D. UKLEVÉ KYSELIY ukleové baze V. Mikeš:Úlohy z biochemie. MU Brno 1993. Část 2, rev.verze 2/2009 H 2 H H H H 2 Adenin Guanin H 2 CH 3 H H H H H Thymin Uracil Cytosin ukleosidy H H H H 2 H H H 2 Adenosin Deoxyadenosin CH 3 H H H H H Uridin Deoxythymidin 1
Primární struktura nukleových kyselin -struktura vazby nukleotidů: viz prezentace Metody studia sekvence nukleových kyselin: Enzymy používané k hydrolýze nukleových kyselin (mohou být specifické na DA, RA, nebo bez specifity): -Fosfomonoesterázy - hydrolyzují terminální fosfátovou skupinu -Fosfodiesterázy: hydrolyzují fosfodiesterovou vazbu: exonukleázy (5 - exonukleázy uvolňují 3 P nukleosidy, 3 - exonukleázy uvolňují 5 P nukleosidy) endonukleázy uvolňují oligonukleotidy, jsou obvykle substrátově specifické (deoxyribonukleáza, ribonukleáza) -Polynukleotidkináza: Fosforyluje volnou 5 H skupinu pentózy pomocí ATP 5 5 P 5 P H P 3 3 P 3 3 U C G A fosfomonoesteráza 5 exonukleáza endonukeáza (ribonukleáza) 3 exonukleáza 2
Maxam-Gilbertova metoda sekvenace nukleových kyselin: V. Mikeš:Úlohy z biochemie. MU Brno 1993. Část 2, rev.verze 2/2009 1. značení konce nukleové kyseliny pomocí ATP ( 32 P) 2. Specifická chemická hydrolýza v místě: G: působením DMS za tepla G + A: působením kyseliny a DMS C: působením hydrazinu v prostředí 5 M acl C + T: působením hydrazinu 3. Elektroforéza získaných fragmentů za denaturačních podmínek (rychlost migrace je nepřímo úměrná počtu nukleotidů) 4. Skenování gelů na fosfoimageru (detekce radioaktivity) Dnes již automatické sekvenátory v servisních laboratořích (kapilární elektroforéza s laserem indukovanou fluorescencí) Sekundární struktura DA Základní strukturou DA je dvojitá šroubovice stabilizovaná vodíkovými vazbami mezi A-T a G-C. Základní dvojitá šroubovice (B-DA) obsahuje 10 pb na jednu otáčku a vzdálenost mezi dvěma následujícími pb je 0,34 nm. Méně běžné typy: A-DA šroubovice obsahuje 11 pb/otáčka a vzdálenost mezi sousední bazemi je 0,23 nm. Z-DA šroubovice obsahuje 12 pb/otáčka a vzdálenost mezi sousedními pb je 0,38 nm. 3
Genetický kód mra prokaryot: 1. apište vzorce adeninu, nukleosidu a nukleotidu od něho odvozeného. 2. Roztok obsahující AMP a GMP měl absorbanci A 260 = 0.652 a A 280 = 0.284, vypočítejte koncentraci AMP a GMP v roztoku, jestliže pro AMP je ε při 260 = 15.4 x 10 3 M -1.cm -1, ε při 280 = 2.5 x 10 3 M -1.cm -1. Pro GMP ε při 260= 11.7 x 10 3 M -1.cm -1, ε při 280 = 7.7 x 10 3 M -1.cm -1. 3. apište úplnou strukturu ribodinukleotidu a deoxyribodinukleotidu složeného z A a C. 4. Vypočítejte průměrnou molekulovou hmotnost jednoho nukleotidového zbytku DA a RA, za předpokladu, že baze jsou přítomny v ekvimolárních koncentracích. ezapomeňte na kondenzaci vody při vytvoření esterové vazby! (Molekulové hmotnosti složek: A = 135, G = 151, C = 111, U = 112, T = 126, ribóza 150, kys. fosforečná = 98). 5. Schematické znázornění sekvence RA (zapsáno od volného 3' konce k 5' konci) je následující: UpCpUpApGpAp apište produkty hydrolýzy této RA pomocí následujících enzymů: a) fosfomonoesteráza b) fosfodiesteráza hadího jedu (3 - exonukleáza) c) fosfodiesteráza ze sleziny (5 - exonukleáza) d) ribonukleáza T1 (hydrolýza v místě G, vznik 3 P oligonukleotidu) e) ribonukleáza U2 (hydrolýza v místě A nebo G, vznik 3 P oligonukleotidu) 4
6. ligonukleotid pocházející z DA má následující sekvenci (zapsáno od volného 5' konce k 3' konci): papcptptpapg 5 terminální nukleotid byl označen 32 P. Jaké oligonukleotidy získáme po působení fosfodiesterázy hadího jedu (viz výše). Které z nich budou značeny 32 P? Které oligonukleotidy získáme hydrolýzou pomocí deoxyribonukleázy II a které z nich budou značeny 32 P (deoxyribonukleáza II je endonukleáza uvolňující 3 P oligonukleotidy). 7. ligoribonukleotid X je složen z následujících bazí: 2A, 2C, U, G. a) po působení fosfodiesterázy z hadího jedu se po krátké době uvolní pc. b) hydrolýzou pomocí pankreatické ribonukleázy získánme C, dinukleotid obsahující A a C a dále trinukleotid obsahující A, G a U. (penkreatická ribonukleáza je endonukleáza a působí v místě C a U za vzniku 3 P oligonukleotidů). c) hydrolýzou pomocí ribonukleázy T2 (hydrolýza v místě A za vzniku 3 P oligonukleotidů) získáme pap, dinukleotid obsahující U a C a trinukleotid obsahující A, G a C. Určete sekvenci oligoribonukleotidu 8. Udejte sekvenci oligodesoxyribonukleotidu stanovovanou Maxam-Gilbertovou metodou. a fosfoimageru byl získán následující obraz: start G + A G C + T C 5
9. Při replikaci řetězce DA --AGCGTAG-- byl vytvořen komplementární řetězec. apište jeho sekvenci. Jaká bude sekvence mra vytvořená při transkripci? 10. apište sekvenci komplementární k uvedenému řetězci DA, vyhledejte úseky obsahující palindrom. a/ GATCAA, b/ TGGAAC, c/ GAATTC, d/ ACGCGT, e/ CGGCCG, f/ TACCAT 11. Vypočítejte molekulovou hmotnost jednoho průměrného páru bazí (molekulová hmotnost A = 135, T = 126, G = 151, C = 111, deoxyribóza 134, kys. fosforečná 98. ezapomeňte na odštěpení vody při tvorbě esterové vazby). Jaká je molekulová hmotnost molekuly DA o délce 1 µm v Da a hmotnost v gramech? (vzdálenost mezi dvěma následujícími pb je 0,34 nm, relativní molekulová hmotnost jednoho páru bazí je v průměru 617,5) 12. Jaterní buňka krysy obsahuje 10-11 g DA. Tato DA je rovnoměrně rozdělena do 42 chromosomů buňky. a) Jaká je molekulová hmotnost DA (1 chromosom obsahuje jednu molekulu DA). b) Vypočítejte počet párů bazí DA obsažené v jednom chromosomu a jeho délku (vzdálenost mezi dvěma následujícími pb je 0,34 nm, molekulová hmotnost jednoho páru bazí je v průměru 617,5). 13. Molární složení guaninu + cytosinu v DA určité bakterie je 67,2%. Jaký je poměr mezi purinovými a pyrimidinovými bazemi? Jaké je molární složení v procentech jednotlivých bazí této DA. 14. Při analýze byla zjištěna změna v aminokyselinovém složení bílkoviny, jejíž gen byl mutován. Vyberte z následujících změn ty případy, které jsou výsledkem mutace provedené změnou jedné baze. Phe Leu Lys Ala Ala Thr Phe Lys Ile Leu His Glu Pro Ser 15. DA fága lambda vzniklá deleční mutací má délku 13, 6 µm namísto 16, 49 µm. a) Vypočítejte, kolik pb tomuto mutantovi chybí b) Jaký je rozdíl v molekulové hmostnosti a hmotnosti v gramech obou DA c) Část, u které byla provedena delece odpovídá sekvenci kódující protein P. Jaká je molekulová hmotnost tohoto proteinu. Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny je 140. 16. Směs nukleosidtrifosfátů značených 32 P na γ-fosfátu byla inkubována s RApolymerázou: Po určité době byla zjištěna inkorporace 100 molekul značeného fosfátu do výsledného produktu. Tentýž pokus byl proveden se směsí nukleosidtrifosfátů značených na fosfátu α. Byla zjištěna inkorporace 3.10 4 molekul fosfátu do značeného produktu. 6
Jaký počet řetězců RA byl syntezován a jaká je jejich průměrná délka? 17. Aminokyselinová sekvence C-terminální oblasti bílkoviny a odpovídající kódující sekvence DA jsou následující: Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg TTT GAG ATT CTG GAG CGG CGG Popište mutace, které by mohly vnést do této sekvence restrikční místo TT/CGAA a jiné restrikční místo A/GATCT a to za podmínky, že nedojde ke změně sekvence aminokyselin ve vzniklém peptidu. 18. DA bakteriofága má následující složení bazí: C 19%, A 25%, T 33% a G 23%. a) Co je na této DA neobvyklé a čím se dá její struktura charakterizovat b) Tato DA byla použita jako matrice in vitro při reakci katalyzované DA polymerázou. Jaké bude složení bazí této nově syntezované DA? c) pokud by množství nasyntezované DA bylo stejné jako je množství matrice, jaké je celkové složení bazí (to je DA matrice + DA syntezované in vitro) d) mra syntezovaná jakožto odpověď na infekci fágem má následující složení: C 18%, A 25% U 34% G 23%. Který řetězec DA byl použit pro syntézu RA? 19. Byla provedena syntéza polynukleotidu mra in vitro za použití 90% UTP a 10% CTP. Tyto polymerní molekuly byly poté použity pro syntézu polypeptidu za přítomnosti všech 20 t-ra. Syntezované polypeptidy byly hydrolyzovány a jejich celkové aminokyselinové složení bylo následující: 81% Phe, 1% Pro, 9% Ser, 9% Leu. Vypočítejte frekvenci všech kodonů a zdůvodněte odpovídající aminokyselinové složení polypeptidů. 20. Při pokusu byla enzymově připravena glutaminyl-tra značená na glutaminu. Poté byla tato látka chemicky desaminována za vzniku glutamyl-tra. Tato tra byla přidána do bezbuněčné směsi připravené z E. coli a zbavené mra. Ke směsi byl přidán uměle připravený polymer obsahující ekvimolární koncentraci G a A. Kolik procent glutamátu bude obsahovat syntezovaný polypeptid? 21. Při stanovení primární struktury enzymu bylo zjištěno, že se skládá z 250 aminokyselin. Jaký je minimální počet nukleotidů strukturálního genu tohoto enzymu? Při bodové mutaci tohoto strukturálního genu došlo k náhradě jednoho serinu glutamátem. Tento fakt se projevil ztrátou enzymové aktivity. Co z tohoto faktu lze vyvodit? 7
G. REDXÍ REAKCE Pro redukci látky obecně platí [ox] + e - [red] tento děj charakterizuje redoxní potenciál E (v biochemii definován při ph 7) RT [ox] E = E o + ------ ln --------- nf [red] standardní redox pot. aktuální koncentrace složek Pravidlo: Tabulková hodnota redoxního potenciálu vždy odpovídá směru redukce dané složky. Hodnota redoxního potenciálu pro směr oxidace má opačné znaménko. F = 96500 C.mol -1 R; R = 8,314 J.K -1.mol -1 Reakce mezi dvěma redoxními systémy: (ox) 1 + (red) 2 (red) 1 + (ox) 2 Pokud je systém v rovnováze, platí G = 0 a E 1 = E 2 RT [ox 1 ] RT [ox 2 ] E o 1 + ----- ln -------- = E o 2 + ----- ln -------- nf [red 1 ] nf [red 2 ] RT [ox 2 ][red 1 ] E o 1 - E o 2 = ----- ln --------------- nf [red 2 ][ox 1 ] [ox 2 ][red 1 ] RT K eq = ---------------- => E o 1 - E o 2 = ------- ln K eq [ox 1 ][red 2 ] nf G o = - RT ln K eq G o E o 1 - E o 2 = ------- nf G o = -nf E o 8
Tabulka. Hodnoty standardních redoxpotenciálů některých důležitých redoxních párů při ph 7: oxidovaná/redukovaná forma E o [V] acetát/acetaldehyd -0,580 AD + /ADH -0,320 ADP + /ADPH -0,324 acetaldehyd/ethanol -0,197 pyruvát/laktát -0,185 oxalacetát/malát -0,166 ubichinon/ubihydrochinon +0,100 2cyt b(ox)/2cyt b(red) +0,030 fumaran/jantaran +0,031 2cyt c(ox)/2cyt c(red) +0,235 2cyt a(ox)/2cyt a(red) +0,385 ½ 2 /H 2 +0,816 1. Vypočítejte redoxní potenciál E směsi AD/ADH, je-li koncentrace AD 1 mmol.l -1, ADH 10 mmol.l -1. 2. Srovnáním standardních redox potenciálů určete, zda reakce bude mít tendenci probíhat doleva nebo doprava: malát + AD + oxalacetát + ADH + H + pyruvát + ADH + H + laktát + AD + malát + pyruvát oxalacetát + laktát acetaldehyd + fumarát acetát + jantaran 3. Vypočítejte rovnovážnou konstantu reakce ze standardního redox potenciálu E o (t=25 o C) malát + AD + oxalacetát + ADH + H + 4. Vypočítejte, jaký musí být poměr koncentrací AD/ADH, aby reakce: pyruvát + ADH + H + laktát + AD + byla při 25 o C v rovnováze, je-li poměr koncentrací pyruvát/laktát = 1. 5. Vypočítejte G reakce: jantaran + AD + fumaran + ADH + H + je-li koncentrace AD 10 mmol.l -1, ADH 1 mmol.l -1, jantaranu 10 mmol.l -1, fumaranu 5 mmol.l -1, t=25 o C. 6. Vypočítejte G reakce při 25 o C ADH + H + + UQ UQH 2 + AD + 9
je-li koncentrace AD 100krát vyšší než koncentrace ADH a koncentrace UQH 2 2krát vyšší než koncentrace UQ. E o (UQ/UQH 2 )= +0.104 V, E o (AD + /ADH) = -0,320 V 7. Určete G o reakce: acetaldehyd + fumaran acetát + jantaran E o (acetát/acetaldehyd) = -0,580 V, E o (jantaran/fumaran) = 0,030 V. V jakém směru bude reakce probíhat? 8. Určete G o reakce: cyt c 2+ + cyt a 3+ cyt c 3+ + cyt a 2+ E o (cyt c 3+ / cyt c 2+ )= +0,235 V, E o (cyt a 3+ / cyt a 2+ ) =+0,385 V. V jakém směru bude reakce probíhat? 9. Vypočítejte G o reakce: cyt a(red) + ½ 2 + 2H + cyt a(ox) + H 2 E o (cyt a(ox)/cyt a (red)) = 0,385 V, E o (½ 2 /H 2 )= 0,816 V. Je-li G o syntézy ATP z ADP a P i +30 kj.mol -1, kolik molekul ATP může vzniknout při této reakci za standardních podmínek? 10. Vypočítejte, jaký je poměr koncentrací AD/ADH u ethanolického kvašení v rovnováze, pokud by koncentrace ethanolu byla 5% a koncentrace acetaldehydu 0,5 mmol.l -1. Hustota roztoku alkoholu = 1 g.ml -1. ADH + H + + aldehyd AD + alkohol E o (acetaldehyd/ethanol) = -0,197 V; E o (AD + /ADH) = -0,320 V. 11. Dokažte pomocí výpočtu G o, zda při oxidaci acetaldehydu na acetát je vhodnějším koenzymem AD nebo FAD. Acetaldehyd + oxid. koenzym acetát + red. koenzym Při výpočtu berte v úvahu situaci, kdy poměr reduk. koenzym/oxid. koenzym = 1/100 a koncentrace acetaldehydu a acetátu je ekvimolární. E o (acetát/acetaldehyd) = -0,580 V, E o (AD + /ADH) = -0,320 V, E o (FAD/FADH 2 ) = 0,000 V. 10
H. CITRÁTVÝ CYKLUS 11
1. Srovnejte G o reakcí citrátového cyklu. Které reakce mají tendenci probíhat obráceným směrem a jakým způsobem dochází k posunu reakcí žádoucím směrem? 2. V kterém místě citrátového cyklu dochází k dekarboxylaci : Přeměna: a) citrátu na akonitát, b) isocitrátu na oxoglutarát, c) malátu na oxalacetát, d) oxalsukcinátu na 2-oxoglutarát,e) 2-oxoglutarátu na sukcinyl-coa 3. V kterém místě citrátového cyklu dochází k oxidaci substrátu Přeměna a) sukcinátu na fumarát b) 2-oxoglutarátu na sukcinyl-coa c) fumarátu na malát d) oxalacetátu na citrát e) acetylkoenzym A na citrát 4. apište bilanční rovnici přeměny oxoglutarátu na sukcinát v citrátové, cyklu. 5. Jaké jsou rovnovážné relativní koncentrace isocitrátu, citrátu a cis-akonitátu, je-li G o reakcí následující: 1/ citrát cis-akonitát + H 2 G o =+8.4 kj.mol -1 2/ cis-akonitát + H 2 isocitrát G o =-2.11 kj.mol -1 6. apište bilanční rovnice přeměny těchto látek v Krebsově cyklu do stadia oxalacetátu: a) citrát b) jantaran c) malát apište vzorce uvedených karboxylových kyselin. 7. Jaká je distribuce uhlíku 14 C na oxalacetátu po přidání pyruvátu značeného na a) C1, b) na C2, c) na C3 k enzymům Krebsova cyklu a k pyruvát dekarboxylase? 8. K enzymům Krebsova cyklu byla přidán acetylcoa značený 13 C na methylové skupině. Dokažte, jaká bude distribuce radioaktivity ve vzniklém citrátu a jaká ve vzniklém isocitrátu 9. a základě hodnoty G o vypočtené ze standardních redoxpotenciálů zdůvodněte, proč oxidace jantaranu na fumaran v Krebsově cyklu probíhá za účasti FAD jako koenzymu a nikoliv AD +. jantaran + FAD fumaran + FADH 2 jantaran + AD+ fumaran + ADH + H + E o (FAD/FADH 2 ) = 0,000 V 10. avrhněte hypotetický cyklus analogický Krebsově cyklu, kde by jako počáteční krok byla reakce acetylcoa s oxoglutarátem namísto s oxalacetátem. 12
I. GLYKLÝZA 13
1. apište vzorce: kys. 1,3 bis fosfoglycerové, fosfoenolpyruvátu. K aldolase byl přidán fruktosa 1,6 bis fosfát značený na C2. Jaká bude distribuce radioaktivity ve vzniklé triose? 2. K enzymům anaerobní glykolysy byla přidána kys. 3-fosfoglycerová značená na uhlíku C2. Zvratem anaerobní glykolysy byl z této kyseliny synthezován fruktosa-1,6-bis fosfát. Jaká bude distribuce radioaktivity v tomto fruktosa-1,6 bis fosfátu? 3. Fruktosa 1,6-bisfosfát byl značen fosfátem 32 P na uhlíku číslo 1. Prokažte, zda se tento značený fosfát objeví ve formě ATP, pokud anaerobní glykolýza proběhla do stadia kys. 3-fosfoglycerové. 4. apište bilanční rovnici přeměny glyceraldehyd-3-p na fruktosa-6-p v procesu glukoneogeneze: Glyceraldehyd-3-fosfát + A + B +... fruktosa-6-p + X + Y +... 5. apište bilanční rovnici přeměny fruktosa-6-fosfátu na kys. 3-fosfoglycerovou v procesu anaerobní glykolýzy. Fru-6-P + X + Y +... kys.3-p-glycer. + A + B +... 6. Látka A je produktem anaerobní glykolýzy. Její redukcí ADH vzniká látka B. Transaminací látky A vzniká látka C. apište názvy a vzorce látek A,B,C. 7. apište bilanční rovnici přeměny fruktosy na pyruvát v procesu anaerobní glykolysy za předpokladu: a) fosforylace fruktosy hexokinasou fruktosa + ATP fruktosa-6-p + ADP b) fosforylace fruktosy fruktokinasou fruktosa + ATP fruktosa-1-p + ADP 8.. apište bilanční rovnici přeměny fruktosa-1,6-bisfosfátu na fosfoenolpyruvát při anaerobní glykolýze a) v přítomnosti AD, P i a ADP b) v přítomnosti AD+, ADP, arseničnanu 9. Glukosa byla značena 14 C. Jaká bude distribuce značeného uhlíku v pyruvátu po přeměně značené glukosy v procesu anaerobní glykolýzy. a) v případě značení na C1 b) v případě značení na C6 (izomerace glyceraldehydfosfátu na dihydroxyacetonfosfát je velmi rychlá vzhledem k následujícícmu kroku). 14
10. Jaká bude rovnovážná koncentrace fruktosa-1,6-bisfosfátu, glyceraldehyd-3-fosfátu a dihydroxyacetonfosfátu, jestliže fruktosa-1,6-bisfosfát 1 mmol.l -1 byl inkubován s aldolasou ( G o = + 24 kj.mol -1 ). 11. Zdůvodněte, proč při anaerobní glykolyse musí být glukosa-6-fosfát izomerován na fruktosa-6-fosfát. Vezměte v úvahu reakční mechanismus aldolasové reakce. Proč tato reakce probíhá s fruktosa-1,6-bisfosfátem a nikoliv s glukosa-1,6-bis fosfátem? 12. Glukosa značená 14 C na C1 byla přidána do směsi obsahující enzymy pentosového cyklu. Jaký je osud radioaktivně značeního uhlíku při přeměně na dvě molekuly triosy? 13. K enzymům anaerobní glykolysy byla přidána kys. 3-fosfoglycerová značená na uhlíku karboxylové skupiny. Zvratem anaerobní glykolysy byl z této kyseliny synthezován fruktosa-1,6-bisfosfát. Jaká bude distribuce radioaktivity v tomto fruktosa-1,6-bisfosfátu. 14. a základě velikosti G o odhadněte, které reakce nemohou při glukoneogenesi probíhat zvratem anaerobní glykolysy. Jakým způsobem jsou tyto reakce obcházeny? (Jedna z reakcí probíhá přes nepříznivé G o. dhadněte proč.) 15. Určité bakteriální mutanty mají nefunkční triosafosfát izomerázu. Vysvětlete, proč je tato mutace letální pro organismus fermentující glukosu výlučně cestou anaerobní glykolýzy. 16. Vysoké koncetrace pyruvátu inhibují izoenzym laktátdehydrogenasy srdečního svalu, nikoli však izoenzym ze svalu kosterního. Jaké by byly důsledky tohoto efektu, kdyby srdeční sval obsahoval pouze izoenzym totožný s izoenzymem kosterního svalu. Jaké by byly obrácené důsledky, kdyby kosterní sval obsahoval izoenzym totožný s izoenzymem srdečním? 17. Při glukoneogenezi je termodynamická bariéra tvorby fosfoenolpyruvátu obcházena tvorbou oxalacetátu (koenzym biotin). apište obě dvě rovnice použité k obchvatu pyruvát kinázové reakce a vypočítejte G o souhrnné reakce. (Předpokládejte, že GTP je termodynamicky ekvivalentní ATP). 15
J. RESPIRAČÍ ŘETĚZEC 1. Rozdělte jednotlivé složky respiračního řetězce na jednoelektronové a dvouelektronové přenašeče. apište redoxní rovnice mezi uvedenými partnery a všimněte si, kde vystupuje jako reakční partner H +. ADH - UQ UQH 2 -Cyt c cyt b-cyt c cyt a- 1/2 2 cyt c-cyt a 2. Vypočítejte G o reakce mezi: a) ADH + UQ b) jantaran + UQ c) cyt b(red) + cyt c(ox) d) cyt c(red) + ½ 2 a základě velikosti G o odhadněte, při které reakci je kryta energetická spotřeba vzniku jedné molekuly ATP ( G o =-30 kj.mol -1 ). 3. Vypočítejte G o oxidace ADH kyslíkem v respiračním řetězci. Kolik molů ATP by teoreticky vzniklo za standartních podmínek ( G o = -30 kj.mol -1 ). Jestliže namísto kyslíku 16
použijeme umělého akceptoru hexakyanoželezitanu (E o = +0,360 V), jaká bude změna standardní volné energie reakce a kolik molů ATP vznikne? 4. Doplňte bilanční rovnici přeměny následujících látek v Krebsově cyklu a v respiračním řetězci: jantaran + ADP + ½ 2 fumaran + ATP isocitrát + ADP + ½ 2 jantaran + ATP jantaran + ADP + ½ 2 oxalacetát + ATP 5. Po přídavku inhibitoru respirace antimycinu k systému repiračního řetězce mitochondrií byla zjištěno úplné zredukování ubichinonu, cytochromu b a úplné zoxidování cytochromů c, aa 3. Zakreslete místo zásahu tohoto inhibitoru. 6. Doplňte bilanční rovnici přeměny fumaranu na oxalacetát za spolupráce enzymů Krebsova cyklu a respiračního řetězce: fumaran + ADP +... oxalacetát + ATP +... 2-oxoglutarát + ADP +... fumaran + ATP +... 7. Vypočítejte G o reakce při 25 o C fumaran + ADH + H+ jantaran + AD víte-li, že: E o (AD/ADH) = -0,320 V, E o (fum/jan)= +0,030 V Bylo by možné, aby za standardních podmínek byla tato reakce využita k syntéze ATP? (hydrolýza ATP: G o =-30 kj/mol) Zakreslete úseky respiračního řetězce, které se podílejí na této oxidaci ADH. 17
K. FTSYTÉZA Světelná fáze 18
Souhrnná rovnice: 2 ferred.(red) + ADP + + H + 2 ferred (ox) + ADPH H 2 + ADP + P i + A ox ½ 2 + 2H + + ATP + A red Temnostní fáze (Calvinův cyklus) fixace: C 2 + ribulosa-1,5-bisfosfát + H 2 2 kys. 3-fosfoglycerová redukce: kys.3-fosfoglycerová + ADPH + ATP glycerald.-3-p + ADP + ADP + P i + H 2 0 syntéza hexózy: regenerace: 2P- 3 P- 6 + Pi P- 6 P - 5 + P- 3 P - 4 P- 7 P- 5 + 3 ATP 3 P- 5 -P + 3ADP P - 3 P- 3 P- 5 souhrnná rovnice: 5 P- 3 + 3 ATP 3 P- 5 -P + 3 ADP + 2Pi 1. apište souhrnnou rovnici světelné fáze fotosynthesy ve fotosystému I, fotosystému II a souhrnnou rovnici při propojení obou fotosystémů. Pokuste se napsat souhrnnou rovnici temné fáze fotosynthesy s oxidem uhličitým na jedné straně a s triosofosfátem na straně druhé. Vodu nutnou pro hydrolýzu ATP zanedbejte. 2. Vypočítejte E o a G o reakce mezi redukovaným ferredoxinem a ADP při fotosynthese (E o ferredoxinu = -0,43 V). 19
3. K enzymům temné fáze fotosyntézy (fixace C 2 ) byl přidán ribulosa-1,5-bisfosfát a 14 C 2. Jaká bude distribuce radioaktivity v kyselině 3-fosfoglycerové? Jaká bude distribuce readioktivity v tomtéž případě, pokud byl přidán neznačený C 2 a ribulosa-1,5bisfosfát značený na C5? 4. Srovnejte proces redukce kys. 3-fosfoglycerové na glyceraldehyd-3-fosfát při fotosyntéze a vratný proces oxidace glyceraldehyd-3-fosfátu při anaerobní glykolyse. V čem se oba procesy liší? 5. Fotosystém I má v základním stavu standartní redox potenciál E o = +0,460 V. Po absorpci světelného kvanta se jeho potenciál změní na E o = -0,600 V. Vypočítejte rovnovážný poměr koncentrací ADPH/ADP v reakci: 2 fotosys.i(red) + ADP + H+ 2 fotosys.i (ox) + ADPH s fotosystémem I v základním a excitovaném stavu. Poměr koncentrací oxidovaného a redukovaného fotosystému je roven 1, t = 25 o C. 6. Dokažte výpočtem G, zda redukovaný ferredoxin (E o =-0,430 V) je při fotosyntéze schopen redukovat ADP (E o = -0,324 V), pokud poměr koncentrací ADPH/ADP je při 25 C roven 100. Výchozí poměr redukovaného a oxidovaného ferredoxinu je roven 1. apište rovnici této reakce. 7. Jeden z používaných herbicidů diuron je známým inhibitorem fotosyntézy. Tento inhibitor blokuje syntézu ADPH v chloroplastech, přičemž plastochinon se zcela zredukuje. Zakreslete pravděpodobné místo zásahu. 8. Určité primitivní fotosyntetizující bakterie žijící poblíž podmořských sopek obsahují bakteriochlorofyl a fotosystém II. Produktem této fotosyntézy je síra. Vysvětlete pomocí schématu rovnice. 20
VÝSLEDKY ÚLH D 2. A 260 =[AMP] ε 260 (AMP) + [GMP] ε 260 (GMP) A 280 =[AMP] ε 280 (AMP) + [GMP] ε 280 (GMP) [GMP]=3,07.10-5 mol/l, [AMP]=1,90.10-5 mol/l 4. RA 321, DA 309 5. a/ UpCpUpApGpA b/ Up+ CpUpApGpAp, Up+Cp+UpApGpAp, Up+Cp+Up+ApGpAp atd. c/ UpCpUpApG+pAp, UpCpUpA+pG+pAp, UpCpU+pA+pG+pAp atd. d/ UpCpUpA+pGpAp e/ UpCpU+pA+pG+pAp 6. fosfodiesteráza hadího jedu: 32 papcptptpa+pg, 32 papcptpt+pa+pg, 32 papcpt+pt+pa+pg, 32 papc+pt+pt+pa+pg (poslední dinukleotid nechá nerozštěpený) deoxyribonukleáza II: 32 pap+cptptpapg, 32 papcp+tptpapg, 32 papcptp+tpapg, 32 papcptptp+apg, 32 papcptptpap+g a další 6. a) pc je na volném 3 konci RA b) pankreatická ribonukleáza rozštěpí polynukleotid (psáno od 5 konce k 3 konci) za U a C možnosti: ACAGUC ACGAUC GAUACC AGUACC c) A bude na začátku možnosti: AGCAUC vyřazeno z důvodů b) ACGAUC AGCACU nesplňuje podmínku a) ACGACU nesplňuje podmínku a) řešení:(papcpgpapupc) 8. (-ATAGGCTTAGTACCA-) 9. -TCGCATC-, -UCGCAUC- 10. a/ GATCAA palindrom:gatc CTAGTT CTAG b/ TGGAAC palindrom není ACCTTG c/ GAATTC celé palindrom CTTAAG d/ ACGCGT celé palindrom TGCGCA e/ CGGCCG celé palindrom GCCGGC f/ TACCAT palindrom není ATGGTA 21
11. 617,5; 1,82.10 6 Da, 3,02.10-18 g 12. a) 1,43.10 11 Da b) 2,32.10 8 pb, 0,079 m 13. 67,2% G+C, 32,8% A + T, molární poměr purinových a pyrimidinových bazí je 1:1, molární složení: 33,6 % G, 33,6% C, 16,4% A, 16,4% T 14. Phe Leu, Ala Thr, Ile Leu, Pro Ser- 15. a) 8500 pb b) rozdíl v molekulové hmotnosti je 5,25.10 6 Da, což je 8,72.10-18 g c) 2833 kodonů a tedy aminokyselin, což je 3,97.10 5 Da 16. 100 řetězců, průměrná délka 300 bazí (za předpokladu, že polymerace proběhne v obou pokusech stejně) 17. TTC GAA pro Phe a Glu, TTT GAG ATC TTG GAG CGG CGG nebo TTT GAG ATC TTA GAG CGG CGG 18. a)jednoduchá šroubovice b)g 19%, T 25%, A 33%, C 23% c)g 21%, T 29%, A 29%, C 21% d)nový řetězec DA 19. frekvence kodonů: UUU 0,9.0,9.0,9= 72,9% Phe UUC 0,9.0,9.0,1= 8,1% Phe UCU 8,1% Ser CUU 8,1% Leu UCC 0,9% Ser CUC 0,9% Leu CCU 0,9% Pro CCC 0,1% Pro Po součtu dostáváváme teoretické aminokyselinové složení shodné s experimentálním. 20. frekvence kodonů: GGG 12,5% Gly GAA 12,5% Glu AGA 12,5% Arg AAG 12,5% Lys GGA 12,5% Gly GAG 12,5% Glu AGG 12,5% Arg AAA 12,5% Lys Syntezovaný polypeptid bude obsahovat 25% glutamátu. 21. strukturní gen: 750 nukleotidů (+ iniciační a terminační kodony) serin je v aktivním centru G 1. E=-0,35 V 22
2. doleva, doprava, doleva, doprava 3. Při výpočtu E odečítá od redoxního potenciálu složky, která vystupuje na levé straně rovnice v oxidované podobě, redoxní potenciál složky, která je zde v podobě redukované. +29,7 kj/mol, 6,13.10-6 4. [laktát]/[pyruvát]=1 E 0 = E 0/ LAK- E 0/ AD=-0,185-(-0,32)=0,135V E 0 = (R T/n F) ln([laktát] [AD + ]/[pyruvát] [ADH]) [AD + ]/[ADH]=3,71 10 4 5. E 0 = -0,32-(-0,031)= -0,351V G 0 = 67,7 kj/mol G= G 0 + R T ln ([fumaran] [ADH]/[jantaran] [AD + ])=+60,3 kj/mol 6. E 0 =0,104-(-0,32)= 0,424V G 0 = -81,8 kj/mol G= G 0 + R T ln ([UQH 2 ] [AD + ]/[UQ] [ADH])= -68,7 kj/mol 7. E 0 = 0,03-(-0,58)= 0,61V G 0 = -117,7 kj/mol Reakce probíhá doprava. 8. G 0 = -14,5 kj.mol -1 Reakce probíhá doprava. 9. G 0 = -83 kj.mol-1, 2-3 molekuly ATP 10. [alkohol]=(5/46,0829)/0,1= 1,0854mol/l E 0 =0,123V G 0 = -23,74 kj/mol [AD + ]/[ADH + ]=6,71 11. AD + : E 0 =0,26 V, G 0 = -50,2 kj/mol, G= -61,6 kj/mol FAD: E 0 =0,58 V, G 0 = 111,9 kj/mol, G= 100,5 kj/mol H 1. malát + AD + oxalacetát + ADH + H + citrát isocitrát 2. b,e 3. a,b 4. oxoglutarát + AD + + GDP + P jantaran + C 2 + ADH + H + + GTP 5. K 1 =0,0336397 K 2 =2,3444484 citrát isocitrát, G 0 = 6,29 kj/mol, K=0,0788666 cis-akonitát/citrát=0,0336, isocitrát/cis-akonitát=2,3444, isocitrát/citrát=0,07887 [citrát]=1, [isocitrát]=0,07887, [cis-akonitát]=0,03364, tedy 0,079:1:0,034 6. postupným sčítáním reaktantů a produktů dostaneme bilanční rovnice: 23
a) citrát + 3 AD + + GDP + P + FAD + H 2 oxalacetát + 2C 2 + 3 ADH + 3H + + + GTP + FADH 2 b) jantaran + FAD + H 2 + AD + oxalacetát + FADH 2 + ADH + H + c) malát + AD + oxalacetát + ADH + H + 7. U tohoto typu úloh se uvažuje pouze první průchod cyklem trikarbonových kyselin, v dalších krocích by se značený 14 C objevoval i v jiných pozicích. a) uvolní se jako 14 C 2 b) C1 oxalacetátu c) C2 a C4 oxalacetátu 2. v citrátu na C2 v isocitrátu na C2 a C4 8. reakce s FAD: G 0 =5,98 kj/mol reakce s AD + : G 0 =67,7 kj/mol 10. I 1. C2 obou trios 2. 2,5 3. ne 4. 2 glyceraldehyd-3-p + H 2 fruktosa-6-p + P 5. fruktosa-6-p + 2 P + ADP+ 2 AD + 2 kys.3-p-glycerová + ATP + 2 ADH + 2 H + 1ADH je ekvivalentní 3ATP fruktosa-6-p + 8 P + 7 ADP 2 kys.3-p-glycerová + 7 ATP 6. pyruvát, laktát, alanin 7. a) hexokinasa fruktosa + 2 ATP + 2 AD + + 2 P + 4 ADP 2 pyruvát + 2 ADP + 2 ADH + 2 H + + 4 ATP fruktosa + 8 ADP + 8 P 2 pyruvát + 8 ATP b) fruktokinasa fruktosa + 2 ATP + 2 AD + + 2 P + 4 ADP 2 pyruvát + 2 ADP + 2 ADH + 2 H + + 4 ATP fruktosa + 8 ADP + 8 P 2 pyruvát + 8 ATP 8. a) fruktosa-1,6-bisp + 2 AD + + 2 P + 2 ADP 2 fosfoenolpyruvát + 2 ADH + 2H + + 2 ATP + 2 H 2 b) neproběhne, nevzniká ATP (arseničnan nahrazuje v reakcích fosfát, ale estery s arseničnanem okamžitě hydrolyzují) fruktosa-1,6-bisp + 2 AD + + 2 HAs 4 2- + 2 H 2 2 fosfoenolpyruvát + 2 ADH + 2H + + 2 HAs 4 2- + 2 H 2 9. methylová skupina v obou případech 10. 0,22 GAP a DHAP, 0,78 mm FBF 11. mechanismus aldolové kondenzace 12. odštěpí se jako 14 C 2 24
13. C3, C4 14. i) fruktosa-1,6-bisp + ADP fruktosa-6-p + ATP EPRBÍHÁ( G =+14,2kJ/mol) ve skutečnosti: fruktosa-1,6-bisp + H 2 fruktosa-6-p + P FRUKTSABISFSFATASA ii) glukosa-6-p + ADP glukosa + ATP EPRBÍHÁ( G =16,7kJ/mol) ve skutečnosti: glukosa-6-p + H 2 glukosa + P GLUKSA-6-FSFATASA iii) pyruvát + ATP fosfoenolpyruvát + ADP EPRBÍHÁ ( G = +31kJ/mol) ve skutečnosti: a) fosfoenolpyruvátsynthetasa (bakterie) b) pyruvát + ATP + C 2 oxalacetát + ADP + P oxalacetát + GTP fosfoenolpyruvát + GDP + C 2 Přes nepříznivé G probíhá reakce: fruktosa-1,6-bisp glyceraldehydfosfát + dihydroxyacetonfosfát 15. hromadí se dihydroxyacetonfosfát dle výsledné bilanční rovnice: glukosa + P dihydroxyacetonfosfát + laktát EPRDUKUJE SE EERGIE! 16. LDH srdečního svalu (izoenzym H 4 ) je vhodnější pro oxidaci laktátu na pyruvát. Pokud by se zde uplatnila LDH kosterního svalu, mohl by se v srdečním svalu hromadit laktát. LDH kosterního svalu (izoenzym M 4 ) je lépe uzpůsobena pro oxidaci pyruvátu na laktát, což umožňuje kosternímu svalu pracovat na "kyslíkový dluh". Při nedostatku kyslíku se hromadí ADH vznikající při anaerobní glykolýze a likviduje se redukcí pyruvátu na laktát (únava). Svalové buňky předávají laktát do krve, následně může být v játrech přeměněn na glukosu. 17. I) pyruvát + ATP + C 2 oxalacetát + ADP + P II) oxalacetát + GTP fosfoenolpyruvát + C 2 + GDP Souhrnná reakce: pyruvát + 2 ATP fosfoenolpyruvát + 2 ADP + P [součet: a) pyruvát + ATP fosfoenolpyruvát + ADP ( G = +31kJ/mol) b) ATP = ADP + P ( G = -30,5kJ/mol)] G (celk) = +0,5 kj/mol J 1. jednoelektronové: cyt c, cyt b, cyt a, UQ dvouelektronové: ADH ADH + H + + UQ AD + + UQH 2 UQH 2 + cyt c (ox) UQH + H + + cyt c (red) UQH 2 + 2 cyt c (ox) UQ + 2H + + 2 cyt c (red) cyt c (red) + cyt b (ox) cyt c (ox) + cyt b (red) 2 cyt a (red) + 1/2 2 + 2H + 2 cyt a (ox) + H 2 cyt c (red) + cyt a (ox) cyt c (ox) + cyt a (red) 25
2. Ve vzorci G = -n F E se při výpočtu E odečítá od redoxního potenciálu složky, která vystupuje na levé straně rovnice v oxidované podobě, redoxní potenciál složky, která je zde v podobě redukované. a) ADH + H + + UQ AD + + UQH 2 E 0/ AD+= -0,32V E 0/ UQ= +0,10V G = -n F E = -2 96500 (0,10-(-0,32))= -81,06 kj/mol Kryta energetická spotřeba vzniku dvou ATP. b) jantaran + UQ fumarát + UQH 2 E 0/ fum= 0,031V E 0/ UQ= 0,10V G = -n F E = -2 96500 (0,1-0,031)= -13,317 kj/mol c) 2 cyt b (red) + 2 cyt c (ox) 2 cyt b (ox) + 2 cyt c (red) G = -n F E = -2 96500 (0,235-0,03)= -39,57 kj/mol Kryta energická spotřeba vzniku jednoho ATP. d) 2 cyt c (red) + 1/2 2 + 2H + 2 cyt c (ox) + H 2 G = -n F E = -2 96500 (0,816-0,235)= -112,13 kj/mol Kryta energetická spotřeba vzniku tří ATP. 3. a) ADH + 1/2 2 + H + AD + + H 2 G = -n F E = -2 96500 (0,816-(-0,32))= -219,25 kj/mol Teoreticky by vzniklo 7,3 molů ATP. b) ADH + 2 [Fe(C) 6 ] 3- AD + + H + + 2 [Fe(C) 6 ] 4- G = -n F E = -2 96500 (0,36-(-0,32)= -131,24 kj/mol Teoreticky by vzniklo 4,4 molů ATP. 4. jantaran + 2 ADP + 1/2 2 fumaran + 2 ATP + H 2 + 2P isocitrát + 7 ADP + 7P + 2 jantaran + 2 C 2 + 7 ATP + 2 H 2 jantaran + 5 ADP + 5P + 2 + H 2 oxalacetát + 5 ATP + 2 H 2 5. Antimycin je inhibitorem komplexu III, zasahuje v místě cytochromu bc 1. 6. fumaran + 3 ADP + 3P + 1/2 2 oxalacetát + 3 ATP + H 2 2-oxoglutarát + 6 ADP + 6P + 2 fumaran + 6 ATP + C 2 + H 2 7. G = -n F E = -2 96500 (0,03-(-0,32))= -67,55 kj/mol Tato reakce by mohla být využita k syntéze 2,2 molů ATP. K 1. souhrnná rovnice pro fotosystém I: 2 PSI * (red) + ADP + + H + 2 PSI (ox) + ADPH souhrnná rovnice pro fotosystém II: 4 PSII (ox) + 2 H 2 4 PSII (red) + 2 + 4 H + souhrnná rovnice pro oba fotosystémy: 2 H 2 + 2 ADP + 2 + 2H + + 2 ADPH temná fáze fotosyntézy: 3C 2 + 6ADPH + 6H + + 9ATP glyceradehydfosfát + 6ADP + 9ADP + 8P + 3H 2 26
2. 2 ferredoxin (red) + ADP + H + 2 ferredoxin (ox) + ADPH G = -21 kj/mol E = 0,106 V 3. na C1 v prvním případě, na C3 ve druhém případě 4. lokalizace: chloroplasty (ADPH) X cytoplazma (ADH) 5. 2 fotosystém I (red) + ADP + H + 2 fotosystém I (ox) + ADPH E ADP= -0,324 V základní stav: G = -n F E = -2 96500 (-0,324-0,46) G = 151,312 kj/mol= -R T ln([fot I (ox)] 2 [ADPH]/ [fot I (red)] 2 [ADP]) [ADPH] / [ADP] = 2.995 10-27 excitovaný stav: G = -n F E = -2 96500 (-0,324-(-0,60)) G = -53,268 kj/mol= -R T lnk [fot I (ox)] 2 [ADPH]/ [fot I (red)] 2 [ADP]= 2,175 10 9 [ADPH] / [ADP] = 2,175 10 9 6. 2 ferredoxin (red) + ADP + H + 2 ferredoxin (ox) + ADPH G = -n F E = -2 96500 (-0,324-(-0,43))= -20,46 kj/mol G = G + R T ln ([ferr(ox)] 2 [ADPH]/[ferr(red)] 2 [ADP]) G = -20460 + 8,31 298 ln (100)= -9056 J/mol samovolný průběh poměr v rovnováze: ferr(ox)/ferr(red)= 6,2 Redukovaný ferredoxin je schopen redukovat ADP, dokud se poměr ferr(ox)/ferr(red) nezmění z 1 na 6,2. 7. diuron zasahuje v místě komplexu b 6 f 8. Jedná se o zelené sirné bakterie (rod Chlorobium) patřící mezi obligátně fototrofní organismy. Jsou inhibovány vyšší tenzí 2. rovnice fotosyntézy: 2H 2 S + C 2 {CH 2 } + H 2 + 2S, kde {CH 2 } je např.cukr 27