Základy biochemie KBC / BC Biosyntéza proteinů Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
snova Charakteristika genetického kódu Prokaryotní biosyntéza proteinů a) Struktura a funkce transferové (přenosové) tra b) Ribosom - nukleoproteinová částice Mechanismus biosyntézy proteinů d) Role proteinových faktorů při proteosyntéze e) Tři vazebná místa pro tra na ribosomech f) Mechanismus translokace g) Terminace proteosyntézy stop kodon Eukaryotní biosyntéza proteinů Antibiotika jako inhibitory proteosyntézy
Genetický kód Genetický kód je vztah mezi sekvencí bází v DA (nebo RA přepisu) a sekvencí aminokyselin v proteinech. Genetický kód byl postulován v roce 1961 F. Crickem a S. Brennerem a dalšími badateli. 1. Tři nukleotidy kódují aminokyselinu. Je dvacet proteinogenních aminokyselin, stačilo by dvacet trojic tripletů kodonů. Kodonů je v genetickém kódu 64. 2. Kodony se nepřekrývají. V sekvenci bází ABCDEF kódují první tři písmena ABC jednu aminokyselinu a druhé tři DEF druhou aminokyselinu. 3. V sekvenci kódu nejsou tečky! 4. Genetický kód je degenerovaný. ěkteré aminokyseliny jsou kódovány více než jedním kódem. Ze čtyř písmen, sestavujeme triplety, kde se mohou písmena opakovat a záleží na pořadí. Dostaneme tak 4 3 možností = 64. Tři triplety kódují zakončení proteosyntézy. a kódování 20 aminokyselin zbývá 61 kodonů. Pouze Trp a Met mají jeden kodon. Aminokyseliny Leu, Arg a Ser mají šest kodonů.
Smysl degenerace genetického kódu Jaký je biologický smysl degenerovaného genetického kódu? Pokud by kód nebyl degenerovaný, pak by dvacet kodonů určovalo dvacet aminokyselin a zbylých 44 by kódovalo ukončení řetězce. Pravděpodobnost mutace ve smyslu terminace řetězce by v takovém případě byla velká ve srovnání s nedegenerovaným kódem. Terminace řetězce obvykle vede k nedokončenému inaktivnímu proteinu, zatímco změna jedné aminokyseliny není tak tragická.
Genetický kód PRVÍ PZICE (5 konec) DRUÁ PZICE TŘETÍ PZICE (3 konec) U C A G U Phe Phe Leu Leu Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Stop Stop Cys Cys Stop Trp U C A G C Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Pro is is Gln Gln Arg Arg Arg Arg U C A G A Ile Ile Ile Met Thr Thr Thr Thr Asn Asn Lys Lys Ser Ser Arg Arg U C A G G Val Val Val Val Ala Ala Ala Ala Asp Asp Glu Glu Gly Gly Gly Gly U C A G
Poznámky k tabulce Genetický kód Tabulka Genetický kód je sestavena v abecedě mra. V tabulce jsou vyznačeny aminokyseliny kódované triplety. apř. kodon 5 AUG 3 určuje Met, kodon CAU určuje is. UAA, UAG a UGA jsou STP neboli terminační signály. AUG je startovací signál proteosyntéza zahajuje methioninem. Kodony, které určují stejné aminokyseliny se nazývají synonyma. apř. CAU a CAC jsou synonyma pro is. Většina synonym se liší pouze bází na třetím místě. Genetický kód je téměř, ale ne absolutně univerzální. dlišnosti se nacházejí u lidské mitochondrie a řasnatých prvoků. Prvoci se liší od ostatních organismů ve čtení UAA a UAG u prvoků určují aminokyseliny, u ostatních STP. Jejich jediným STP signálem je UGA.
Genetický kód, rozdílné kodony lidské mitochondrie: Kodon Standardní kód Kód mitochondrie UGA STP Trp UGG Trp Trp AUA Ile Met AUG Met Met AGA Arg STP AGG Arg STP
Biosyntéza proteinů vyžaduje: Biosyntéza proteinů Translaci (překlad) nukleotidové sekvence do sekvence aminokyselin mra. Aminoacyl-transfer RA synthetasu, která rozpoznává a využívá informace dané genetickým kódem. Ribosomy-ribonukleoproteiny. Ribosom (70S) je složen z malé podjednotky (30S) a velké podjednotky (50S). Další proteinové faktory nutné k syntéze. Prokaryotní syntéza proteinů se liší od eukaryotní hlavně v translaci. Budeme probírat prokaryotní syntézu (je propracovanější a známější) s poznámkami o odlišnosti eukaryotní roteosyntézy.
Struktura a funkce transferové (přenosové) RA tra slouží jako adaptorová molekula vážící se na specifický kodon a nesoucí aktivovanou aminokyselinu ke včlenění do polypeptidového řetězce. První sekvenci bází u tra stanovil po sedmiletém bádání R. olley v roce 1965. Byla to kvasničná alanyl tra. Ukázalo se, že všechny tra mají mnoho společných strukturních znaků. 1. Každá tra je samostatný řetězec mezi 73 až 93 ribonukleotidy (cca 25 kd). 2. tra obsahují mnoho neobvyklých bází asi tak mezi 7 až 15 na molekulu. apř. methylované nebo dimethylované. 3. Asi polovina nukleotidů v tra se páruje za tvorby dvojité helix. Pět skupin bází nevytváří páry. 3 CCA konec - akceptorový stonek. TΨC smyčka (Ψ reprezentuje pseudouridin). Extra raménko obsahuje variabilní počet nukleotidů. DU smyčka obsahuje několik dihydrouracilů. Antikodonová smyčka reaguje s komplementárním kodonem na mra.
Tři z možných neobvyklých bází tra 2 C 3 ribosa ribosa ribosa Dihydrouridin (U 2 ) 5-Methylcytidin Pseudouridin (Ψ)
becná struktura tra 3 AMK-akceptorový konec Fosforylovaný 5 konec 5 P 3 2- A C C DU smyčka TΨC smyčka A U C G U 2 G T Ψ C G Variabilní extra raménko U Antikodonová smyčka
Aminoacyltransfer RA synthetasa 2 Aminoacyl-tRA synthetasy jsou specifické aktivační enzymy. Prvním krokem aktivace aminokyseliny je tvorba aminoacyladenylátu (aminoacyl AMP) z aminokyseliny a ATP. Druhým krokem je je přenos aminoacylskupiny z aminoacyl AMP na příslušnou tra za tvorby aminoacyl tra. Aminokyselina + ATP + tra + 2 aminoacyl-tra + AMP + 2 P i Spotřebuje se ekvivalent dvou molekul ATP. R C C 3 + tra - P C 2 Aminoacyladenylát 2 - P C 2 C C + 3 R Aminoacyl-tRA
Ribosom - nukleoproteinová částice Ribosomy jsou molekulární prostředky (nukleoproteiny) koordinující souhru mezi aktivovanou aminoacyl tra, mra a proteiny vedoucí k syntéze proteinů. Ribosom z E. coli má hmotnost 2 700 kd, průměr asi 200 Å a sedimentační koeficient 70S. Ribosom disociuje na velkou podjednotku (50S) a malou podjednotku (30S). bě podjednotky obsahují mnoho různých proteinů a rra. Ribosomální RA hrají ústřední roli při syntéze proteinů. Proteiny jsou syntetizovány ve směru od konce k C konci. Sekvence aminokyselin v proteinu je překládána z nukleotidové sekvence mra. Směr translace je 5 3. a molekule mra může být překládána řada ribosomů tvoří paralelní polysomy nebo polyribosomy.
Mikrofotografie ribosomu z elektronového mikroskopu. A) Podjednotka 30S, B) Podjednotka 50S a C) Ribosom 70S.
Start biosyntézy proteinů Startovacím signálem je kodon AUG (nebo GUG), kterému předchází na mra několik tzv. iniciačních bází (iniciační region), které se vážou na 3 konec 16S RA (součást 30S). Druhou podmínkou startu proteosyntézy je párování iniciačního kodonu na mra s antikodonem iniciační molekuly tra. Bakteriální syntéza proteinů je iniciována formylmethionyl tra. 2 tra 10 -Formyl- tetrahydrofolát Tetrahydrofolát tra f f tra f + Methionin Synthetasa S C 3 Methionyl-tRA f (Met-tRA f ) Transformylasa S C 3 Met -Formylmethionyl-tRA f (fmet-tra Met f )
Tři vazebná místa pro tra na ribosomech A-aminoacylové, P-peptidylové a E- výstup místa spojují 30S a 50S podjednotky. Druhý konec tra interaguje s podjednotkou 50S. E místom P místom A místom
Vazebná místa pro tra: A aminoacylové, P peptidylové a E exit (výstup) E místom P místom A místom
Mechanismus biosyntézy proteinů - vazba aminoacyl-tra Cyklus začíná s peptidyl-tra v P místě. Aminoacyl-tRA se váže do místa A. Když jsou obě místa obsazena, dochází ke tvorbě nové peptidové vazby. Transferové RA a mra jsou tranlokovány působením elongačního faktoru G (GTP GDP + P). Současně dojde k posunu deacylované tra na místo E, kde volně oddisociuje a cyklus je uzavřen. 50S Tunel E P A E P A 30S Vazba aminoacyl-tra
Tvorba peptidové vazby Tvorba peptidové vazby
Translokace Elongační faktor G GTP GDP + P i Translokace
Disociace deacylované tra Disociace tra
Mechanismus tvorby peptidové vazby nukleofilní adice aminoskupiny na karbonylovou skupinu peptidylové-tra, tvorba peptidové vazby a uvolnění deacylované tra. Ri Ri Ri Ri+1 tra (P místo) 2 Ri+2 + Ri+1 Ō tra Ri+2 + tra + Ri+1 Ri+2 tra (A místo) tra Tetrahedrální meziprodukt tra (P místo)
Role formylace methioninu Dipeptidyl-tRA s volnou aminoskupinou může cyklizovat a odštěpit se z tra. Formylace tomu brání. S C 3 2 R 2 + + R 2 - tra S tra + R 2 S C 3 C 3 tra
Role proteinových faktorů při proteosyntéze Proteinové faktory se podílí na iniciaci, elongaci a terminaci syntézy proteinů. Aby mohla být zahájena syntéza, musí do ribosomu vstoupit formylmethionyl-tra a mra. a tomto procesu se podílí tři iniciační faktory (IF1, IF2 a IF3). Podjednotka 30S tvoří nejdříve komplex s IF1 a IF3. IF2, G protein, váže GTP což vede ke konformačním změnám umožňujícím IF2 se asociovat s formylmethionyl-fra f. Vzniklý komplex se váže na mra v místě iniciačních nukleotidů (Shine- Dalgarnova sekvence) vzniká 30S iniciační komplex. ydroláza GTP vázaného na IF2 při vstupu 50S podjednotky vede k uvolnění iniciačního faktorů vzniká 70S iniciační komplex. Molekula fmet-tra f zaujímá pozici v místě P a komplex je připraven k elongaci. statní místa A a E jsou prázdná. Pozice formylmethionyl-tra f je řízena interakcí kodon antikodon AUG nebo GUG na mra.
Iniciace translace u prokaryot Tvorba 30S iniciačního komplexu. 30S ribosomální podjednotka Iniciační faktory 30S IF1 IF3 IF2(GTP) fmet-tra f + mra fmet IF3 IF2 GTP IF1 5 AUG mra 30S iniciační komplex
Iniciace translace u prokaryot Tvorba 70S iniciačního komplexu. IF2 GTP fmet IF1 5 AUG mra 30S iniciační komplex 50S podjednotka + 2 IF1 + IF2, GDP + P i fmet 5 AUG mra 70S iniciační komplex
Vstup aminoacyl-tra do ribosomu Elongační cyklus. Vstup aminoacyl-tra do prázdného místa A je spojen se 43 kd proteinem zvaným elongačním faktor Tu (EF-Tu), což je G protein. Komplex EF-Tu a aminoacyl-tra Guaninový nukleotid EF-Tu EF-Tu váže aminoacyl-tra ve formě GTP. Když se komplex EF- Tu-aminoacyl-tRA spojí s ribosomem, GTP hydrolyzuje na GDP. Pokud nevstoupí na správný antikodon, k hydrolýze nedojde. Další elongační faktor Ts se váže na EF-Tu komplex a indukuje odštěpení GDP. Aminoacyl-tRA
Translokace tra a mra po tvorbě peptidové vazby Po tvorbě peptidové vazby se musí mra posunou o tři nukleotidy, aby se deacylovaná tra posunula do místa E na 30S a peptidyl-tra se posunula z místa A do místa P na 30S. Výsledkem je, že je další kodon posunut do místa A, kde může vstoupit další aminoacyl-tra. Translokace je zprostředkována elongačním faktorem G (EF-G) nazývaným translokasa. Jedná se o konformační změny způsobené vazbou a posléze hydrolýzou GTP.
Mechanismus translokace Pohyb je způsoben vazbou GTP formy EF-G na EF-Tu vazebné místo na 50S. EF-G GTP GTP
Mechanismus translokace Po hydrolýze vedou konformační změny EF-G k pohybu stonku na místo A na 30S. GTP GDP 2 P i
Terminace proteosyntézy stop kodony Uvolňovací faktory rozpoznávají STP kodony proteiny (RF). Jeden z nich RF1 rozpoznává UAG a UAA. Druhý RF2 rozpoznává UAA a UGA. Třetí faktor RF3, G protein homologní s EF-Tu, zprostředkovává interakce mezi RF1 a RF2 a ribosomem. Uvolňovací faktory využívají taktiku Trojského koně. Ribosom nekatalyzuje tvorbu peptidové vazby - to je chemická reakce. Proto také nedochází k hydrolýze peptidové vazby. Z místa tvorby peptidu je nutné odstraňovat vodu. Struktura prokaryotního uvolňovacího faktoru není známa. Známa je struktura eukaryotního uvolňovacího faktoru. Funkcí uvolňovacího fakturu je vnést do peptidového místa vodu!! Struktura je podobná tra. RF váže ve své struktuře vodu, kterou vnáší do peptidového místa, kde dochází k hydrolýze, k odštěpení polypeptidu.
Struktura ribosomálního uvolňovacího faktoru elixy proteinu napodobují tra.
dštěpení peptidového řetězce vodou vnesenou RF po stop kodonu 2 tra - P 2 2 C 2 C tra - P C 2 + C + 3 C C + 3 PLYPEPTID PLYPEPTID
Eukaryotní syntéza proteinů Zákládní schéma syntézy proteinů u eukaryot je shodné s bakteriální. Ribosomy jsou větší, složeny z 60S velké podjednotky a 40S malé. Složený ribosom je 80S a má hmotnost 4 200 kd. Iniciační tra. Iniciační aminokyselinou je Met. Iniciace - iniciační kodon je AUG. Eukaryota nepoužívají iniciační nukleotidovou sekvenci. U eukaryot je mnohem více iniciačních faktorů než u prokaryot. Prefix eif platí pro eukaryota. Elongace - eukaryotní elongační faktory jsou podobné prokaryotním EF1α EF1βγ. Eukaryotní EF2 zprostředkovává GTP poháněnou translokaci. Terminace je uskutečňována jednoduchým uvolňovacím faktorem erf1, na rozdíl od dvou u prokaryot.
Eukaryotní iniciace translace Iniciace translace začíná nástupem komplexu obsahujícího 40S a Met-tRA na 5 konec (cap) mra. 5 AUG mra Čepička Met Iniciační faktory + GTP + Met-tRA i + 40S podjednotka AUG 40S podjednotka s iniciačními komponenty
Eukaryotní iniciace translace Poháněn hydrolýzou ATP projíždí komplex mra až narazí na první AUG kodon. Met AUG 40S podjednotka s iniciačními kompenenty n ATP n ADP + P i Met AUG
Eukaryotní iniciace translace Poté vstupuje 60S podjednotka za tvorby kompletního ribosomu 80S. Met AUG 60S podjednotka Iniciační faktory Met AUG 80S iniciační komplex
Antibiotika jako inhibitory proteosyntézy Puromycin je analog terminální aminoacyl-adenosin části aminoacyl-tra. Vstupuje do místa A a zabraňuje vstupu aminoacyl-tra (pro- i eukaryota). 2 2 tra P - C 2 C 2 C 3 C C R C 2 C 2 Aminoacyl-tRA Puromycin
Streptomycin silně bázický trisacharid interferuje s vazbou formylmethionyl-tra na ribosomy a brání správné iniciaci. C C 3 C C C 3 C 2 STREPTMYCI
Antibiotika inhibitory syntézy proteinů: Antibiotikum Působení Streptomycin Inhibice iniciace (prokaryota) a jiné aminoglykosidy Tetracyklin Vazba na 30S, inhibice vazby aminoacyl-tra (prokaryota) Chloramfenikol Inhibice peptidyltransferasy 50S (prokaryota) Cykloheximid Inhibice peptidyltransferasy 60S (eukaryota) Erythromycin Vazba na 50S, inhib.translokace (prokaryota) Puromycin Způsobuje předčasnou terminaci, působí jako analog aminoacyl-tra (pro- i eukaryota)
Toxin záškrtu blokuje proteosyntézu u eukaryot Proteinový toxin je produkován baktérií Corynebacterium diphtheriae, která se množí v horních cestách dýchacích infikované osoby. Po vniknutí toxinu do buňky je štěpen na část A, 21kd fragment a část B, 40kd fragment. Fragment A v cytosolu působí na EF2 formou ribosylace. Katalyzuje přenos ADP-ribosy z AD + na modifikovanou aminokyselinu diftamid v elongačním faktoru 2 translokasy. Postranslačně z is vytvořená aminokyselina diftamid. + 3 C - 2 + (C 3 ) 3
Blokování translokace záškrtovým toxinem Fragment A toxinu katalyzuje transfer ADP-ribosy z AD + na diftamid. - - P P 2 2 + (C 3 ) 3 ADP-RIBSA