ÚSTAV LÉKAŘSKÉ BIOCHEMIE 1. LF UK Enzymy Praktické cvičení z lékařské biochemie Všeobecné lékařství Jiří Kraml a Jiřina Crkovská 2010/2011
V tomto cvičení bude prokazována bílkovinná povaha enzymů na příkladu sacharasy (invertasy) z kvasnic, specifičnosti vůči typu glykosidové vazby na příkladu sacharasy z kvasnic a amylasy. Z fyzikálně-chemických vlivů působících na aktivitu enzymů bude ukázán vliv ph na aktivitu pepsinu. Na příkladu laktátdehydrogenasy (EC 1.1.1.27). bude demonstrována závislost rychlosti na výchozí koncentraci substrátu (při neměnné koncentraci enzymového preparátu), kde bude ukázán také vztah K m a maximální rychlosti V. Dále bude ukázáno působení peroxidasy z brambor, kde donorem elektronů bude derivát benzidinu (4,4 -diaminobifenylu), který se oxiduje na oxidovaný barevný produkt (modrý). 1. Důkaz bílkovin v preparátu sacharasy V pokuse bude použito preparátu sacharasy z kvasnic. Tento enzym, kterého se bude používat také v úloze 2, štěpí glykosidovou vazbu mezi glukosou a fruktosou v sacharose. Jde o smíšenou vazbu α- (které se účastní 1. uhlík glukopyranosy) i β- (které se účastní 2. uhlík fruktofuranosy). Sacharasa z kvasnic (invertasa) je zaměřena na β-glykosidovou vazbu (jde o β-fruktofuranosidasu, její systematický název je β-d-fruktofuranosid-fruktohydrolasa, EC 3.2.1.26). Tím se liší od sacharasové aktivity tenkého střeva savců, která patří mezi α-glykosidasy. Pokus má demonstrovat přítomnost bílkoviny v enzymovém preparátu biuretovou reakcí a srážením. Reagencie: 1) roztok sacharasy 2) NaOH 80 g/l 3) Fehling I: CuSO 4. 5 H 2 O 70 g/l 4) kyselina sulfosalicylová 200 g/l a. Proveďte s roztokem sacharasy biuretovou reakci k cca 1 ml roztoku sacharasy přidejte 2 ml NaOH a po kapkách přidávejte silně zředěný roztok CuSO 4 (Fehling I zřeďte alespoň 10x). b. Proveďte s roztokem sacharasy srážecí reakci s kyselinou sulfosalicylovou. 2. Důkaz specifičnosti enzymů Enzymy působí specificky jak vzhledem k typu katalyzované reakce, tak vzhledem k substrátu. Pokud jde o substrát, mají některé enzymy poměrně širokou specifičnost, např. 2
různé esterasy, štěpící přirozené i umělé estery, jindy specifičnost velice úzkou, jako např. ureasa, která štěpí pouze močovinu. Glykosidasy patří mezi hydrolasy (podpodtřída 3.2.1 mezinárodní nomenklatury enzymů). Jsou specifické vůči typu glykosidové vazby (α-glykosidasy nebo β-glykosidasy). Sacharasa z kvasnic, jak již bylo uvedeno, je β-fruktofuranosidasa a štěpí β- glykosidovou vazbu v sacharose. Tím se liší od sacharasy z kartáčového lemu enterocytů tenkého střeva savců, sacharosa-α- D-glukohydrolasy (EC 3.2.1.48), která štěpí sacharosu a maltosu a je specifická vůči α- glykosidové vazbě. Amylasa, ať už rostlinného nebo živočišného původu, štěpí 1,4-α-glykosidové vazby škrobu, glykogenu a polysacharidů. Neštěpí tedy β-glykosidové vazby, např. v celulose. Jako α-amylasa se označuje enzym, který se vyskytuje ve slinách a pankreatické šťávě živočichů. Štěpí endohydrolysou 1,4-α-glukosidové vazby polysacharidů obsahujících 3 a více 1,4-α-glykosidově vázaných glukosových jednotek. Jde tedy o 1,4-α-D-glukanglukanohydrolasu (EC 3.2.1.1). Výsledkem hydrolytického štěpení amylosy je směs maltosy a glukosy s hemiacetalovými hydroxyly uvolněnými jako α-anomery. Amylopektin a glykogen jsou štěpeny náhodně na 1,4-α-glykosidových vazbách, přičemž 1,6-α- vazby zůstávají nedotčeny, a tak vznikají jako výsledné produkty větvené i nevětvené oligosacharidy. Enzymová hydrolýza škrobu tedy prochází různými stadii, která se projeví také reakcí s jodem. Škrob se barví jodem temně modře, štěpné polysacharidy - dextriny fialově (amylodextrin), purpurově až červeně (erytrodextrin), popř. se nebarví jodem vůbec (achrodextrin). Současně přibývá redukujících cukrů ve směsi. Jako β-amylasa se označoval enzym rostlinného původu, obsažený např. ve sladu, který štěpí 1,4-α-glukosidové vazby od neredukujícího konce polysacharidového řetězce. Z amylosy tak vzniká prakticky kvantitativně maltosa, uvolňovaná jako anomer β, dochází tedy k inverzi. Tento enzym, označovaný nyní systematicky jako α1,4-α-d-glukanmaltohydrolasa (EC 3.2.1.2), štěpí amylopektin (a glykogen) rovněž z neredukujícího konce až k větvení 1,6-α-, které enzym štěpit nemůže. Dextrin, vzniklý takovou enzymovou hydrolýzou amylopektinu, se označuje jako limitní dextrin (limit-dextrin). Ani živočišná α- amylasa, ani rostlinná β-amylasa tedy neštěpí vazby 1,6-α-, a rovněž neštěpí 1, 4-βglykosidovou vazbu. Jako tzv. γ-amylasa (glukoamylasa) se označuje enzym obsažený v membráně enterocytů tenkého střeva. Je termostabilní (termostabilní maltasa) a štěpí polysacharidy a ještě lépe maltosu od neredukujícího konce na vazbách 1,4-α, přičemž uvolňuje β-glukosu. (Označuje se jako 1,4-α-D-glukosid-glukohydrolasa, EC 3.2.1.20). Zdá se, že γ-amylasa má i velmi slabou specifičnost vůči vazbám 1,6-α- v isomaltose a v amylopektinu a glykogenu, tyto vazby jsou však v oligosacharidech, které vznikly v tenkém střevě předchozím trávením škrobu a glykogenu α-amylasou, štěpeny převážně isomaltasovou podjednotkou sacharasového-isomaltasového komplexu kartáčového lemu, oligosacharid-α-glukohydrolasou, EC 3.2.1.10 (oligo-1,6-glukosidasa). Sacharasový-isomaltasový komplex kartáčového lemu je syntezován původně jako jediný polypeptidový řetězec, podjednotky vznikají teprve sekundárně proteolytickým naštěpením z lumen tenkého střeva, mají vysoký stupeň homologie primární struktury.gen prekurzorové pro-sacharasy-isomaltasy vznikl zřejmě duplikací ancestrálního genu. Obě podjednotky štěpí maltosu (reprezentují asi 80 % veškeré maltasové aktivity tenkého střeva), sacharasová podjednotka je navíc specifická pro sacharosu a isomaltasová pro vazby 1,6-α- (isomaltosa, dextriny). Specifičnost sacharasy z kvasnic a slinné amylasy bude demonstrována v naší úloze na substrátech sacharose a škrobu. 3
Reagencie: 1) škrobový maz 10 g/l (1 g škrobu třepat nebo zahřívat s vodou, suspenzi lít pomalu do 100 ml vroucí vody, povařit 2-3 min) 2) sacharosa 10 g/l (roztok denně čerstvý) 3) sacharasa 4) α-amylasa: sliny zředěné v poměru 1 : 10 (denně čerstvý roztok) 5) Fehling I: CuSO 4. 5 H 2 O 70 g/l 6) Fehling II: NaOH 250 g a vinan draselno-sodný 350 g v 1 l deionizované vody 7) Lugolův roztok I 2 20g a Kiv 1 l deionizované vody a. Připravte reakční směsi do 4 zkumavek podle tohoto schématu: 1 2 3 4 škrob 10 g/l 5 ml - 5ml - sacharosa 10 g/l - 5 ml - 5ml amylasa 1 ml 1 ml - - sacharasa - - 1 ml 1 ml b. Všechny zkumavky inkubujte 30 minut v termobloku při 37 C. c. Určete, kde proběhlo štěpení substrátu, redukční zkouškou s Fehlingovým činidlem a označte specifický enzym pro každý substrát. Zároveň proveďte slepou zkoušku, zda Fehlingův roztok není redukován roztokem škrobu a sacharosy. d. Ve zkumavce, kde je škrob jako substrát, se přesvědčte také o štěpení zkouškou s Lugolovým roztokem (silně zředit: cca 4 kapky/10 ml vody). Vyhodnocení: Výsledky štěpení uveďte do tabulky v protokolu symboly + (substrát rozštěpen) a (substrát se neštěpí). 3. Vliv ph na aktivitu enzymů Vliv ph bude demonstrován na příkladu pepsinu. Jsou různé formy aktivního pepsinu, které se poněkud druhově liší a které jsou také různě označovány. Všechny patří do podpodtřídy aspartátových endopeptidas (EC 3.4.23), tj. mají dva proti sobě orientované zbytky kyseliny asparagové ve svém aktivním centru, podílející se na acidobazické katalýze, a mají kyselé ph optimum. Dalšími příbuznými vlastnostmi vytvářejí tzv. peptidasovou rodinu A1 (EC 3.4.23.1, EC 3.4.23.2, EC 3.4.23.3). Původně udávaným vlastnostem lidského pepsinu odpovídá enzym charakterizovaný u vepřů jako pepsin A (EC 3.4.23.1), který se tvoří v kyselém prostředí v žaludečním lumen limitovanou proteolýzou z neaktivního prekurzoru - pepsinogenu A, produktu hlavních (zymogenních) buněk žaludeční sliznice především ve fundu, a to intramolekulární reakcí (autoaktivací) při ph nižším než 5, nebo aktivním pepsinem (autokatalýza). Při ph vyšším než 2 uvolněné peptidy zůstávají navázány 4
na pepsin a působí jako inhibitory pepsinové aktivity. Tato inhibice je odstraněna poklesem ph pod hodnotu 2. Lidský pepsin A má 5 molekulárních forem. Je to hlavní pepsin v žaludeční šťávě obratlovců a jeho specifičnost je zaměřena na hydrofobní (Leu), přednostně aromatické (Phe) aminokyselinové zbytky před a za štěpenou vazbou (endohydrolýza). Pepsin B (EC 3.4.23.2) se tvoří obdobným mechanismem jako pepsin A, avšak z pepsinogenu B, oproti pepsinu A má malou aktivitu vůči hemoglobinu jako substrátu a dobře štěpí želatinu. Je obsažen hlavně v pyloru. Pepsin C (EC 3.4.23.3) je u člověka označován jako gastriksin, tvoří se z prekurzoru progastriksinu, který je secernován ve fundu žaludku, v antru a v proximálním duodenu. Štěpí endohydrolýzou přednostně peptidové vazby za zbytkem aminokyseliny Tyr, je méně specifický než pepsin A a má poměrně vysokou aktivitu vůči hemoglobinu jako substrátu. Je-li substrátem vaječný albumin, je optimální ph pepsinu A = 1,5, je-li substrátem kasein, optimální ph = 1,8 a pro hemoglobin jako substrát je optimální ph = 2,3. Gastriksin má optimum ph pro štěpení hemoglobinu 3,2. V naší úloze bude demonstrováno působení pepsinu na bílkoviny vaječného bílku. Reagencie: 1) roztok pepsinu 10 g/l 2) HCl 0,1 mol/l 3) suspenze vaječného bílku (vařený vaječný bílek se homogenizuje ve fyziologickém roztoku - konečná koncentrace asi 300 g/l) a. Do 4 označených zkumavek napipetujte roztoky podle tohoto schématu (objemy v ml) Výsledné ph: 1,2 1,5 2,5 kontr. roztok pepsinu 2,0 2,0 2,0 0 HCl 0,1 mol/l 4,0 2,0 0,2 2,0 deionizovaná H 2 O - 2,0 3,8 4,0 suspenze vaječného bílku 1,0 1,0 1,0 1,0 b. Inkubujte 20 min při 37 C v termobloku. Vyhodnocení: Po skončení inkubace se hodnotí projasnění obsahu zkumavek natrávením bílkovin vaječného bílku. Hodnotí se: projasněné úplné (+), částečné (±) a neprojasnění ( ). Výsledky zapište do tabulky v protokolu. Optimální ph je ve zkumavce s úplným projasněním obsahu. 4. Vliv koncentrace substrátu na rychlost enzymové reakce Michaelisova konstanta V úloze bude použito preparátu laktátdehydrogenasy - L-Laktát: NAD + - 5
oxidoreduktasa (EC 1.1.1.27). Jako substrátu bude použito laktátu, který je v přítomnosti NAD + jako koenzymu laktátdehydrogenasy (LD) přeměňován na pyruvát. CH 3 -CHOH-COOH + NAD + CH 3 -CO-COOH + NADH + H + Tato reakce se uplatňuje v glykolýze. Laktátdehydrogenasa má 5 isoenzymů (LD l - LD 5 ) jejichž distribuce v organismu se liší podle metabolické specializace orgánů, např. forma LD 1 převládá v srdci, forma LD 5 převládá v kosterním svalu. Tato forma převládá i v játrech. Jednotlivé isoenzymy lze odlišit např. elektroforézou, což napomáhá orgánové diagnostice. V naši úloze však preparát laktátdehydrogenasy poslouží k demonstraci kvantitativních vztahů mezi enzymem a substrátem (L-laktátem). Bude sledován vliv koncentrace substrátu (S) na iniciální rychlost (v 0 ). Koncentrace laktátu se proto bude lišit (od 12,5-200 mmol/l), zatímco ředění enzymu zůstane stálé. Měření iniciální rychlosti v 0 je založeno na fotometrii 2,4-dinitrofenylhydrazonu pyrohroznové kyseliny, který vzniká reakcí oxoskupiny pyruvátu s volnou aminoskupinou 2,4-dinitrofenylnydrazinu v kyselém prostředí (v kyselám prostředí se současně zastaví enzymová reakce). Vzniká 2,4-dinitrofenylhydrazon, který po alkalizaci dává hnědooranžové zbarvení vhodné k fotometrování při 505 nm. NO COOH 2 COOH Kondenzace C O + H 2 N NH NO 2 C N NH NO 2 NO 2 + H 2 O CH 3 Kyselina pyrohroznová 2,4-dinitrofenylhydrazin CH 3 2,4-dinitrofenylhydrazon kyseliny pyrohroznové Reagencie: 1) homogenát krysích jater. 2) roztok natrium-laktátu 0,6 mol/l 3) TRIS-HCI 0,05 mol/l pufr, ph 8,5 obsahujícím 1 mg hovězího sérového albuminu v 1 ml. 4) roztok NAD + 3 mmol/l v TRIS-HCl pufru (viz bod 3). Každý den připravovat čerstvě! 5) roztok 2,4-dinitrofenylhydrazinu (DNPH) v HCl 1 mol/l. Každý den připravovat čerstvě! 6) NaOH 0,4 mol/l a. Připraví se pomocné ředění natrium-laktátu (ze základního roztoku 0,6 mol/l) Zkumavka č. c (Na-laktát) pufr TRIS-HCI výsledná koncentrace mol/l ml ml mol/l 1 0,6 zasobní roztok 1,0-0,6 2 0,6 zásobní roztok 1,0 1,0 0,3 3 0,3 (ze zkum. 2) 1,0 1,0 0,15 4 0,15 (ze zkum. 3) 1,0 1,0 0,075 5 0,075 (ze zkum. 4) 1,0 1,0 0,0375 6
pozn.: Používá se postupně roztoků z předchozích zkumavek (ředění geometrickou řadou). b. Připraví se série šesti označených zkumavek, které se zpracují podle tohoto schématu: Zkumavka č. 1 2 3 4 5 6 substrát (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 NAD + (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 Pokusný čas (min) Preinkubace 37 C ve vodní lázni - 5 min 0 enzym (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1-5 Promíchat + inkubovat - přesně 15 min 20 DNPH (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 20 enzym (ml) - - - - - 0,1 21 Nechat stát při laboratorní teplotě 35 NaOH (ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 36 Fotometrovat při 505 nm proti zk. č.6 Poznámky časově nezávislé připravit mimo termoblok v termobloku provádět mimo termoblok Pozn. : Čísla zkumavek 1 5 odpovídají koncentracím připraveným v tab. ředění substrátu. Pro zkumavku č. 6 zvolte nejnižší koncentraci substrátu = slepá zkouška. Při přidávání enzymu před inkubací a DNPH po inkubaci je nutné dodržovat 20 s interval mezi jednotlivými vzorky. Výsledky: Výsledky zapište do tabulky v protokolu. Vyhodnocení: A. Z výsledků měřeni sestrojte graf závislosti 1/v na 1/S podle Lineweaver-Burka. Rychlost v je možno vynášet jako A 505, neboť tato hodnota je při jednotlivých koncentracích přímo úměrná množství vytvořeného produktu v nanomolech. Je také možné odečítat množství vytvořeného produktu v nanomolech z kalibračního grafu a přepočítat na 1 sekundu jako rychlost v vyjádřená v nanokatalech. Jeden posluchač z dvojice vynáší na milimetrový papír graf jako závislost 1/A 505 na 1/S. Druhý posluchač vynáší na ose y odpovídající hodnoty 1/v jako nanomoly vytvořeného produktu za 1 sekundu (nkataly). Porovnáním se oba přesvědčí, že zjištěná hodnota K m (vyjádřená jako látková koncentrace laktátu) je při obou způsobech totožná a nezávisí na zvolených jednotkách rychlosti. B. Přímé lineární vynesení (Eisenthal, Cornish-Bowden) a. Vyneste v proti S a proložte křivku (rovnoosá hyperbola). b. Pak vyneste jednu z hodnot S na osu x a odpovídající hodnotu v na osu y. Oběma body proložte přímku. 7
c. Tento postup opakujte pro všechny dvojice hodnot S a jim odpovídajících naměřených hodnot v. Získáte n přímek pro n dvojic hodnot. d. Pokud by naměřené hodnoty přesně odpovídaly rovnici rovnoosé hyperboly, všechny přímky by se protnuly v jednom bodě, jehož souřadnice y je V a souřadnice x je K m. e. Protože měření jsou zatížena experimentální chybou, v praxi se setkáváme většinou se situací, kdy se přímky protnou ve více průsečících. Souřadnice y těchto průsečíků jsou V a souřadnice x K m.tyto hodnoty seřadíme podle velikosti a určíme medián. C. Výpočet K m z naměřených hodnot. Vytvořte sadu dvojic hodnot s seřazených podle velikosti a jim odpovídajících hodnot v : S 1 v 1 S 2 v 2 S 3 v 3 S 4 v 4 S 5 v 5 Pro každý pár z možných dvojic můžete vypočítat K m i V podle rovnic pro rovnoosou hyperbolu, uvedených v teoretickém úvodu. v2 - v1 S2 - S1 K m = S1S2 V = v1v2 Sv 2 1 -Sv 1 2 Sv 2 1 -Sv 1 2 Vypočtěte K m pro všechny možné páry dvojic a pak se určete jejich medián. pozn. Medián (označován Me nebo ) je hodnota, jež dělí řadu čísel podle velikosti seřazených hodnot na dvě stejně početné poloviny. Při lichém počtu hodnot se určí medián jako hodnota, která má nad sebou i pod sebou stejný počet měrných hodnot. Při sudém počtu hodnot je medián aritmetickým průměrem dvou středních hodnot, tj. nejnižší hodnoty horní poloviny a nejvyšší hodnoty dolní poloviny hodnot uspořádaných podle velikosti. 5. Důkaz peroxidasy benzidinovou reakcí Peroxid vodíku při oxidačních pochodech v buňce je rozkládán enzymy zvanými peroxidasy a katalasy. Patří do skupiny heminových enzymů (hemoproteinů). Průběh reakce je u obou enzymů rozdílný. Peroxidasy katalyzují oxidaci substrátu účinkem peroxidu vodíku za vzniku vody (viz teoretický úvod). Peroxidasy (EC 1.11.1.7) jsou obsaženy v rostlinných i živočišných organismech. Katalasa (EC 1.11.1.6) jednak rozkládá peroxid vodíku na vodu a molekulární kyslík, jednak má peroxidasový účinek. Vyskytuje se ve větším nebo menším množství ve všech tkáních (v tzv. peroxisomech) a v tekutinách organismu. Význam tkví hlavně v rozkladu H 2 O 2 škodlivého pro organismus. V tomto cvičení bude prokazována peroxidasová reakce kvalitativně oxidací derivátu benzidinu na modré barvivo. (Dříve se používalo k těmto důkazům benzidinu 4,4 -diaminobifenylu, který je však kancerogenní.) Derivát benzidinu (tetramethylbenzidin nebo o-tolidin) se působením peroxidasy a peroxidu vodíku oxiduje na barevný oxidovaný produkt. H 2 N NH 2 + H 2 O 2 POD HN NH H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 o-tolidin 8
Reagencie: 1) extrakt z brambor (extrakt s peroxidasou aktivitou) 2) roztok o- tolidinu 3,3 -dimethylbenzidinu 30 g/l v ledové kyselině octové 3) peroxid vodíku 30 g/l a. Reakční směsi se připraví do 4 zkumavek takto: Extrakt z brambor (ml) 1,0 o-tolidin v kyselině octové 1 2 3 4 1,0 (povařený) - 1,0 4 kapky 4 kapky 4 kapky 4 kapky H 2 O 2 4 kapky 4 kapky 4 kapky - Deionizovaná H 2 O pozn.: odečítat nutno ihned Výsledky: Výsledky zapište do tabulky v protokolu (ml) - - 1,0 - Vyhodnocení: Porovnejte výsledek ve zkumavce č. 1 se zkumavkami č. 2, 3 a 4. Vysvětlete rozdíly. 9