M sacharózou, 5 min. v m édiu s 0,3M sacharózou. Potom byla embr ya třikrát prom yta v čerstvém kondiciovaném médiu a naplněna pro přenos do dvakrát propláchnut ých pejet. Pohlavní cykl y recipientek (jalovic v období 1. zapušt ění) byl y s ynchronizovány dvěma apl ikacemi PGF2 alfa (Oestrophan, Léčiva Praha) v 11denním intervalu. Přenos byl proveden 7. den pohlavního cyklu do ipsil aterálního děložního rohu k vaječníku s Cl přenosovou aparat urou Wörrl ein. Vyhodnoceno byl o celkem 2938 provedených přenosů v letech 2006 až 2008. 32

4.7. Metodické postupy sledování vlivů na zisk a kvalitu embryí 4.7.1. Sledování vlivu použitého superovulačního postupu na zisk a kvalitu embryí Zpracování této části výsledků bylo zaměřeno na posouzení zisku a kvalit y embryí při použití různých superovulačních preparátů: 1) preparát FSH Follicotropin, Spofa s uperovulační ošetření A ošetřeno 221 zvířat 2) Pluset Bioniche Animal Health superovulační ošetření B ošetřeno 324 zvířat 3) Protrahovaná forma pfsh Follicotropinu superovul ační ošetření C - ošetřeno 55 zvířat 4.7.2. Sledování vlivu velikosti ovárií a počtu Cl na zisk a kvalitu embryí Rektální kontrolou byla sledována velikost a počet žlut ých tělísek (Cl) a následně kvalita a zisk vypláchnut ých embryí. Rektální kontrola byla provedena u 567 zvířat. Technik před provedením v ýplachu určil rektální kontrolou velikost ovárií podle násl edující stupnice: stupeň velikost Cl v cm 1 1,0 cm 2 3,0 cm 3 5,0 cm 4 7,0 cm 5 nad 9,0 cm 1) Podle hodnocení velikosti ovarií byl y dárkyně rozděleny do skupin: 1) do 3,0 cm zařazeno 67 zvířat 2) 5-7 cm zařazeno 263 zvířat 3) nad 9 cm - zařazeno 237 zvířat 2) Podle počtu Cl na ováriích byly dárkyně rozděleny pro hodnocení vlivu do skupin: 33

1) skupina počet zjištěných Cl do 4 na obou ováriích - zařazeno 109 zvířat 2) skupina - počet zjištěných Cl 5,6 na obou ováriích - zařazeno 54 zvířat 3) skupina - počet zjištěných na 7,8 Cl na obou ováriích - zařazeno 65 zvířat 4) skupina počet zjištěných 9,10 na obou ováriích - zařazeno 160 zvířat 5) skupina počet zjištěných nad 10 na obou ováriích - zařazeno 179 zvířat 4.7.3. Sledování vlivu věku na zisk a kvalitu embryí Byla vyhodnocena úroveň stimulace zisku a kval ita embryí od skupin dárkyň krav a jalovic. Z celkově hodnocených stimulací bylo provedeno: 1) 423 výplachů u krav (průměrný věk krav při výplachu 5,37 let); 2) 177 výpl achů u jalovic (průměrný věk jalovic při výplachu 1,47). Dále byl u 386 dárkyň sledován věk, dárkyně byl y rozděleny do 4 skupin podle věku: 1) do 2 let věku - zařazeno 107 zvířat 2) 2-4 roky zařazeno 127 zvířat 3) zvířat 4-6 let zařazeno 77 zvířat 4) nad 6 let věku zařazeno 75 zvířat 4.7.4. Sledování vlivu plemene Byla v yhodnocena úroveň stimulace zisku a kvalita embryí od skupin dárkyň sledovaných plemen: 1) český strakat ý skot - zařazeno 103 zvířat 2) holšt ýnský skot zařazeno 416 zvířat 3) montbeliarde zařazeno 81 zvířat 34