Sbohem, paní Bradfordová

Sbohem, paní Bradfordová aneb IČ spektroskopie ve službách kvantifikace proteinů Mgr. Stanislav Kukla Merck spol. s r. o.

Agenda 1 Zhodnocení současných možností kvantifikace proteinů Bradfordové metoda BCA metoda UV 280 AAA 2 IČ spektroskopie ve službách kvantifikace proteinů Výhody IČ spektroskopie 5 vysoce reálných scénářů Představení systému DirectDetect 2 Presentation title in footer 00 Month 0000

Současný stav kvantifikace proteinů Bradfordové metoda Založena na použití Coomassie Brilliant Blue G250 Barvička se váže především na bazické aminokyseliny (arginin) Posun absorpčního maxima z 465 nm na 595 nm Měřeno v kyvetách nebo mikrotitračních destičkách (na jedno použití) Nutnost standardní série pro každé stanovení BSA není vhodným standardem pro každé stanovení Známou interferencí jsou detergenty 3 Presentation title in footer 00 Month 0000

Současný stav kvantifikace proteinů BCA metoda Dvoustupňová reakce (biuret + chelatace Cu I činidlem BCA) Vzniklá komplexní sloučenina má absorpční maximum 562 nm Redukce Cu II Cu I ovlivněna sekvencí (cystein, tyrosin, tryptofan) Opět se měří v kyvetách/mikrotitr. destičkách, nutnost standardní série Známé interference: Redukční činidla (DTT) Chelatační činidla (EDTA) Fosfolipidy, adrenalin, dopamin, chlorpromazin, penicillin a jiné 4 Presentation title in footer 00 Month 0000

Současný stav kvantifikace proteinů UV 280 nm absorbance Spoléhá na absorpci záření aromatických aminokyselin v primární struktuře Metoda je závislá na znalosti ε 280 Rychlá metoda bez nutnosti kalibrace Interference látky, které absorbují v UV (nukleové kyseliny a jiné) Nelineární pro vyšší koncentrace 5 Presentation title in footer 00 Month 0000

Současný stav kvantifikace proteinů Analýza aminokyselin Obecně uznávaná jako zlatý standard v kvantifikaci proteinů Vzorek je rozložen na jednotlivé AK (6M HCl,0.1% fenol;110 ºC;24hod) Následuje separace (iontoměnič), derivatizace (ninhydrin) a detekce Nejde o rutinní, operativní metodu (core facility) Finančně a časově náročná 6 Presentation title in footer 00 Month 0000

Současný stav kvantifikace proteinů Historické intermezzo 7 Presentation title in footer 00 Month 0000

NOVINKA 2012: DirectDetect 8 Presentation title in footer 00 Month 0000

DirectDetect IČ spektroskopie & kvantifikace proteinů Přístroj měří FT-IR spektrum vzorku naneseného na měřící kartu 9 Presentation title in footer 00 Month 0000

DirectDetect Proč právě IČ? Kvantifikace proteinů je založena na analýze vibračních pásů amidových vazeb vlastní všem peptidům, proteinům Měření není závislé na primární struktuře proteinu Kvantifikace začíná na tripeptidech Lze použít BSA jako univerzální standard 10 Presentation title in footer 00 Month 0000

DirectDetect scénář č. 1 Srovnání IČ vs. UV 11 Presentation title in footer 00 Month 0000

DirectDetect scénář č. 2 SDS ve vzorku 12 Presentation title in footer 00 Month 0000

DirectDetect scénář č. 3 Tween 20 ve vzorku 13 Presentation title in footer 00 Month 0000

DirectDetect scénář č. 4 Redukční činidla ve vzorku 14 Presentation title in footer 00 Month 0000

DirectDetect scénář č. 5 Proteiny v buněčných lyzátech 15 Presentation title in footer 00 Month 0000

DirectDetect Srovnání IČ a AAA AAA DirectDetect 16 Presentation title in footer 00 Month 0000

DirectDetect Software Součástí přístroje je notebook se SW pro analýzu a uchovávání dat 17 Presentation title in footer 00 Month 0000

DirectDetect Software SW umožňuje: Analýzu a uchovávání dat z měření Vytváření vlastních kalibračních křivek Uživatelská prostředí (operátor vs. administrátor) Práci se spektry Export dat 18 Presentation title in footer 00 Month 0000

2

2

3

3

DirectDetect Spotřební materiál karta Vzorek dávkován na membránu z hydrofilního PTFE, ve které je kroužek z hydrofóbního PTFE umožňuje co nejpřesnější fokusaci paprsku spektrofotometru na vzorek Dynamický rozsah měření: 0,2 5 mg/ml Objem vzorku: pouze 2 µl 48 Presentation title in footer 00 Month 0000

DirectDetect Kvantifikace peptidů Weighted material 4,5 Direct Detect 4,0 3,5 water 50%MeOH 1%AcOH Concentration [mg/ml] 3,0 2,5 2,0 1,5 50%DMSO 35%AcCN 0.5%TFA 50%DMSO 1,0 DMSO 0,5 0,0 P1 P2 P3 P4 P5 P6 Peptide 49 Presentation title in footer 00 Month 0000

DirectDetect Karta Tento typ kvantifikace proteinů umožňuje i měření dat zpětně DirectDetect (po 60 hod) Coomassie (po 30 min) BCA (po 30 min) 50 Presentation title in footer 00 Month 0000

DirectDetect Výhody systému Špičková FT-IR technologie Neruší detergenty a redukční činidla Není potřeba znát extinkční koeficient proteinu Vzorky je možné uchovat pro další reanalýzu Potřebuje minimum vzorku k měření Jde o platformu kvantifikace dalších biomakromolekul (lipipy, NK, cukry) Kompaktní přístroj (30 x 22 cm) 51 Presentation title in footer 00 Month 0000

DirectDetect Nabídka Systém zahrnuje: - DirectDetect spektrofotometr - Dell Latitude 2120 notebook - DirectDetect Software - Stojan na notebook - Stojánek na karty - 50 ks karet 52 Presentation title in footer 00 Month 0000

Děkuji za pozornost. Mgr. Stanislav Kukla Merck spol. s r. o. stanislav.kukla@merckgroup.com +420 737 273 961 53 Presentation title in footer 00 Month 0000