Lékařská mikrobiologie Mykologie Učební text pro studenty Fakulty zdravotnických studií ZČU v Plzni Studijní obor: Ochrana veřejného zdraví Vypracovala: MUDr. Drahomíra Rottenbornová 1
Houby ( Fungi- Mycophyta ) jsou rostlinné mikroorganismy, které jsou rozšířeny v celém životním prostředí člověka. Houby se morfologicky a chemickým složením významně liší od bakterií. Jsou to rostlinné buňky, které obsahují pravé jádro obalené membránou. Chorobné stavy vyvolávané houbami: a) mykózy pravá infekční onemocnění b) mykotoxikózy vyvolané metabolickými produkty hub c) mykoalergózy přecitlivělost na částice houbovitého původu nebo na metabolické produkty hub d) mycetismy podráždění pouhou mechanickou přítomností Mykózy Původci: mikromycety eukaryotní rostlinné mikroorganismy (pravé jádro s jadernou membránou, v buněčné stěně není peptidoglykan, ale chitin, glukany, manany) a) vláknité houby (plísně) - tvoří dlouhá vlákna (hyfy ), jejich spleť vytváří mycelium - hyfy mají většinou septa - rozmnožují se pomocí spor, které vznikají nepohlavním dělením nebo sexuální reprodukcí obr. 1 b) kvasinky - kulaté nebo nebo oválné buňky, které se množí pučením - některé tvoří pseudomycelium obr. 2 c) dimorfní houby (20 o C saprofytické stádium, plísně 37 o C parazitické stádium, kvasinky) Výskyt mikromycet: a) kosmopolitní b) endemity (mohou být zavlečeny do velkých vzdáleností) c) saprofyty Význam: Houby jsou často nalézány v horních i dolních cestách dýchacích, na kůži, na potravinách i předmětech. Odbourávají mnohé komplexní organické látky a uvolňují významné biogenní prvky. Mnoho druhů se používá jako kulturních organismů k výrobě poživatin, hlavně jako kvasných organismů. Některé druhy jsou velmi častými původci kažení potravin. Lékařsky významné houby jsou patogenní pro člověka a způsobují hluboké či povrchové mykózy. Mnohé jsou sekundárními původci onemocnění sliznic. Některé svými toxickými produkty metabolismu ( mykotoxiny ) vyvolávají alimentární intoxikace. Zvyšuje se počet případů. Mykózy vnitřních orgánů a orgánových systémů se v posledních letech stávají velmi důležitou a závažnou skupinou onemocnění se vzrůstající tendencí. 2
Příčiny: A- nepřímé myslí se na mykotický původ - zlepšení mykologické dg B- přímé větší cestovní ruch (přenos endemických původců) - iatrogenní faktory (širokospektrá ATB, kortikoidy, cytostatika, transplantace, hemodialýza; alkoholici, hormonální antikoncepce, kardiochirurgické operace, DM, AIDS) - ekologické faktory (znečištění ovzduší chronická mikrotraumata dýchacích cest) Terapie: Podobnost struktury a funkce buněk hub a buněk živočišných je příčinou časté toxicity a obtížného výběru specifických antimykotik pro léčbu infekcí vyvolaných houbami. Naproti tomu odlišnost buněk hub od bakterií je příčinou primární rezistence hub k ATB. Tzv fungistatika a antimykotika - k celkové nebo lokální aplikaci (viz obecná mikrob.) Mykologická diagnostika Princip mykologické diagnostiky je stejný jako např. v bakteriologii, tj. diagnostika přímá a nepřímá. Odběr a zpracování materiálu: Kožní šupiny - z okrajové části ložiska (přechod zdravé a postižené tkáně), místo odběru dekontaminovat 70% alkoholem. Seškrabání jemných šupinek kůže sterilním skalpelem po předchozím odstranění hrubých krust nebo šupin. - (stěr tamponem - zvlhčit jej sterilním fyziologickým roztokem) Vlasy a chlupy - vytáhnout i s kořenovým váčkem Nehty - po odstranění povrchových částí (bývají kontaminovány) a dezinfekci alkoholem seškrábnout drobné částečky do sterilní zkumavky Tento materiál zasíláme ve sterilní zkumavce, užití transportního media není třeba. Ostatní druhy materiálu - krev, moč, sputum výtěry aj. jako na bakteriologické vyšetření. 1.Přímý průkaz a) mikroskopické vyšetření Má značný význam. Umožňuje v krátké době po dodání materiálu do laboratoře rozlišit, zda jde o mykózu. Používají se zejména následující druhy preparátů: Louhové preparáty - částečky šupin kůže či nehtů nebo vlasy a chlupy, umístěné na podložním skle, se zakápnou 10-40% draselným louhem. Přikryje se krycím skliíčkem louh se nechá působit 30-60 minut. 3
Inkoustové preparáty - KOH + inkoustové barvivo; lepší citlivost Preparáty s Lugolovým roztokem - smísení tekutého materiálu s Lugolovým roztokem v poměru 1:1. Bakteriologické a histologické barvicí techniky - např. barvení dle Grama nebo Giemsy Fluorescenční metoda - používají se speciální látky, které se vážou na chitin ve stěně mikormycet, prohlížení ve fluorescenčním mikroskopu. Histologické vyšetření speciální barvení vzorků tkání b) kultivační vyšetření Houby rostou při 25-37 o C, rostou pomaleji než bakterie, mají menší nároky na živiny. Rostou na všech běžných půdách. K jejich selektivní kultivaci se nejčastěji používá Sabouraudův glukózový agar s antibiotiky. Vzhledem k dlouhé době kultivace (minimálně 10 dní) je nutné mikrokultury zabezpečit před vyschnutím (gumové zátky) a před přerůstáním bakteriemi (přidáním antibiotik). Výhodnější je použít větší počet kultivačních půd, čímž zvýšíme pravděpodobnost záchytu původce onemocnění. Kromě základních půd jsou k dispozici ještě půdy diagnostické, na kterých určité mikromycety produkují charakteristické pigmenty. Vláknité houby vytvářejí typické plísňovité kolonie s bohatým vzdušným myceliem ( jako chomáček vaty ), kvasinky vytvářejí měkké, vypouklé, mazlavé kolonie. c) identifikace izolovaných mikromycet Při zařazování izolovaných kmenů hub do rodů a druhů se obvykle hodnotí: - vzhled povrchu kolonií (u vláknitých hub sametový, zrnitý, vatovitý, u kvasinkových mikromycet lesklý a hladký) - pigmentace kolonií a zbarvení jejich spodiny, difúze produkovaných pigmentů do kultivačního média v okolí kolonie - charakter růstu: kvasinka vláknitá houba dimorfní růst - rychlost růstu c1) Identifikace kvasinek Odlišení nejfrekventovanějšího druhu Candida albicans: 4
- kultivací na komerčně vyráběných půdách (např. Candiselect), na kterých rostou kolonie kvasinek různě zbarveny - germ-tube test (test tvorby zárodečných klíčků): kultivace na speciální půdě, po 3-4 hodinové inkubaci při 37 O C se pod mikroskopem prohlížejí naočkované čáry a hledají se klíčky vyrůstající z kvasinkových buněk; nebo se kultivace provádí v čerstvém séru a po 2 hodinách se zhotovuje nativní preparát; nebo se po klíčkách pátrá po 3 denní kultivaci kvasinek na rýžovém nebo kukuřičném agaru Dourčení ostatních druhů kandid a zástupce jiných rodů kvasinek - pomocí biochemické aktivity - auxanogramy (testování asilimace, t.j.využívání cukrů k růstu jako zdrojů uhlíku) - zymogramy (test štěpení cukrů) - komerční identifikační systémy (mikrodestičky) c2) Identifikace vláknitých mikromycet - rychlost růstu - morfologie a povrch kolonií, jejich pigmentace - mikroskopický preparát z čerstvě narostlé kultury (morfologie vláken, nepohlavních rozmnožovacích struktur); pokud nestačí: - mikrokultura - biochemické testy (nutriční nároky, produkce enzymů - konverze růstových stádií za různých teplot (určování dimorfních hub) 2. Nepřímý průkaz mykóz - aglutinace, KFR, dvojitá imunodifúze, imunoelektroforéza, ELISA, kožní test pro průkaz alergie Rozdělení mykóz A- povrchové (kůže, adnexa, viditelné sliznice) B- subkutánní C- systémové ad A) povrchové mykózy - původci se množí pouze v keratinových vrstvách kůže a jejích adnex, nepronikají do hlubších tkání - podle lokalizace: dermatomykózy, trichomykózy, onychomykózy Nejvýznamnější zástupci: 1. Dermatofyta Nejčastější původci dermatomykóz (onemocnění kůže a jejích adnex vlasů, chlupů a nehtů). Mykotická onemocnění kůže a jejích adnex jsou u nás velmi častá. 5
Morfologie:dimorfní houby, na Sabouradově agaru při 20 o C rostou v typických koloniích s bohatým různě zbarveným vzdušným myceliem Výskyt: parazité člověka nebo zvířat Přenos: přímým kontaktem nebo společně užívanými předměty (hřebeny, ručníky, podlahy koupališť, sprch); dermatofyta dlouho přežívají Onemocnění: dermatofytózy (tinea); podle postižených struktur: tinea capitis, tinea barbae, t. corporis (hladká kůže), t. pedis (interdigitální mykózy), t. inguium Klinický obraz: kůže - suché olupování, dráždění, zčervenání, otok, puchýřky nehty odbarvení, ztluštění,drolení vlasy lupy, vypadávání vlasů Rod Trichophyton: mykózy interdigitální, kůže, vousů, vlasů Rod Microsporum: kůže, vlasy, nehty vzácně Rod Epidermophyton: kůže, nehty, nikdy vlasy Obr. 3 2. Rod Candida (podrobně viz Systémové mykózy) - orální kandidóza (soor, moučnivka): kojenci, staří, ATB terapie, pod zubními protézami - vulvovaginitida - střevní dysmikrobie - dermatomykózy: v místech vlhké zapářky, vnější ucho - onychomykózy 3. jiní vzácní původci Lab. dg povrchových mykóz: - seškraby z chorobných ložisek kůže, nehtů, kožní šupiny, vlasy, hnis - mikroskopie: louhový pp (vzorek + kapka 10-20%KOH, pozor. po 20 minutách) - kulivace: Sabouraudův glukózový agar s ATB, event. jiné půdy, 20 o C, 1-3 týdny - druhová identifikace: - makroskopický vzhled kolonií - mikroskopická morfologie mikro, makrokonidií (nativní pp z kultury mikrokultura na sklíčku) Terapie: lokální preparáty př: Canesten mast, Mucidermin spray, Pimafucin mast. celková antimykotika - mykofytózy nehtů, kštice, těžké kožní mykózy kombinace celkových a lokálních antimykotik u některých chronických infekcí Pozn.: Infekce nehtů na nohou častý výskyt relapsů ad B) Subkutánní mykózy - postižení podkoží - původci: saprofyti z půdy, rostlin, dřeva - často endemický výskyt v tropech - kosmopolitní: sporotrichóza (Sporothrix schenckii) - k infekci dochází drobným poraněním (trn) - chronický granulomatozní zánět, šíření podél lymfatických cév, postižení uzlin, abscesy, ulcerace - často profesionálního charakteru (zahradníci, zemědělci) 6
- vzácně z člověka na člověka ad C) Systémové mykózy Rod Candida Mykoorganismy rodu Candida jsou prvořadými původci povrchových i systémových endogenních mykóz na celém světě. Nejčastějším patogenem je Candida albicans, méně: C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis, C. parapsilosis aj. Kandidy jsou dnes řazeny k dimorfním houbám, na rozdíl od ostatních ale tvoří ve tkáních jak kvasinky, tak vlákna. Candida albicans Patogenita: Především jako potenciálně patogenní houba. Kandidy jsou adaptovány na saprofitickou existenci u člověka. Kolonizují zejména orofarynx a rectum, méně kůži. Toto osídlení je hlavním zdrojem pro endogenní infekce. Vzrůstá však i počet exogenní kandidóz, zejména nosokomiálních vyvolaných kmeny se zvýšenou virulencí. Onemocnění: Primární kandidóza u zdravých lidí, infikovaných vysoce virulentními kmeny C. albicans Sekundární kandidóza: Predisponující faktory: a) snížení obranyschopnosti (celková těžká onemocnění: tumory, diabetes, špatná výživa, věk, vrozené i získané imunodefekty) b) léčebné a diagnostické zásahy (léčba kortikosteroidy, imunosupresivy, cytostatiky, širokospektrými antibiotiky, kontaminované infúzní roztoky, katetry aj.) Povrchové kandidózy: soor(moučnivka) ústní sliznice- bílé povlaky DÚ u oslabených dětí vulvovaginitida u disponovaných žen:gravidita, diabetes,terapie ATB kandidoza míst vlhké zapářky onychomykóza-onemocnění nehtů střevní dysmikrobie Diseminované a orgánové kandidózy Šíření do tkání a krevní cestou: do plic, bronchů, GITu, ledvin, CNS aj. orgánů Zvláště závažné jsou kandidová endokarditida a sepse. Lab. dg: Materiál: - z povrchových lézí (viz povrchové mykózy) - sputum, bronchiální laváže, moč, krev aj. Mikroskopie: G+ pučící blastokonidie až vlákna Kultivace: Sabouraudův agar při 20 a 37 o C Biochemické testy (auxanorgamy, zymogramy) Germinace (průkaz zárodečných klíčků) viz výše Histologické vyšetření vzorku tkáně (u systémových mykóz) Průkaz antigenů v séru Průkaz protilátek speciálními technikami 7
Cryptococcus neoformans Houba kvasinkovitého typu. Tvoří pouzdro. Výskyt: kosmopolitní, jako saprofyt v půdě, na rostlinách, zvířecích hostitelích (ptačí hnízdiště, trus!!!) Přenos: inhalací, (kůží) Onemocnění: kryptokokóza, zejména sekundární u predisponovaných jedinců /dnes zejména AIDS pacienti/ (plíce, rozsev do různých orgánů, meninoencefalitida) Lab. dg: Materiál: likvor, sputum, moč, kev na hemokultivaci Mikroskopie: nativ, s tuší (kulovité pučící buňky s nápadným pouzdrem) Kultivace. Sabouraudův agar Průkaz kapsulárního Ag v likvoru Rod Aspergillus Vláknité houby, vlákna (hyfy) dělena septy. Makroskopický útvar složený z rozvětvených hyf se nazývá mycelium. Bazální mycelium vrůstá do kultivační půdy a čerpá z ní živiny. Vzdušné mycelium nese reprodukční orgány. Obr.4 Zahrnuje asi 150 druhů, pro lidskou patologii má význam: Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger. Výskyt: hojně v přírodě (tlející rostliny, seno, skladované obilí) Přenos: inhalací spór (mikrokonidií) Onemocnění: infekce (aspergilóza) a intoxikace a) aspergilóza - primární postižení dýchacích cest (ohraničený aspergilom, akutní pneumonie, u atopiků astma a bronchopneumonie) - sinusitidy, otitidy, pleuritidy, postižení očnice, CNS, povrchové tkáně - sekundární infekce u oslabených pacientů (maligní tumory, po léčbě imunosupresivy, ATB, místní poruchy v dýchacích cestách) s tendencí k rozsevu, prorůstání do cév - významní původci nosokomiálních nákaz b) intoxikace mykotoxiny (aflatoxiny) hepatotoxické, karcinogenní nejčastějším zdrojem jsou rostlinné produkty (obilniny, burské oříšky) Lab. dg: Materiál: sputum,biopsie tkání Mikroskopie Kultivace: rostou dobře, chmýřité kolonie různě zbarvené (žlutě, šedozeleně, černě) Sérologie Průkaz Ag v séru Kožní test u alergických typů onemocnění Třída: Zygomycetes (pravé plísně) Řád: Mucorales Rody: Mucor, Rhizopus, Absidia 8
Morfologie: rychle rostoucí mikromycety porůstající během 24-72 hodin inkubace celý povrch kultivačního média šedobílým, šedohnědým nebo šedočerným neseptovaným myceliem vatovitého charakteru, endospory uzavřené v kulovitém sporangiu Výskyt: kosmopolitní Přenos: inhalační, alimentární, kožní cestou Patogenita: tyto mikromycety napadají zejména pacienty s oslabenou funkcí imunitního systému (většinou diabetici, pacienti s leukemií, lymfomem), mají afinitu ke stěnám velkých arterií, které prorůstají a vytvářejí v jejich lumen živé tromby, hrozí embolie Onemocnění: zygomykóza (mukormykóza) - méně často kožní forma, častěji orgánové a systémové onemocnění (plíce, GIT, diseminace) Dimorfní houby, původci primárních hlubokých mykóz, vyskytující se v přírodě, nepřenosné z člověka na člověka, endemický výskyt na americkém kontinentě: Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis Blastomyces dermatitidis Pracoccidoides brasiliensis 9