Chromatografie 1 Úvod Chromatografie je metoda sloužící k separaci a analýze složitých směsí. Chromatografie se velmi široce uplatňuje ve všech vědeckých odvětvích včetně lékařství. V rámci lékařských věd je velmi široká škála chemických (biochemických a dalších) problémů, které jsou řešeny za pomoci některého z mnoha různých typů chromatografických technik. Z tohoto důvodu je nutné mít alespoň základní povědomí o chromatografii. Předkládaný studijní text je velmi zjednodušený, má spíše informativní charakter a jeho cílem je pouze nejzákladnější seznámení s pojmy a principy z oblasti. Podrobný a precisní popis chromatografických technik a principů je zcela mimo rámec tohoto textu. Zájemci o podrobnější znalosti z oblasti mohou získat více informací studiem odborné literatury, návštěvou vybraných webových stránek či konzultací se specialistou. 1.1 Objev Nyní uvedeme historický příklad experimentu, který dal chromatografii její název a současně tento příklad použijeme jako východisko pro vysvětlení základních pojmů, kterými jsou mobilní a stacionární fáze. V roce 1906 provedl ruský botanik, fyziolog a biochemik M. S. Cvet experiment, při kterém rozdělil chlorofyl na jeho složky - chlorofyl a, chlorofyl b a karotenoidy. Experiment spočíval v tom, že petroletherový extrakt chlorofylu nechal v kolonce protékat přes sloupec křemeliny (CaCO 3 ). Chlorofylový extrakt se při průchodu kolonkou rozdělil na jednotlivá barviva obsažená v chlorofylu a na kolonce se tak vytvořily jednotlivé barevné zóny viditelné okem. Cvet tuto metodu pojmenoval ( barvopis, řec. chroma = barva). V uvedeném popisu prvního chromatografického experimentu je důležité si povšimnout, že tento jednoduchý chromatografický systém obsahoval kapalnou a pevnou fázi. Kapalná fáze byla tvořena petroletherem, ve kterém byla rozpuštěna analyzovaná směs (chlorofyl) a pevná fáze byla tvořena křemelinou. Kapalná fáze se v tomto případě pohybovala skrz fázi pevnou. Nyní se dostáváme k definici a k základním pojmům jako je mobilní fáze a stacionární fáze. 1.2 Definice Chromatografie je separační a současně analytická fyzikálně chemická metoda pro separaci a analýzu směsí látek, jejímž základním principem je rozdělování složek směsi mezi mobilní a stacionární fázi. Význam slova separační (metoda) v uvedené definici znamená, že chromatografické metody umožňují vzájemnou separaci látek obsažených ve zkoumané směsi. Výraz analytická (metoda) znamená, že umožňuje kvalitativní a kvantitativní analýzu směsi. Výsledkem separace složek směsi může být i pouze to, že v daném experimentálním uspořádání je možné zjistit, že se zkoumaná směs skládá například ze tří různých látek a nebo naopak, že je tvořena pouze jedinou látkou a jedná se o látku v čistém stavu (např. při kontrole čistoty některých látek). Výsledkem kvalitativní analýzy je zjištění, jaké látky jsou obsažené ve směsi a výsledkem kvantitativní analýzy je zjištění v jaké 1
koncentraci jsou jednotlivé složky ve směsi obsažené. Je zřejmé že pro provedení kvalitativní a kvantitativní analýzy je nutné jednotlivé složky směsi od sebe nejdříve oddělit. Chromatografické analýzy se zpravidla používají pro složité směsi látek, které mají navzájem dosti podobné chemické a fyzikální vlastnosti a které by se jinými metodami kvalitativně a kvantitativně analyzovaly jen velmi obtížně, pokud by to vůbec bylo možné. 1.3 Mobilní fáze Mobilní fáze je ta, která se v chromatografickém systému pohybuje. Mobilní fází může být kapalina nebo plyn. Je-li mobilní fází kapalina, pak takovou chromatografii nazýváme kapalinová, je-li mobilní fází plyn, pak se taková nazývá plynová. 1.4 Stacionární fáze Stacionární fáze je v chromatografickém systému ta fáze, která je nepohyblivá. Stacionární fází může být pevná látka nebo film kapaliny zakotvený na pevné látce. V uvedeném historickém příkladu (viz úvod) byl mobilní fází petrolether, který v sobě obsahoval rozpuštěný chlorofylový extrakt a stacionární fází byl sloupec křemeliny. Rozhodně to ovšem neznamená, že mobilní fáze je vždy kapalina a stacionární fází že je vždy pevná látka. 1.5 Dělení chromatografických metod Chromatografické metody je možno dělit podle různých hledisek jako je například povaha mobilní fáze (kapalina / plyn), způsob provedení (na koloně / plošné uspořádání), princip separace (rozpouštění / adsorpce / iontová výměna) a další. Zde vyjdeme z dělení na základě povahy mobilní fáze. Vzhledem k tomu, že mobilní fází může být plyn nebo kapalina a stacionární fází může být pevná látka nebo film kapaliny zakotvený na povrchu pevné látky, dostáváme následující možné kombinace mobilních a stacionárních fází a od nich odvozené typy chromatografických metod. hlavní typ mobilní fáze stacionární fáze název zkratka anglický název plynová (GC gass chromatography) plyn kapalina pevná látka plynová rozdělovací plynová adsorpční GLC GSC gass-liquid gass-solid kapalinová (LC liquid chromatography) kapalina kapalina kapalinová rozdělovací gelová permeační papírová LLC GPC PC liquid-liquid gelpermeation paper 2
pevná látka tenkovrstvá kapalinová adsorpční iontově výměnná tenkovrstvá TLC * LSC IEC TLC * thin layer liquid-solid ion exchange thin layer * TLC existuje jako rozdělovací (stacionární fází je kapalina zakotvená na pevné látce) i jako adsorpční (stacionární fází je přímo tuhá látka) Z uvedených typů se zde zaměříme na GLC, HPLC, PC a TLC (viz dále). 2 Plynová - GLC Jak již bylo uvedeno výše, plynová rozdělovací (GLC) používá jako mobilní fázi plyn a jako stacionární fázi kapalinu zakotvenou na povrchu pevné látky. Metoda GLC je instrumentální metoda (tzn. používá se přístroj vyrobený přímo pro provádění GLC analýz). Přístroj používaný pro plynovou chromatografii se nazývá plynový chromatograf. Schématický nákres plynového chromatografu Hlavními částmi plynového chromatografu jsou: regulátor průtoku nosného plynu, nástřikový port, separační kolona, termostat, a detektor. Plynový chromatograf je připojen ke zdroji nosného plynu (tlak. láhev) a k zařízení, které je schopné zpracovat signál z detektoru (dnes PC s tiskárnou). Výsledný vytištěný záznam chromatografické analýzy se nazývá chromatogram. 2.1 Nosný plyn a regulátor průtoku 3
Nosný plyn slouží v GLC chromatografii jako transportní médium pro plynnou směs, která je analyzována. Nosný plyn neinteraguje se stacionární fází ani se složkami analyzované směsi na rozdíl od kapalinové, kde dochází k významné interakci mezi mobilní fází a analyzovanou směsí. Jako nosný plyn se používají plyny He, Ar, N 2, H 2, CO 2. Regulátor průtoku slouží pro udržení konstantní průtokové rychlosti (nebo konstantního tlaku) nosného plynu v separační koloně během analýzy. 2.2 Nástřikový port Nástřikový port je místo, které slouží pro vpravení vzorku do plynového chromatografu a do separační kolony. Nástřik se provádí ručně nebo automaticky speciální injekční stříkačkou (typický objem 1 ul). Nastřikovaný vzorek může být kapalný nebo plynný. V případě kapalných vzorků musí mít nástřikový port dostatečně vysokou teplotu aby došlo k okamžitému převedení vzorku do plynného stavu. Plynný vzorek je z nástřikového portu zaveden do proudu nosného plynu, který ho pak transportuje přes kolonu, přičemž dochází k separaci složek analyzované směsi. Pokud je původní vzorek jen velmi málo těkavý a byl by problém s jeho odpařením, pak se provede jeho derivatizace. Typickým příkladem derivatizace je například převedení málo těkavých mastných kyselin chemickou reakcí na methylestery mastných kyselin, které jsou již dobře analyzovatelné plynovým chromatografem. 2.3 Kolona Separační kolona je nejdůležitější součástí plynového chromatografu. Současná GLC používá zpravidla tzv. kapilární kolony a proto bývá označována jako kapilární GLC. Kapilární kolona je tvořena kapilárou z taveného křemene, která je z venku potažena filmem polymeru, který ji chrání před zlomením nebo jiným mechanickým poškozením. Délka kapiláry bývá v rozmezí 10-100 m, ale mohou být kolony kratší i delší. Vnitřní průměr bývá typicky 0,25 mm, ale jsou kapiláry i s odlišným vnitřním průměrem (prakticky 0,1-1,0 mm). Kapilára je umístěna na kruhovém držáku o průměru kolem 15 cm, na kterém je stočena dokola a tento držák s kolonou je upevněn uvnitř chromatografu. Vnitřní stěna kapiláry je v případě GLC pokryta filmem kapaliny, který představuje vlastní stacionární fázi. Zpravidla se jedná o polyethylenglykoly, polypropylenglykoly, polyethylenglykoladipáty, methylpolysiloxany a další. Tloušťka filmu bývá typicky 0,20 nebo 0,25 um. Právě vlastnosti chemické látky která tvoří film (zejména polarita), zcela zásadně rozhodují o tom, jaké směsi je možno na dané koloně rozdělovat na jednotlivé složky. 2.4 Termostat Termostat udržuje konstantní teplotu separační kolony během analýzy nebo teplotu plynule mění podle nastaveného programu. 2.5 Detektor Pro plynovou chromatografii existuje více různých typů detektorů. Volba detektoru závisí na aplikaci a na cíli analýzy. Jednotlivé typy detektorů se liší jak principem funkce a konstrukcí tak i selektivitou, citlivostí, mezí detekce a lineárním dynamickým rozsahem. Selektivitou detektoru se rozumí jeho schopnost reagovat jen na látky určitého typu. Mez detekce představuje nejmenší možné množství látky, které je na pozadí šumu detektoru možné detegovat. Vyjadřuje se zpravidla v gramech dané látky na jeden mililitr nosného plynu (g/ml). Definici citlivosti a lineárního dynamického rozsahu zde vynecháme. Důležitým detektorem, který je dosti univerzální, má dobrou citlivost, dobrou mez detekce (až 10-12 g/ml) a široký lineární dynamický rozsah je v GLC plamenově ionizační detektor 4
(FID, flame ionization detector). Druhým významným typem detektoru je hmotnostní spektrometr, který má nižší (t.j. lepší) mez detekce (až asi 10-13 g/ml) a zejména je možné ho přímo používat pro identifikaci látek na rozdíl od FIDu. 2.6 Popis GLC analýzy Separační kolona uvnitř termostatu je ohřáta na určitou teplotu, vhodnou pro danou analýzu, kterou udržuje nebo programovatelně mění termostat. Do kolony vchází nosný plyn o konstantní průtokové rychlosti. Výstup z kolony je zaveden do příslušného detektoru (FID). Do proudu nosného plynu je přes nástřikový port nastříknut vzorek analyzované směsi (kapalný, plynný). Nosný plyn unáší plynnou směs analyzované látky a nosného plynu skrze kolonu kde nastává její dělení na jednotlivé složky. Principem dělení směsi na složky je v případě GLC rozdílná rozpustnost těchto složek ve stacionární fázi (ve filmu zakotvené kapaliny). Čím je daná složka směsi rozpustnější ve stacionární fázi, tím více je kolonou její průchod zpomalován. Během chromatografické separace se neustále opakuje proces rozpouštění a odpařování složek směsi, takže na výstupu se objeví prakticky všechen analyt, který byl do kolony nastříknut. Jednotlivé složky směsi pak vchází do příslušného detektoru jehož signál je zaznamenáván (počítač) a tisknut v podobě chromatogramu. Hlavními parametry, které ovlivňují kvalitu separace a dobu GLC analýzy jsou teplota kolony a průtoková rychlost nosného plynu. 2.7 Chromatogram V případě GLC je chromatogram tvořen soustavou píků, které mají různou plochu a výšku, mají od sebe různou vzdálenost a v ideálním případě jsou symetrické a mají tvar Gaussovy křivky. Ukázka chromatogramu. Každý pík (č. 1-6) odpovídá jedné složce analyzované směsi. Vodorovná osa znázorňuje čas. Čas, který odpovídá vrcholu píku je tzv. retenční čas, který je na dané koloně a za daných experimentálních podmínek pro každou látku charakteristický. Pokud je zkoumaná směs dobře rozdělena, pak každý pík na chromatogramu odpovídá jedné ze složek směsi. Poloha píku na ose x uváděná pomocí retenčního času (určeno podle polohy vrcholu) určuje o jakou látku se jedná (kvalitativní analýza), plocha píku (nebo jeho výška) určuje koncentraci látky ve směsi (kvantitativní analýza). Identifikace píků (látek) se provede tak, že se na stejné separační koloně za stejných experimentálních podmínek provede analýza předem připravené směsi o známém kvalitativním složení, tzv. standardní směs. Pokud se retenční časy píků na chromatogramu neznámé směsi shodují s retenčními časy píků směsi o známém složení, pak se jedná o stejné látky. Koncentrace látek ve směsi se určuje z ploch nebo výšek píků metodou kalibrace, pro kterou existuje více způsobů provedení. 5
2.8 Příklad analýz pomocí GLC Analýza mastných kyselin v krvi (v podobě jejich methylesterů) Analýza alkoholů, aldehydů a ketonů v krvi (methanol, ethanol, acetaldehyd, aceton, isopropanol a pod.) Separace cis- a trans- izomerů mastných kyselin Analýza alkaloidů, steroidů Dále mnoho aplikací v nejrůznějších průmyslových a vědeckých oborech (viz katalogy výrobců jako jsou Restek, Supelco, Phenomenex a další). 3 Kapalinová - HPLC Mezi metodami kapalinové zaujímá významné místo technika HPLC. Zkratka je odvozena od dvou přípustných názvů této techniky a to high performance liquid chromatography (vysokoúčinná kapalinová ) nebo high pressure liquid chromatography (vysokotlaká kapalinová ). Mobilní fází je v tomto případě kapalina. Stacionární fází je film příslušné látky zakotvený na povrchu nosiče nebo pevný adsorbent. Přístroj, na kterém se provádí HPLC analýzy se nazývá kapalinový chromatograf. Schématický nákres kapalinového chromatografu Kapalinový chromatograf tvoří tyto hlavní části: zásobníky s mobilní fází, vysokotlaká pumpa, dávkovač, kolona a detektor. Metoda HPLC existuje jako tzv. normální a reversní. 3.1 Normální HPLC Při normální HPLC je stacionární fáze polárnější než fáze mobilní. 3.2 Reversní HPLC Při reversní HPLC je naopak stacionární fáze méně polární než fáze mobilní. Reversní HPLC bývá též označovaná jako RP HPLC (reverse phase HPLC). Podotýkáme pouze, že tato 6
HPLC technika je již řadu let používána mnohem častěji než normální HPLC. Dále se budeme věnovat technice RP HPLC. 3.2.1 Mobilní fáze Mobilní fází v RP HPLC může být např. voda, methanol, acetonitril a jejich směsi v různých vzájemných poměrech, pufry a další. Zásobníky jsou skleněné láhve, kterých může být několik s navzájem různými mobilními fázemi, které je možné spolu automaticky mísit v předem zvoleném poměru. Na rozdíl od GLC zde mobilní fáze vstupuje do interakce se složkami analyzované směsi a konkrétní složení mobilní fáze může významným způsobem ovlivňovat celou analýzu (kvalitu separace). 3.2.2 Stacionární fáze Stacionární fáze je tvořena mikročásticemi silikagelu (3-10 um) na kterých je navázána vlastní stacionární fáze. Vlastní stacionární fáze může být tvořena například nepolárními uhlovodíky (C8 oktan, C18 oktadekan), nebo polárnějšími uhlovodíky s funkční skupinou ( např. -CN a pod). 3.2.3 Vysokotlaká pumpa Vysokotlaká bezpulzní pumpa je velmi důležitou součástí HPLC aparatury. Kolony pro HPLC jsou plněny mikročásticemi (viz stacionární fáze), které při průchodu mobilní fáze kladou značný odpor. Z toho důvodu musí být mobilní fáze pod vysokým tlakem (až 40 MPa), aby mohla projít přes kolonu. Dostatečný tlak a konstantní průtok mobilní fáze zajišťuje právě vysokotlaká pumpa. 3.2.4 Dávkování Vzorek je dávkován do proudu mobilní fáze pomocí dávkovací smyčky nebo pomocí automatického dávkovače. 3.2.5 Kolona Zpravidla se jedná o nerezovou trubici o vnitřním průměru okolo 4 mm a délce typicky 5-25 cm, která je naplněna stacionární fází. O schopnosti kolony separovat určité směsi na jednotlivé složky opět rozhoduje zejména typ stacionární fáze zakotvené na silikagelovém nosiči (viz stacionární fáze). 3.2.6 Detektor V metodě HPLC je dostupná opět řada různých detektorů, které se liší principem funkce, konstrukcí, selektivitou, citlivostí, mezí detekce a lineárním dynamickým rozsahem, stejně jako v případě GLC, i když se jedná o jiné typy detektorů. Na rozdíl od GLC zde však není k dispozici tak univerzální detektor, jakým je v GLC detektor FID. Metoda HPLC využívá tyto typy detektorů: spektrofotometrický detektor (UV-VIS), fluorescenční detektor, hmotnostní spektrometr, refraktometrický detektor a další. Volba detektoru opět závisí na konkrétní aplikaci. Často používaným detektorem je detektor spektrofotometrický (UV-VIS) a fluorescenční. Podmínkou použití těchto detektorů je, aby daný analyt absorboval záření určité vlnové délky (UV-VIS detekce) anebo aby emitoval flourescenční záření (fluorescenční detekce). Pokud analyt sám o sobě neabsorbuje záření v oblasti UV-VIS nebo neemituje fluorescenční záření, je použití těchto detektorů podmíněno derivatizací vzorku (vzorek je 7
chemickou reakcí převeden na sloučeniny, které mají potřebné vlastnosti - absorpce UV-VIS, fluorescence). 3.2.7 Popis HPLC analýzy Aparaturou protéká mobilní fáze, která je ze zásobních lahví vedena přes vysokotlakou pumpu do kolony, z ní do detektoru a dále pak do odpadu. Dávkovačem je do proudu mobilní fáze nadávkován vzorek (řádově několik málo ul). Vzorek je unášen mobilní fází do kolony, kde dochází k separaci jednotlivých složek. Výstup z kolony vede do detektoru, kde jsou jednotlivé složky detekovány. Signál z detektoru je zaznamenáván pomocí PC a tisknut v podobě chromatogramu. HPLC analýza je ve srovnání s GLC analýzou mnohem méně citlivá na teplotu kolony a průtokovou rychlost mobilní fáze. Je však citlivá na složení a ph mobilní fáze. Výhodou HPLC je schopnost analyzovat termolabilní látky (např. vitamíny a jiné), které by při použití plynové degradovaly a byly by tak neanalyzovatelné. Analýzy některých směsí a látek je možné provádět jak metodou HPLC tak GC (např. mastné kyseliny). 3.2.8 Chromatogram Výsledkem HPLC analýzy je chromatogram, který vizuálně vypadá stejně jako chromatogram pořízený metodou GLC. Pokud je analyzovaná směs dobře rozdělena, pak každé složce směsi odpovídá jeden pík, stejně jako v metodě GLC. Pro vyhodnocení chromatogramu (kvalitativní a kvantitativní analýza) platí stejné principy jako byly popsány u GLC (shoda retenčních časů, kalibrace). 3.2.9 Příklady analýz HPLC Vitamíny rozpustné ve vodě / v tucích, kortikoidy, kortikosteroidy, antidepresiva, karbonylové sloučeniny (environmentální analýzy), třaskaviny, výbušniny a pod. 4 Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) a papírová (PC) Chromatografie na tenké vrstvě (TLC, thin layer chromatography) může být typu kapalinakapalina nebo kapalina-tuhá látka. V obou případech je mobilní fází kapalina. Stacionární fází je v případě TLC buď kapalina zakotvená v tenké vrstvě na podložním materiálu nebo pevná látka (adsorbent) v podobě tenké vrstvy. V papírové chromatografii je mobilní fází kapalina. Stacionární fází je v PC také kapalina, která je ovšem zakotvena v chromatografickém papíru. Používanými mobilními fázemi jsou například: cyklohexan, isopropanol, aceton, voda, toluen a pod. Stacionárními fázemi mohou být: silikagel, oxid hlinitý, iontoměniče a pod. Jako podložní materiál se pro stacionární fáze používají skleněné desky nebo hliníkové fólie. 4.1 Popis TLC a PC analýzy Analýza TLC a PC se provádí stejným způsobem. Na tenkou vrstvu nebo chromatografický papír se na startovní místo nanese kapka analyzované směsi. Tenká vrstva (papír) se jedním koncem ponoří do mobilní fáze, tak, aby startovní pozice kapek analytu zůstaly nad hladinou mobilní fáze. Mobilní fáze vzlíná tenkou vrstvou přičemž dochází k transportu a dělení analyzované směsi. Analýza se ukončuje, když čelo mobilní fáze dorazí do blízkosti protilehlého konce tenké vrstvy (papíru). Čelo mobilní fáze je označeno a tenká vrstva (papír) 8
je vysušena. Vysušená vrstva, na které jsou patrné skvrny jednotlivých složek směsi v různé vzdálenosti od startu představuje chromatogram této metody. 4.2 Chromatogram Chromatogram je i v případě této metody možno vyhodnocovat kvalitativně a kvantitativně. Kvalitativní vyhodnocení (o jakou látku se jedná) se provádí tak, že se současně s analyzovanou směsí o neznámém složení analyzuje na téže tenké vrstvě předem připravená směs o známém složení (standard), který je nanesen na startovní pozici vedle neznámé směsi. Pokud se na chromatogramu shodují vzdálenosti jednotlivých složek od startu v neznámé směsi a ve směsi známé, pak se jedná o tytéž látky. Kvantitativní vyhodnocení se provádí pomocí denzitometru nebo extrakcí z chromatogramu. Denzitometr je přístroj, který zjednodušeně řečeno, dokáže změřit intenzitu zabarvení skvrn na chromatogramu a z intenzity vypočítat koncentraci látky. Při extrakční metodě jsou jednotlivé skvrny látek extrahovány z chromatogramu do vhodného rozpouštědla a jejich koncentrace v rozpouštědle je pak určena vhodnou metodou. 4.3 Příklady TLC a PC analýz Analýza aminokyselin, barbiturátů, pesticidů, steroidních hormonů atd. Odkazy (ke dni 15.9. 2004) Zejména http://gill.tamug.tamu.edu/mars450/handouts.htm http://www.shu.ac.uk/schools/sci/chem/tutorials/chrom/chrom1.htm http://faf.vfu.cz/fytochem/hplc_gc.pdf http://www.natur.cuni.cz/~pcoufal/ http://www.natur.cuni.cz/~pcoufal/tlcpc.html http://www.natur.cuni.cz/~suchan/ http://www.bf.jcu.cz/tix/sima/analyticka_chemie/separ_met_i.htm Dále http://www.lf3.cuni.cz/ustavy/chemie/handoutcz/hplc.htm http://www.mzcr.cz/data/c764/lib/boajame.htm http://www.iupac.org/reports/1997/6907smith/6907smith.pdf http://www.vscht.cz/kch/kestazeni/smch.pdf 9