Metody odběru a zviditelnění otisků prstů Identifikace krevních stop Odběrem a analýzou otisků prstů se zabývá odvětví kriminalistické techniky zvané daktyloskopie. Tento obor zkoumá otisky papilárních linií článků prstů (ale také např. dlaní či jejich částí). Vedle zajišťování kriminalistických stop a jejich vyhledávání je hlavním cílem daktyloskopického zkoumání zjistit identitu osoby, která otisk zanechala. Vzhledem k tomu, že průběhy papilárních linií jsou pro každého člověka jedinečné (podobně jako DNA), lze říci, že s největší pravděpodobností neexistují dva lidé, kteří by měli všechny otisky prstů totožné. Každá papilární linie představuje vyvýšenou kožní vrstvu, do níž vede kanálek s vyústěním potních žláz. Dotykem se z papilárních linií přenesou částečky prachu a dalších nečistot společně s potem a vytvoří tak kriminalistickou stopu daktyloskopický otisk. Díky tomu představuje daktyloskopie jednu ze základních kriminalistických metod, které jsou velmi často využívány k nalezení a identifikaci pachatele. Zviditelnění otisku prstů Existuje několik základních metod, které se v kriminalistické praxi běžně používají. Nejčastějším postupem pro zviditelnění (nalezení) otisků je použití tzv. daktyloskopických prášků. Profesionální produkty jsou značně rozdílné a závisí zejména na okolních podmínkách (teplota, vlhkost, fyzikální podklad otisku apod.) a stáří otisku. Pro účely tohoto cvičení budeme používat dva typy daktyloskopických prášků magnetický železný prach a karbonizovaný uhlík (grafitový prášek). Pro latentní otisky prstů nebo otisky na předmětech a místech, pro které jsou práškové metody nevhodné, využijeme metody chemického zviditelnění, založené na chemické reakci mezi složkami otisku prstu (zejména potu a jeho složek) a chemickým činidlem. Práškové metody Tyto metody jsou vhodné především pro otisky zanechané na matných površích, jako je sklo, plast a jiné syntetické materiály nebo keramika. Principem této metody je adsorpce práškového materiálu na složky otisků. Daktyloskopické prášky se dají hrubě rozdělit na magnetické (např. modifikovaný nebo čistý železný prach) nebo nemagnetické (např. hliníkový prášek, měděný prášek nebo zmíněný grafit (případně jemné aktivní uhlí). Výhodou magnetických prášků je fakt, že je lze buďto přímo nanášet pomocí permanentního magnetu nebo lze přebytečný prášek magnetem zachytit a odstranit. Takto získané daktyloskopické stopy se poté buďto fotografují (v závislosti na povrchu, na němž jsou) nebo se přenášejí tzv. daktyloskopickými fóliemi a poté dále zpracovávání (fotografují, skenují apod.). Daktyloskopických fólii existuje rovněž celá řada a záleží a jejich volba závisí na konkrétním případě použití. Obecně se využívají černé nebo bíle folie na bázi želatiny, na kterou je otisk po zviditelnění přenesen. Pro naše účely postačí jako fólie pro přenos otisku prstu lepící páska nebo bílá samolepící fólie.. Chemické metody Pot přenesený z papilárních linií při zanechání otisku prstu obsahuje celou řadu chemických látek, které mohou interagovat s činidly. Mezi chemické látky, které se používají ke zviditelnění otisků prstů, patří zejména ninhydrin, jód, dusičnan stříbrný nebo estery kyanoakrylové kyseliny (tzv. kyanoakryláty). Jód jako takový patří spíše na pomezí
fyzikálních a chemických metod, neboť princip detekce je založen na sublimaci jódu a zachytávání jeho částeček na otiscích. Ostatní metody pak využívají chemické reakce, které vedou k viditelné změně (zvýraznění, zabarvení), avšak mnohdy může dojít k poškození nebo zničení materiálu nebo předmětu, na kterém je otisk umístěn. Ninhydrinové činidlo funguje na principu reakce ninhydrinu s aminokyselinami obsaženými v potu (obr. 1), které ulpí při dotyku na předmětu. Obr. 1: reakce ninhydrinu a aminokyselinou Ninhydrin se běžně používá jako činidlo k detekci aminokyselin, působí jako oxidační činidlo a při reakci nejdříve dojde dekarboxylaci příslušné aminokyseliny (např. alaninu, kdy v obr. 1 R = CH 3 ) a vzniklý amin pak podléhá oxidativní deaminaci. Ninhydrin se během této reakce přemění na zabarvený produkt. Reakce může probíhat jak v neutrálním (obr. 1.1) tak kyselém prostředí (obr. 1.2.), a oba produkty pak mají mírně odlišné zabarvení. Jód se používá ve formě prášku nebo jemných krystalků a obvykle je buďto uvolňován teplem přímo na místě (zahřátím speciální trubičky rukou) nebo ve vyvíjecích nádobách v laboratoři. Dusičnan stříbrný se jako činidlo využívá k detekci halogenidových iontů a jako takový může reagovat s chloridovými ionty přítomnými v potu. Vzniká bílá sraženina, které se účinkem záření (běžného polychromatického světla nebo UV záření) přeměňuje na elementární stříbro a tím se zvýrazní zabarvení otisku (černání). Estery kyseliny kyanoakrylové, které se využívají např. jako tzv. vteřinová lepidla, našly své uplatnění také ve forenzní chemii zejména při detekci tzv. latentních otisků prstů. Zahřátím kyanoakrylátů dojde k vývoji par, které se na otiscích prstů usazují ve formě polykyanoakrylát (obr. 2.). Ten je viditelný i pouhým okem, lze však využit i přídavek fluorescenčního nebo nefluorescenčního barviva, který otisk prstu ještě zvýrazní a zviditelní. Takto detekované otisky lze rovněž snadno přenést a dále zpracovávat.
Obr. 2: obecné schéma polymerace methyl kyanoakrylátu (Nu - představuje nukleofil, v případě detekce otisků prstů např. OH - )
Nalezení a zviditelnění daktyloskopické stopy Úkol: Proveďte sérii postupů vedoucí ke zviditelnění otisků prstů na předložených předmětech. Pomůcky: sada jemných štětců, plastové nebo skleněné petriho misky, uzavíratelná průhledná plastová nádobka (vyvíjecí komora pro kyanoakrylátovou nebo jodovou reakci), rozprašovač, kádinky, odměrný válec, plastové nádobky, mikroskopická sklíčka, váhy a navažovací lodičky nebo papír, sušárna, bílý papír. Chemikálie: ninhydrin, ethanol, methanol, kyselina octová, jód, kyanoakrylát (např. vteřinové lepidlo), dusičnan stříbrný, železný prach, aktivní uhlí nebo grafitový prášek, voda. Příprava činidel: 1.) Ninhydrin 50 mg ninhydrinu se naváží a převede do plastové nádobky a přidá se 25 ml ethanolu a 750 µl kyseliny octové (99 %). S ninhydrinem pracujeme opatrně a v rukavicích, neboť při kontaktu s kůží dojde k podobné reakci a zabarvení jako s otisky prstů. Připravený roztok převedeme do nádobky s rozprašovačem. 2.) Dusičnan stříbrný připravíme methanolický roztok dusičnanu stříbrného rozpuštěním 500 mg AgNO 3 ve 25 ml methanolu. Roztok uchováváme v hnědých zásobních lahvičkách a chráněný před přímým světlem. Část roztoku potřebnou pro práci převedeme do nádobky s rozprašovačem. 3.) Jód a kyanoakrylát použijeme jodový prášek nebo jemné krystalky, které umístíme přímo do vyvíjecí komory. V případě kyanoakrylátu dáme malé množství (několik kapek) vteřinového lepidla např. na kousek alobalu a ten umístíme do vyvíjecí komory. Při přípravě těchto činidel a následné práci s nimi pracujte vždy v rukavicích a v digestoři! Pozor zejména na vteřinové lepidlo, neboť i malé množství rychle zasychá a lepí většinu materiálů. 4.) Práškové materiály jako železný nebo grafitový prach používáme přímo ze zásobních lahví a v digestoři (v rukavicích a nejlépe s rouškou a v digestoři, neboť vdechovaný prach je zdraví škodlivý a dráždí). Postup: Předložené materiály, na které byly naneseny otisky prstů (případně sami otisky prstů naneste dle pokynů vedoucího cvičení), podrobte zkoumání pomocí uvedených činidel. Skleněné, keramické nebo plastové materiály jsou vhodné jak pro metody chemické tak i práškové, zatímco otisky prstu např. na papíru lze lépe zviditelnit pomocí chemických činidel ninhydrinu a dusičnanu stříbrného. Obecný postup práce je následující: V rukavicích (!!) opatrně (abyste nedošlo k poškození nebo vzniku dalších otisků) zkoumané předměty rozdělíme na plastové, kovové, skleněné nebo keramické (skupina 1), a na papírové
(nebo jiné nasákavé materiály, skupina 2). Vždy je připraveno od každého materiálu více vzorků, aby mohly být vyzkoušeny všechny techniky. Otisky prstů na materiálech ze skupiny A podrobíme nejprve daktyloskopickému zkoumání pomocí prášků a zaznamenáme případné změny. Pracujeme velmi opatrně a prášek spíše sypeme než natíráme štětcem. Při příliš prudkém nanášení dojde k setření otisků nebo k detekci pouze jejich částí. Stejné materiály poté vložíme do vyvíjecí komory tak, aby se jejich plochy nedotýkaly stěn nádoby. Vložíme dané činidlo a necháme cca 10-20 minut vyvíjet. Probíhá-li vyvíjení příliš pomalu a nedochází ke zviditelnění otisků, je možné nádobu mírně zahřát (cca 40-60 C) např. na vodní lázni. Zviditelnění otisků se projeví jako bílý povlak v případě kyanoakrylátu nebo jako hnědočervené otisky v případě jódu). Materiály ze skupiny B (především papír) položíme na pevnou podložku (např. plast nebo sklo) v digestoři a stejnoměrně aplikujeme činidla pomocí rozprašovače. Nechte činidla zaschnout, případně zkoumaný vzorek opatrně přeneste do sušárny a vysušte (při teplotě cca 80 120 C). Neprojeví-li se zabarvení, je nutné sušení opakovat. V případě dusičnanu stříbrného nanášeného na bílý podklad je potřeba vzorek nechat několik minut na světle nebo použít UV lampu aby došlo k vyloučení elementárního stříbra a ztmavnutí otisku. Vyhodnocení Pokuste se nalézt nejvhodnější činidlo pro předložený materiál. Zviditelněné otisky zaznamenejte (např. fotograficky nebo skenováním přes transparentní fólii).
Orientační zkouška na přítomnost krve Orientační zkouška je nezbytnou součástí předcházejícím vlastní analýze. Je nutné potvrdit nebo vyvrátit zdali se skutečně jedná o suspektní vzorek, neboť analýza bývá mnohdy nákladná. Obvykle, pokud je to možné, se tato kvalitativní analýza provádí přímo na místě činu, aby se zamezilo záměně vzorků. Ne vždy je to však možné, např. vzhledem k množství vzorku, jeho lokalizaci (pevný povrch, látka či jiný materiál schopný sorpce činidel) apod. Z mnoha typů kvalitativní analýzy krevních stop jsou zde uvedeny dvě nejběžnější a nejjednodušší. 1. Činidlo na bázi luminolu Luminol (neboli 5-amino-2,3-dihydroftalazin-1,4-dion) je luminofor (Obr. 3), při jehož oxidaci v bazickém prostředí za katalýzy dochází k chemiluminiscenci, která je charakteristická světle modrým zabarvením. Katalýza této oxidačně-redukční reakce je zde zajištěna právě krevním barvivem - hemoglobinem, který je přítomen v krvi a krevních stopách Orientační zkouška za pomoci luminolu má však svá omezení. Kromě hemoglobinu mohou uvedenou reakci katalyzovat také ionty některých přechodných kovů, především Cu 2+ a Co 2+ nebo chlornanové anionty často přítomné v desinfekčních prostředcích (např. SAVO). Bazické prostředí je možno zajistit různými způsoby, optimální ph je v rozmezí 9-10. Výběr a použití pufru však závisí na celé řadě dalších faktorů, zejména nesmí žádná ze složek pufru nijak interagovat se vzorkem nebo jeho částmi. Luminol je však látka velmi špatně rozpustná ve vodných prostředích a svůj vliv zde hraje nejen ph ale i iontová síla roztoku. Obr. 3: Struktura luminolu 2. Činidlo na bázi 3,3,5,5 -tetramethylbenzidinu (TMB) Deriváty benzidinu se peroxidem vodíku nebo jiným oxidačním činidlem oxidují na produkty modré barvy, tzv. benzidinovou modř. Reakce je katalyzována buďto enzymaticky pomocí peroxidas (POD) nebo látkami, které ve své molekule obsahují porfyrin hem s centrálním atomem železa, tedy např. krevní barvivo hemoglobin. Pro účely kvalitativní orientační analýzy používá 3,3,5,5 -tertramethylbenzidin (TMB) v prostředí kyseliny octové nebo kyselého pufru.
Obr. 4: Struktura 3,3,5,5 -tetramethylbenzidinu Úkol: Prokažte přítomnost krevních stop na předloženém vzorku Pomůcky: plastové nádobky, kádinky, rozprašovač, mikrozkumavky, lodičky, váhy, mikropipety. Chemikálie: peroxid vodíku (30 %, v/v), kyselina octová, 3,3,5,5 -tertramethylbenzidin (TMB), luminol, uhličitan sodný, peroxoboritan sodný, voda, dimethylsulfoxid (DMSO). Příprava činidel a postup: 1.) Luminol Odvažte 100 mg luminolu do 50 ml kádinky a přidejte 9 ml deionizované vody. K vzniklé suspenzi přidejte 0,5 g bezvodého uhličitanu sodného (Na 2 CO 3 ) a důkladně promíchejte až do rozpuštění (v případě že se všechen luminol nerozpustil, přidejte opět menší množství uhličitanu). Do mikrozkumavky odvažte 0,5 g peroxoboritanu sodného a doplňte na objem 1 ml deionizovanou vodou a důkladně rozpusťte pomocí ultrazvukové lázně. Před použitím činidla k analýze oba roztoky slijte a aplikujte buď do roztoku, o kterém předpokládáte že obsahuje krev, nebo rozprašujte na krví znečištěný povrch (oděv, papír atd.). Pozitivní zkouška se projeví viditelnou modrou fluorescencí, kterou je nutné pozorovat ve tmě. 1. TMB Na lodičce odvažte 5 mg tetramethylbenzidinu (TMB) a rozpusťte v 5 ml dimethylsulfoxidu (DMSO). Připravte 50 ml základního roztoku ledové kyseliny octové o koncentraci 0,1 mol.dm -3. Poté smíchejte 1 ml TMB rozpuštěný v DMSO s 9 ml roztoku kyseliny octové a dobře promíchejte. Před analýzou přidejte k připravené směsi 5 µl 30% peroxidu vodíku a důkladně promíchejte. Vzniklé činidlo aplikujte obdobně jako luminol (viz výše), pozitivní zkouška se projeví jasně modrým (event. zeleným) zabarvením. Použitá literatura 1. J. Pješčák a kol. Kriminalistika, Obzor, Bratislava 1981. 2. S. Bell, Forensic Chemistry, Prentice Hall, 2nd edition, 2012 3. J. Tesař, Soudní lékařství, Avicenum Praha 1976
Doplňující otázky 1. Jakým způsobem by bylo možné odebrat otisky prstů zemřelému? 2. K identifikaci krevních skvrn se ještě používá Bertrandova zkouška. Popište princip této metody.