UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra buněčné biologie BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Role lipidových raftů při průniku adenylátcyklázového toxinu Bordetella pertussis cytoplasmatickou membránou Školitel: Ing. Peter Šebo, CSc. Konzultant: Ing. Tomáš Wald Praha 2010

Tato bakalářská práce byla vypracována v Laboratoři molekulární biologie bakteriálních patogenů v Mikrobiologickém ústavu AV ČR. Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Ing. Petera Šeba, CSc. a s použitím citované literatury. V Praze dne podpis 2

Obsah 1 Seznam zkratek... 5 2 Úvod... 6 3 Cytoplasmatická membrána buněk se zaměřením na fagocyty... 7 3.1 Membránové mikrodomény... 8 3.1.1 Kaveoly... 9 3.1.2 Lipidové rafty... 10 4 Bakterie Bordetella pertussis a její interakce s hostitelem... 11 4.1 Faktory virulence B. pertussis... 11 5 Struktura a funkce CyaA... 12 6 Molekulární mechanismus interakce CyaA s membránou hostitelských buněk a translokace AC domény do cytosolu... 14 7 Mechanismy vstupu dalších toxinů plasmatickou membránou... 18 8 Návrh projektu využití GPI-ukotveného integrinu CD11b/CD18 pro objasnění role transmebránových segmentů receptoru v translokaci AC domény... 19 9 Souhrn... 20 10 Použitá literatura... 22 3

Abstrakt Bordetella pertussis způsobuje u lidí infekční onemocnění černý kašel. Tato gramnegativní bakterie produkuje adenylátcyklázový toxin (CyaA), což je člen rodiny RTX proteinů. Toxin váže CD11b/CD18 integrinový receptor myeloidních fagocytů a dopravuje do jejich cytosolu enzym adenylátcyklázu, která po aktivaci kalmodulinem katalyzuje přeměnu ATP na důležitou signální molekulu camp. Tím dojde k rychlému nárůstu camp uvnitř buňky vedoucímu k narušení mikrobicidní schopnosti fagocytů. Nejnovější výsledky ukazují, že translokace katalytické adenylátcyklázové domény napříč buněčnou membránou probíhá ve dvou krocích. Po úvodní vazbě CyaA na toxinový receptor nastane nejprve toxinem zprostředkovaný vtok vápenatých iontů do buňky, což indukuje přesun toxin-receptorového komplexu do lipidového raftu, kde dojde k translokaci adenylátcyklázové domény přes cytoplasmatickou membránu. Objevením tohoto dvoukrokového mechanismu bylo vytvořeno nové paradigma pro membránovou translokaci toxinů z rodiny RTX. Klíčová slova: Bordetella pertussis, adenylátcyklázový toxin, CyaA, lipidový raft Abstract The bacterium Bordetella pertussis is the causative agent of pertussis or whooping cough. The main virulent factor of this gram-negative bacterium is adenylate cyclase toxin, a member of the RTX protein family. After secretion, the toxin binds to CD11b/CD18 integrin receptor of myeloid phagocytic cells and consequently translocates its adenylate cyclase enzyme (AC) into the cytosol of the host cells. In the cytosol, the AC is activated by calmodulin, followed by rapid conversion of ATP into the signaling molecule camp, resulting in paralysis of bactericidal functions of phagocytic cells. Recently it was shown that translocation of the catalytic AC domain into the cytosol proceeds in two steps. After binding of CyaA to the receptor, the influx of calcium ions into the cell occurs. High local concentration of calcium induces the translocation of the CyaA- CD11b/CD18 complex into the lipid raft, where the translocation of adenylate cyclase enzyme into cytosol occurs. This work is aiming on the description of the new established paradigm dealing with membrane translocation of RTX toxins. Key words: Bordetella pertussis, adenylate cyclase toxin, CyaA, lipid raft 4

1 Seznam zkratek AC adenylátcykláza, adenylátcyklázový, -á ACP Acyl-Carrier Protein ACT adenylátcyklázový toxin ADP adenosin-5'-difosfát AK aminokyselina AMP adenosin-5'-monofosfát APC antigen prezentující buňka Asn asparagin Asp kyselina asparagová ATP adenosin-5'-trifosfát bp, bps párů bazí (z angl. base pairs) CaM kalmodulin camp adenosin-3',5'-cyklický monofosfát CTL cytotoxické T-lymfocyty CyaA adenylátcyklasový toxin bakterie Bordetella pertussis CyaC protein zprostředkovávající posttranslační modifikaci ACT DNA kyselina deoxyribonukleová DNT dermonekrotický toxin bakterie Bordetella pertussis EDTA kyselina ethylendiamintetraoctová FHA filamentózní hemaglutinin Gly glycin Ile isoleucin IS imunitní systém KDa kilodalton (jednotka molekulové hmotnosti) Leu leucin LPS lipopolysacharid Ltx leukotoxin z bakterie Actinobacillus actinomycetemcomitans Lys lysin MβCD methyl-β-cyklodextrin MHC hlavní histokompatibilní komplex (z angl. major histocompatibility complex) MK mastná kyselina/mastné kyseliny NK buňky přirozeně zabíječské buňky (z angl. natural killer) PHB prohibitin homology Phe fenylalanin PT pertusový toxin bakterie Bordetella pertussis RTX označení skupiny cytotoxinů (z angl. Repeats in ToXin) SDS dodecylsulfát sodný SDS-PAGE SDS-elektroforéza v polyakrylamidovém gelu TCT tracheální cytotoxin bakterie Bordetella pertussis X jakýkoliv aminokyselinový zbytek 5

2 Úvod Bakterie Bordetella pertussis produkuje adenylátcyklázový toxin (ACT, CyaA), který je jedním z hlavních faktorů virulence této bakterie a hraje klíčovou roli ve schopnosti Bordetella pertussis kolonizovat sliznice horních cest dýchacích (Weiss et al., 1986). CyaA je multifunkční protein (má vazebnou, enzymatickou, kanálo-tvornou a lytickou aktivitu), jehož cílovými buňkami jsou makrofágy, dendritické buňky, neutrofilní granulocyty a NK-buňky. CyaA se řadí do skupiny RTX (Repeats in ToXin) proteinů (Welch, 1995). Vazba toxinu na cytoplasmatickou membránu je zprostředkována receptorem CD11b/CD18, který se nachází na povrchu výše zmíněných myeloidních fagocytujících buněk imunitního systému (Guermonprez et al., 2001). CyaA po vazbě na cílovou membránu vytváří jednak kationselektivní kanál a jednak translokuje do cytosolu napadených buněk svoji N-koncovou adenylátcyklázovou (AC) doménu. Translokace nevyžaduje receptorem zprostředkovanou endocytózu (Bellalou et al., 1990, Hanski, 1989). Po aktivaci intracelulárním kalmodulinem katalyzuje AC doména rychlou a nekontrolovatelnou přeměnu ATP na camp, který slouží jako druhý posel buněčné signalizace (Hanski, 1989). Rapidní vzrůst intracelulární koncentrace camp pak vede k narušení signálních drah buňky, což má kromě jiného za následek i narušení baktericidních funkcí efektorových buněk imunitního systému hostitele, projevujících se neschopností fagocytózy a oxidativního vzplanutí (Hanski, 1989). Deplece ATP vede v extrémním případě k nekróze buňky (Basler et al., 2006). Působení toxinu CyaA tak umožňuje bakterii kolonizovat dýchací trakt, množit se a způsobit onemocnění (Benz et al., 1994, Rogel et al., 1992). Nedávno byl zpřesněn mechanismus, jakým CyaA translokuje svou AC doménu do cytosolu cílových buněk. Bylo objeveno, že po vazbě CyaA na receptor CD11b/CD18 hraje důležitou roli přesun komplexu toxin-integrin do lipidové mikrodomény cytoplasmatické membrány. Tyto mikrodomény bohaté na cholesterol a sfingomyelin vytvářejí zřejmě vhodné prostředí pro translokaci CyaA do cytosolu cílových buněk. Klíčovou úlohu v tomto přesunu má vstup vápníku do buňky a reorganizace aktinového cytoskeletu (Bumba et al., 2010, v tisku). V této bakalářské práci bych chtěla shrnout dosavadní poznatky o průniku adenylátcyklázového toxinu bakterie Bordetella pertussis cytoplasmatickou membránou, představit nové poznatky o vlivu membránových lipidových raftů v tomto procesu a porovnat mechanismus průniku s některými dalšími toxiny. 6

3 Cytoplasmatická membrána buněk se zaměřením na fagocyty Biologické membrány vytvářejí přirozené bariéry, které oddělují buňku od vnějšího prostředí a umožňují selektivní výměnu látek, iontů a metabolitů mezi vnějším a vnitřním prostředím. U eukaryot jsou na rozdíl od prokaryot membrány i uvnitř buňky, což má za následek kompartmentalizaci cytosolického prostoru do jednotlivých organel. Buněčné membrány jsou tvořeny dvojvrstvou amfipatických lipidických molekul, které se uspořádávají do termodynamicky nejvýhodnějších útvarů vůči vodě. Modelů popisujících strukturu buněčných membrán bylo v minulosti navrženo několik. Ukázkovým příkladem se stal model tekuté mozaiky, který popisuje plasmatickou membránu jako tekutou fázi, ve které se difuzním pohybem volně pohybují molekuly lipidů a bílkovin (Singer et al., 1972). Tento model byl později upraven a rozšířen tak, aby odpovídal novým poznatkům o různých typech membránových lipidů. V současné době je navržen nový model uspořádání biologických membrán, ve kterém se počítá s přítomností tzv. membránových mikrodomén (Simons et al., 1997). Fagocytické buňky (neutrofily, monocyty a jejich tkáňová forma makrofágy, myeloidní dendritické buňky a NK-buňky) na svém povrchu exprimují integrin CD11b/CD18. Tento receptor je rozpoznáván adenylátcyklázovým toxinem Bordetella pertussis (Guermonprez et al., 2001). Integriny tvoří velkou skupinu adhezivních molekul, z nichž některé váží membránové ligandy, jiné komponenty mezibuněčné hmoty. Receptor CD11b/CD18 rozeznává více než třicet ligandů proteinového i neproteinového charakteru. Funkcí integrinů je také zprostředkovat pohyb buněk. Integrin CD11b/CD18 je transmembránový glykoprotein. Skládá se ze dvou nekovalentně asociovaných podjednotek CD11b (α M ) a CD18 (β 2 ) a patří do rodiny β 2 integrinů. Ty se označují jako leukocytární integriny, protože jsou exprimovány pouze na leukocytech. Členy této rodiny jsou CD11a/CD18 (nazývaný též α L β 2, LFA-1), CD11b/CD18 (α M β 2, CR3, Mac- 1, Mo-1), CD11c/CD18 (α x β 2, p150/95) a CD11d/CD18 (α D β 2 ) (Harris et al., 2000). Obě podjednotky integrinu, CD11b i CD18, mají rozsáhlou extracelulární doménu, na kterou navazuje krátký transmembránový úsek a krátká cytosolická část. Vrchol extracelulární domény, a zároveň vazebné místo pro ligand, tvoří I-doména podjednotky CD11b, respektive I-like doména podjednotky CD18. Vazebné místo pro ligand existuje ve dvou konformačních stavech. Je-li integrin v klidovém (neaktivním) stavu, je extracelulární doména ohnutá směrem k membráně. Při přechodu integrinu do aktivovaného stavu se extracelulární doména 7

narovnává, a tím dochází k napřímení celého integrinu. Přechod integrinu do aktivovaného stavu je indukován různými stimuly, například vazbou ligandu. Přechodem do aktivovaného stavu dojde ke konformační změně, která způsobí odlišnou vazbu buněčných proteinů na cytosolické části integrinových podjednotek CD11b a CD18. To vede ke spuštění signalizačních kaskád CD11b/CD18 (Hynes, 2002). Přechod integrinu CD11b/CD18 z klidového do aktivovaného stavu znázorňuje model na obrázku 1. Obr. 1: Model přechodu integrinu CD11b/CD18 z klidového do aktivovaného stavu převzato z (Hynes, 2002), upraveno. Integrin CD11b/CD18 je dále schopen v cytoplasmatické membráně buňky interagovat s různými GPI-vázanými proteiny, které postrádají cytosolickou doménu, a poskytnout těmto povrchovým molekulám schopnost transmembránové signalizace (Agramonte-Hevia et al., 2002). 3.1 Membránové mikrodomény Studium lipidových raftů (membránových mikrodomén) začalo poměrně nedávno, když byla objevena schopnost detergentů solubilizovat membránu. Lipidové rafty jsou odolné vůči působení slabých neiontových detergentů (prvně byl použit 1% Triton X-100), a proto byly popsány jako detergent resistentní (insensitivní) či Triton insensitivní membránové domény (DRMs, DIMs, TIMs). Po přidání detergentu k buněčnému homogenátu a centrifugaci na hustotním sacharózovém gradientu dojde k oddělení DRMs od rozpustných složek membrány 8

(Jacobson et al., 1999). Oblast raftu, která je tvořená sfingolipidy a cholesterolem je tlustší, než okolní fluidní část plasmatické membrány. Dosud není zcela jasné, jestli je zesílen pouze vnější list membrány v místě raftu nebo i vnitřní list. 3.1.1 Kaveoly První nehomogenita buněčné membrány byla pozorována již v 50. letech 20. století díky rozvoji elektronové mikroskopie. Jednalo se o tzv. kaveoly (Obr. 2), které se později ukázaly jako typ lipidového raftu (Rothberg et al., 1992). Jsou to drobné jamkovité vchlípeniny o rozměrech 50-100 nm, které byly doposud nalezeny pouze v plasmatické membráně určitých buněk (Lisanti et al., 1994). Obr. 2: Kaveoly na vnitřní straně plasmatické membrány. Ve výřezu je pro srovnání klatrinový váček. Převzato z (Rothberg et al., 1992). Pro kaveoly je typická přítomnost strukturního proteinu, který se nazývá kaveolin (Razani et al., 2002), a který odpovídá za zakřivení membrány a zformování kaveoly o dané velikosti a tvaru (Obr. 3). C-terminální konec molekuly kaveolinu je posttranslačně modifikován palmitoylací, která pravděpodobně souvisí s lokalizací proteinů do lipidových raftů (podobně jako myristoylace celé řady bílkovin) (Galbiati et al., 1999). N-terminální cytosolická doména kaveolinu může interagovat s jinými proteiny. Tyto proteiny se jednak soustředí v oblasti kaveol, navíc vazba na kaveolin může mít jak aktivační, tak inhibiční vliv na jejich signalizační funkci (Lisanti et al., 1994, Jacobson et al., 1999). Obr. 3: Znázornění strukturního proteinu kaveolinu, který formuje tvar kaveoly. Převzato z (Razani et al., 2002), upraveno. 9

3.1.2 Lipidové rafty Pod pojmem lipidové rafty se skrývá širší spektrum membránových struktur, které primárně nepotřebují ke svému utvoření ani kaveolin, ani jiné proteiny. Velikost lipidových raftů je desítky až stovky nm. Lipidy jednotlivých typů jsou schopné se od sebe oddělit a dochází k tzv. laterální segregaci lipidů, čili k oddělení fází, kdy fosfolipidy s dlouhými MK (nasycenými, rovnými) v membráně spontánně asociují. Vytvářejí tak shluky membránových segmentů vykazujících nižší fluiditu membrány (jsou rigidnější). V lipidových raftech se vyskytují specificky sfingolipidy a cholesterol (Ahmed et al., 1997). Sfingolipid je molekula aminoalkoholu (sfingosinu) a jedné MK, která je většinou dlouhá 18 a více uhlíků, a většinou je nasycená. Rovné, nasycené řetězce molekul se vedle sebe srovnají a vytvoří organizovanější strukturu než nenasycené MK. Sfingolipidy byly doposud nalezeny pouze ve vnějším listu plasmatické membrány. Předpokládá se, že vnitřní list raftu je tvořen glycerofosfolipidy, které mají také nasycené rovné dlouhé řetězce (Pike, 2004). Cholesterol je velmi významnou složkou raftů, protože struktura cholesterolu je důležitá pro fyzikální vlastnosti membrány. Díky svému neohebnému heterocyklickému jádru zabraňuje pohybu řetězců mastných kyselin v membráně, a snižuje tak tekutost membrán. Atomy v heterocyklu cholesterolu jsou rigidní a způsobují křehkost membrány, protože neumožňují plasticitu. Cholesterol má dále význam pro tloušťku membrány. Pokud ho vyextrahujeme z buňky, tak se domény rozpadají (Navratil et al., 2003). Proteiny přítomné v lipidových raftech mohou být periferní nebo integrální. Periferní proteiny jsou vázány na povrchu membrány pomocí protein-proteinových, případně proteinlipidových interakcí (Pike, 2004). V membránových doménách jsou soustředěny i rozličné signální systémy, především povrchové receptory, které jsou do plasmatické membrány vázány prostřednictvím glykosylfosfatidylinositolové kotvy (GPI). Přítomnost GPI vázaných bílkovin byla zjištěna hned v počátcích studia lipidových raftů (Jacobson et al., 1999, Lisanti et al., 1994, Stefanova et al., 1991). GPI kotva je jedním ze signálů pro lokalizaci do raftů. Jednotlivé kotvy se mohou lišit typem mastné kyseliny a ukazuje se, že různé typy GPI vázaných bílkovin jsou lokalizovány do různých typů raftů (Pike, 2004). 10

4 Bakterie Bordetella pertussis a její interakce s hostitelem Bordetella pertussis je striktně aerobní gramnegativní bakterie, která se přenáší z nakažené osoby na zdravého člověka kapénkovou infekcí. U lidí způsobuje infekční onemocnění horních cest dýchacích - černý nebo též dávivý kašel. Bakterie byla poprvé izolována J. Bordetem a O. Gengou v roce 1906. Bordetella pertussis nevstupuje do krevního řečiště a nerozšiřuje se do dalších tkání (Weiss et al., 1986). 4.1 Faktory virulence B. pertussis Bakterie B. pertussis produkuje několik faktorů virulence, díky nimž je schopna unikat aktivní imunitní odpovědi a usídlit se v hostiteli. Faktory virulence lze rozdělit na toxiny a adheziny (Obr. 4). Do skupiny adhezinů (na obrázku znázorněny modře) patří proteiny fimbrií, povrchový protein pertaktin, tracheální kolonizační faktor (TCF) a filamentózní hemaglutinin (FHA). Adheziny zajišťují vazbu bakterie na povrch buněk řasinkového respiračního epitelu a fagocytujících buněk. Druhou skupinou virulenčních faktorů jsou toxiny produkované bakterií (znázorněny červeně a hnědě), kterými jsou pertusový toxin (PT), tracheální cytotoxin (TCT), dermonekrotický toxin (DNT) a adenylátcyklázový toxin (CyaA, ACT) (Weiss et al., 1986). Obr. 4: Faktory virulence gramnegativní bakterie Bordetella pertussis. Převzato a upraveno z (Locht, 2001). 11

CyaA se řadí mezi RTX toxiny. RTX proteiny jsou sekretovány celou řadou gramnegativních bakterií, z nichž většina patří mezi lidské, živočišné nebo rostlinné patogeny (Welch, 1995). Označení RTX (Repeats in ToXin) vyplývá ze skutečnosti, že všechny proteiny této skupiny obsahují v C-koncové části molekuly opakující se nonapeptidové sekvence, které jsou schopné vázat Ca 2+. Skupina RTX toxinů zahrnuje cytotoxiny, které jsou dále rozděleny na hemolyziny a leukotoxiny. Hemolyziny jsou schopné lyzovat různé typy eukaryotních buněk, kdežto cílová specifita leukotoxinů je omezena na úzké spektrum buněk imunitního systému. RTX toxiny tvoří v cytoplasmatické membráně cílových buněk póry. Pro jejich biologickou aktivaci je nezbytná posttranslační modifikace mastnou kyselinou (Basar et al., 1999) a přítomnost vápenatých iontů (Welch, 1995). CyaA je sekretován z cytosolu bakterie do prostředí pomocí sekrečního aparátu typu I, který rozpoznává signální sekvenci umístěnou na C-konci proteinu (Rogel et al., 1992). 5 Struktura a funkce CyaA Adenylátcyklázový toxin je multifunkční protein o molekulové hmotnosti 177 kda, který je složen z 1706 aminokyselinových zbytků a je rozdělen na dvě základní funkční domény adenylátcyklázovou a hemolyzinovou (Benz et al., 1994) (Obr. 5). Obr. 5: Schematické znázornění molekuly CyaA. 1) Adenylátcyklázová doména Aminokyselinové zbytky 1-400 na N-konci CyaA tvoří invazivní katalytickou adenylátcyklázovou doménu, která není součástí žádného z dalších známých RTX toxinů. Tuto doménu je CyaA schopen dopravovat přímo přes cytoplasmatickou membránu do cílových buněk. V bezprostřední blízkosti aminokyselinového zbytku 242 je vazebné místo 12

pro kalmodulin, který je zapotřebí pro aktivaci adenylátcyklázy. AC po aktivaci katalyzuje nekontrolovatelnou přeměnu vnitrobuněčného ATP na camp (adenosin-3',5'-cyklický monofosfát) (Hanski, 1989). Enzymatická aktivita AC domény se v cytoplasmě eukaryotických buněk díky vazbě kalmodulinu zvyšuje více než 1000 (Wolff et al., 1980). Tím dochází v buňkách k rychlému nárůstu koncentrace camp (až do 2 mmol/l), což vede k narušení baktericidních funkcí efektorových buněk imunitního systému a k apoptóze makrofágů (Basler et al., 2006). Díky stavu lokální imunosuprese v místě kolonizace patogenem tak dochází k rychlejšímu rozvoji onemocnění (Benz et al., 1994, Rogel et al., 1992). 2) Hemolyzinová doména Druhá, C-koncová část toxinu (AK 400-1706) se nazývá RTX hemolyzin a je homologní jak svojí primární strukturou, tak funkcí s ostatními RTX cytolyziny (Weiss et al., 1986). Tato část toxinu zabezpečuje vazbu CyaA s cytoplasmatickou membránou cílových buněk a průnik AC domény do jejich cytosolu (Sakamoto et al., 1992, Benz et al., 1994). RTX hemolyzinová doména obsahuje několik subdomén: a) Hydrofobní doména se nachází mezi aminokyselinovými zbytky 500-700 a obsahuje několik po sobě jdoucích hydrofobních AK sekvencí vytvářejících transmembránové úseky, které jsou důležité pro tvorbu kation-selektivních kanálů v cytoplasmatické membráně cílových buněk. Transport iontů těmito kanály může vyvolat vstup vody do buněk a může způsobit osmotickou lyzi napadených buněk (Benz et al., 1994, Rogel et al., 1992, Sakamoto et al., 1992). Nicméně ve srovnání s ostatními hemolyziny RTX rodiny je tato hemolytická aktivita CyaA velmi nízká, což naznačuje, že hlavní úloha hemolyzinové části je zprostředkovat dopravu katalytické AC domény do cytosolu cílové buňky (Bellalou et al., 1990). b) Za hydrofobní doménou následuje přibližně 300 AK zbytků dlouhá acylační doména, jejíž C-koncová část je nutná pro posttranslační modifikaci toxinu. CyaA je totiž syntetizován jako inaktivní protoxin a kovalentní modifikace je nutná pro jeho aktivaci. Posttranslační modifikaci zajišťuje bakteriální protein CyaC o velikosti 22 kda. CyaC funguje jako acyltransferáza katalyzující přenos acylu z acyl-acp (Acyl-Carrier Protein) na protoxin (Rogel et al., 1992). Aktivace spočívá v tom, že zbytek kyseliny palmitové je kovalentně navázán prostřednictvím amidové vazby k ε-aminoskupině lysinových zbytků 860 a 983 (Basar et al., 1999). 13

c) Na C-koncové části proteinu se nachází mezi aminokyselinovými zbytky 1000-1600 doména bohatá na glycin a aspartát, která je složena ze 45 repetitivních sekvencí nonapeptidů typu X-(Leu/Ile/Phe)-X-Gly-Gly-X-Gly-(Asp/Asn)-Asp. Na této doméně jsou vazebná místa pro vápenaté ionty. Vazba Ca 2+ vede k výrazným konformačním změnám v molekule CyaA, které jsou nezbytné jak pro hemolytickou aktivitu, tak pro translokaci katalytické AC domény do buněk (Rogel et al., 1992, Rose et al., 1995). Podle afinity k vápenatým iontům mohou být vazebná místa rozdělena do dvou tříd. Jedny vážou Ca 2+ s vysokou afinitou, prakticky ireversibilně. Jejich obsazení je nutné pro inzerci toxinu do membrány cílových buněk, ale také pro tvorbu iontových kanálů. Druhou třídu tvoří nízkoafinní vazebná místa. Jejich obsazení je nutné pouze pro přenos katalytické AC domény do cytosolu cílových buněk, pro tvorbu iontových kanálů však nikoliv (Rose et al., 1995). d) Poslední část tvoří C-koncový sekreční signál (Weiss et al., 1986, Sebo et al., 1993). 6 Molekulární mechanismus interakce CyaA s membránou hostitelských buněk a translokace AC domény do cytosolu Trojrozměrná struktura CyaA není zatím známa a i detaily mechanismu translokace toxinu přes lipidovou dvojvrstvu buněčných membrán zůstávají stále neobjasněny. Základní mechanismus spočívá v inzerci AC domény do cytoplasmatické membrány pomocí hemolyzinové části toxinu a v její translokaci do cytosolu hostitelské eukaryotní buňky (Bellalou et al., 1990, Sakamoto et al., 1992). CyaA pro prvotní interakci s cílovou membránou zřejmě nepotřebuje žádný specifický receptor. Vazba toxinu je zprostředkovaná pravděpodobně membránovými gangliosidy (Gordon et al., 1989) a glykoproteiny (Morova et al., 2008). Ty by měly umožnit přiblížení hydrofobní domény CyaA dostatečně blízko k lipidické dvojvrstvě s následným zanořením této domény do membrány (Gordon et al., 1989, Rogel et al., 1992). Přichycení přes glykoproteiny a gangliosidy má ale velmi nízkou afinitu. Celý proces vyžaduje strukturní integritu molekuly, kooperaci všech oblastí C-koncové části CyaA, posttranslační modifikaci mastnou kyselinou (palmitoylaci) a fyziologickou koncentraci Ca 2+ (Ladant et al., 1992). Mnohem účinnější je vazba CyaA zprostředkovaná specifickým receptorem CD11b/CD18 (konkrétně vazba na α řetězec tohoto integrinu, popsán výše v kapitole 3.2.). CyaA patří k nemnoha bakteriálním toxinům schopným translokovat svojí enzymatickou adenylátcyklázovou doménu přímo přes plasmatickou membránu do cytosolu 14

napadených buněk jiným mechanismem, než po receptorem zprostředkované endocytóze (Bellalou et al., 1990, Hanski, 1989). Pomocnou roli při průniku AC domény CyaA do cytosolu pravděpodobně hraje negativní klidový membránový potenciál, který je na plasmatické membráně většiny eukaryotních buněk. Jeho experimentálně navozené obrácení totiž inhibuje průnik toxinu do cytosolu (Otero et al., 1995). Původní představa o translokaci adenylátcyklázové domény do cytosolu byla taková, že katalytická AC doména proniká do buněk prostřednictvím transmembránového iontového kanálu, který byl vytvořen hydrofobní doménou po zanoření toxinu do membrány (Rogel et al., 1992). Tento předpoklad byl vyvrácen po zjištění průměru vznikajícího membránového póru, který je v rozmezí 0,6-0,8 nm a je striktně selektivní pro malé monovalentní a bivalentní kationty (Benz et al., 1994). Takový průměr kanálu je příliš malý na to, aby jím mohl procházet polypeptidový řetězec, i kdyby byl zcela rozvinutý. Dalším argumentem svědčícím proti průniku AC domény přes iontový kanál jsou výsledky pozorování, které naznačují, že přenos AC domény do buněk je realizován převážně monomery CyaA, zatímco tvorba membránových kanálů vyžaduje oligomerizaci molekul toxinu (Betsou et al., 1993). Je tedy pravděpodobné, že tvorba pórů následuje až po průniku AC domény do buněk, nebo probíhá současně s ním, ale mnohem pomaleji, v důsledku nutnosti oligomerizace CyaA (Otero et al., 1995). Průnik AC domény do buněk i tvorba kation-selektivního póru v membráně jsou tedy dva různé procesy s odlišnými mechanismy (Sakamoto et al., 1992, Osickova et al., 1999, Basler et al., 2007). Hypotéza, že translokace AC domény CyaA nejspíš vůbec nezávisí na schopnosti toxinu tvořit póry, byla upřesněna v letošní publikaci Osičkové a kolektivu. Pomocí mutace byl vytvořen konstrukt, který byl v podstatě neschopný permeabilizovat buňky formováním CyaA pórů a vyvolat únik draslíku, zatímco měl plnou schopnost translokovat AC doménu napříč buněčnou membránou (Osickova et al., 2010). CyaA se vyskytuje ve dvou konformacích a může reagovat s plasmatickou membránou současně dvěma různými způsoby, přičemž obě konformace se váží na receptor CD11b/CD18. První konformací je tzv. translokační prekurzor, který po inzerci do membrány zůstává monomerní a translokuje AC doménu do cytosolu. Současně umožňuje vstup Ca 2+ do buňky. AC doména je po navázání kalmodulinu v cytosolu schopna katalyzovat přeměnu ATP na camp. Druhý prekurzor CyaA (prekurzor póru) v membráně oligomerizuje a tvoří kation-selektivní pór, který způsobuje osmotickou lyzi buňky (Obr. 6). 15

Obr. 6: Model interakce CyaA s plasmatickou membránou. Převzato z (Basler et al., 2007), upraveno. Nedávno bylo také ukázáno, že vstup extracelulárního vápníku do buněčného cytosolu je doprovodným jevem translokace AC domény do buněk (Fiser et al., 2007). Současný pracovní model předpovídá, že jak vstup Ca 2+, tak AC translokace využívají stejný amfipatický transmembránový segment (α-helix 502-522 a α-helix 565-591 ) v doméně formující pór. Tyto segmenty obsahují dva páry negativně nabitých glutamátových zbytků (Glu 509 /Glu 516 a Glu 570 /Glu 581 ), které kontrolují translokaci pozitivně nabitých AC domén, formaci oligomerních pórů CyaA a kationtovou selektivitu těchto pórů (Basler et al., 2007, Osickova et al., 1999). Substitucí glutamátů prolinovými zbytky dojde ke zničení helixové struktury, což má za následek posun rovnováhy mezi AC translokací a pór formující aktivitou CyaA na buněčné membráně (Basler et al., 2007, Osickova et al., 1999, Vojtova-Vodolanova et al., 2009). Translokaci AC domény lze zcela zablokovat snížením teploty nebo vyvázáním Ca 2+ z extracelulárního prostředí (Rogel et al., 1992, Rose et al., 1995). V současnosti nejnovější práce (Bumba et al., 2010, v tisku) postulovala dvoukrokový mechanismus translokace adenylátcyklázové domény CyaA do fagocytů (zobrazeno na obrázku 7). Ukázala, že v prvním kroku váže CyaA integrinový receptor CD11b/CD18, který je lokalizovaný rovnoměrně po celé membráně, mimo lipidové rafty. Integrin má cytoplasmatickou část podjednotky CD18 svázanou s aktinovým cytoskeletem přes protein talin. Po interakci s receptorem vytvoří CyaA tzv. translokační intermediát, který se zapustí do lipidové dvojvrstvy v buněčné membráně. Částečné pronikání adenylátcyklázové domény do membrány je doprovázeno tvorbou póru a vzniká tak krátkodobě otevřená cesta pro vtok 16

Ca 2+ do cytosolu. Vstup extracelulárních vápenatých iontů do buněk indukuje aktivaci Ca 2+ -dependentní proteázy calpain, která je lokalizována v submembránovém kompartmentu, a která štěpí protein talin navázaný na aktinový cytoskelet. Dojde k uvolnění komplexu toxinintegrin z asociace k aktinovému cytoskeletu. Následkem toho se komplex přesunuje do lipidového raftu. Jiné ukládání lipidů a specifické, cholesterolem rozvolněné prostředí raftu umožňuje kompletní translokaci pozitivně nabité AC domény přes buněčnou membránu. Proces je řízen negativním gradientem membránového potenciálu. V souvislosti s cholesterolem bylo také pozorováno, že jeho úbytek z buněčných membrán neměl vliv na úroveň vazby CyaA na CD11b-exprimující buňky, zatímco translokace AC domény napříč lipidovou dvojvrstvou buněčné membrány na obsahu cholesterolu závisela silně (Bumba et al., 2010, v tisku). Jakmile se AC doména ocitne na cytosolické straně buněčné membrány, tak je odstřižena od RTX motivu CyaA pomocí proteázy přítomné uvnitř buňky (Bumba et al., 2010, v tisku). Vazba cytosolického kalmodulinu (CaM) následně aktivuje AC enzym a katalyzuje neregulovanou přeměnu ATP na camp. Nadměrná produkce camp, případně spotřeba ATP, mohou vést k apoptóze nebo až k nekróze buňky. Navíc rušení buněčné signalizace, vyskytující se již při malých koncentracích toxinu (1 ng/ml a méně), efektivně zabraňuje oxidačnímu vzplanutí neutrofilů a fagocytů, a proto umožňuje bakterii přežít a kolonizovat hostitele, jak již bylo popsáno výše. Tyto výsledky umožnily navrhnout nový model mechanismu CyaA a prohloubily chápání jeho role ve virulenci B. pertussis. Obr. 7: Model znázorňující účast lipidového raftu při translokaci CyaA skrz buněčnou membránu. Převzato z (Bumba et al., 2010, v tisku), upraveno. 17

7 Mechanismy vstupu dalších toxinů plasmatickou membránou Zdá se, že i další bakteriální proteinové toxiny mohou používat lipidové rafty jako bránu k buněčnému vstupu. Na rozdíl od CyaA, který je schopný asociovat s rafty pouze po vazbě a mobilizaci svého receptoru CD11b/CD18, který není primárně součástí raftů, mohou některé ostatní toxiny využívat jako specifický receptor přímo část raftových komponentů, jako jsou cholesterol, sfingolipidy nebo GPI vázané proteiny (Lafont et al., 2004). Jedním z takových toxinů, který využívá lipidové rafty, je leukotoxin (Ltx) bakterie Actinobacillus actinomycetemcomitans, patřící také do skupiny RTX proteinů. Ltx se váže na integrin LFA-1 (CD11a/CD18), exprimovaný na lidských leukocytech a vyvolává změnu Ca 2+ koncentrace v buňce. Avšak na rozdíl od CyaA, který zajišťuje vstup extracelulárního vápníku do cytoplasmy, tento toxin způsobí po interakci s receptorem uvolnění Ca 2+ z vnitřních buněčných zásobáren (Taichman et al., 1991). To vede opět k aktivaci proteázy calpain, rozštěpení talinu (který kotví receptor k aktinovému cytoskeletu) a k mobilizaci komplexu toxin-integrin do oblastí plasmatické membrány bohatých na cholesterol (lipidových raftů). Asociace Ltx/LFA-1 s lipidovými rafty je zásadní pro buněčnou lyzi, protože rozpuštění raftů pomocí methyl-β-cyklodextrinu (MβCD) zruší schopnost Ltx zabíjet cílové buňky. Cytotoxicita Ltx je obnovena až ve chvíli, kdy je raft rekonstituován (Fong et al., 2006). Dalším toxinem využívajícím lipidové mikrodomény je antraxový toxin produkovaný Bacillus anthracis. Tento toxin vyvolává pohlcení svého receptoru pomocí klatrindependentní endocytózy, která je zprostředkována lipidovými rafty (Abrami et al., 2003). Toxin je složen ze tří podjednotek, které se nazývají edema faktor (EF), letální faktor (LF) a protektivní antigen (PA). Protektivní antigen antraxového toxinu se váže na buněčný receptor ATR (Antrax Toxin Receptor). Po navázání je PA štěpen membránově vázanými proteázami na dvě části, PA63 a PA83. PA63 je stále navázán na ATR a následně endocytován, PA83 zůstává na buněčném povrchu. PA63 může oligomerizovat a tvořit heptametry. Komplex heptamer PA-ATR se začne shlukovat v lipidových raftech. Na heptamer PA se naváže EF a LF, a tento komplex je transportován do endosomu. Nízké ph v endosomu vyvolá konformační změnu PA a tvorbu kanálu, který slouží k doručení EF a LF do cytosolu (Abrami et al., 2003). Edema faktor, což je kalmodulin-dependentní 18

adenylátcykláza, způsobuje v cytosolu přeměnu ATP na camp. Podobně jako u CyaA je pro tuto přeměnu nutný extracelulární Ca 2+. Zvýšením koncentrace Ca 2+ v cytosolu dochází k aktivaci eukaryotického kalmodulinu, který je klíčový pro aktivaci adenylátcyklázové aktivity toxinu (Kumar et al., 2002). LF je metaloproteáza, která štěpí všechny MAPK kinázy a je zodpovědná za buněčnou smrt makrofágů (Vitale et al., 1998). Stejně jako v případě CyaA dojede k asociaci antigenu s receptorem mimo raft. Receptor ATR má malou, pokud vůbec nějakou afinitu pro rafty, a tudíž se zdá, že k asociaci s raftem ho přiměje až vazba s heptametrem PA. Uměle navozená změna raftové integrity zabraňuje doručení LF/EF do cytosolu (Abrami et al., 2003). Posledním toxinem, který bych chtěla uvést jako příklad v souvislosti s uplatněním lipidových raftů, je aerolysin produkovaný bakterií Aeromonas hydrophila. Toxin je sekretován jako rozpustný prekurzor proaerolysin, který difunduje směrem k cílové buňce (van der Goot et al., 1993). Proaerolysin se váže na receptor, který je v membráně uchycen prostřednictvím GPI kotvy a vyskytuje se převážně v lipidových raftech, i když byl detekován i mimo tuto oblast (Abrami et al., 1999). Po vazbě na receptor je protoxin aktivován odštěpením terminálního peptidu pomocí proteáz produkovaných bakteriemi (Howard et al., 1985). Vazbou aerolysinu na receptory, které jsou lokalizovány převážně v membránových mikrodoménách, dojde k zakoncentrování toxinu na jednom místě. To má význam hlavně pro oligomerizaci toxinu. Oligomerizací vzniká amfipatický komplex podobný kruhu, který tvoří v membráně pór, kterým dochází k úniku malých molekul a iontů, jako je K + nebo Ca 2+. To vede k poškození membrány a k následné lyzi cílových buněk. Rozrušení mikrodomén brání shlukování toxinu na povrchu buňky a inhibuje oligomerizaci (Abrami et al., 1999). 8 Návrh projektu využití GPI-ukotveného integrinu CD11b/CD18 pro objasnění role transmebránových segmentů receptoru v translokaci AC domény Jak bylo popsáno výše, CyaA se váže s vysokou afinitou na integrinový receptor CD11b/CD18, který vystupuje v buněčné membráně jako zprostředkovatel translokace toxinu. Ale funkční význam transmembránové a cytosolické části integrinového receptoru je doposud neznámý. Je důležité položit otázku, jaká je úloha transmembránové domény pro vazbu CyaA na receptor CD11b/CD18 a vstup toxinu do buňky. 19

Bylo předpovězeno, že transmembránový segment CD11b a CD18 podjednotky může interagovat s transmembránovým segmentem CyaA a umožnit tak dočasný vstup vápníku přes buněčnou membránu. Hypotézu, že je transmembránová doména receptoru CD11b/CD18 opravdu potřeba pro vazbu CyaA, lze testovat pomocí variant integrinu, kde bude tato doména nahrazena sekvencí tzv. Decay accelerating factor for komplement (DAF), která signalizuje přichycení proteinu pomocí GPI kotvy v lipidových raftech. S použitím této varianty by bylo možné ověřit, zda je interakce transmembránové části receptoru s transmembránovou částí CyaA potřebná pro průnik CyaA do membrány, translokaci AC domény a tvorbu póru. Stejně tak by bylo možné ověřit přítomnost GPI vázaného integrinu v lipidových raftech pomocí sacharózové gradientové centrifugace a schopnost translokace AC domény do cytosolu. Této problematice bych se chtěla věnovat ve své diplomové práci. 9 Souhrn Ve své bakalářské práci jsem se snažila shrnout dosavadní poznatky o průniku CyaA bakterie Bordetella pertussis cytoplasmatickou membránou, představit nové poznatky o vlivu lipidových raftů v tomto procesu a porovnat mechanismus průniku s některými dalšími toxiny. Jsou to právě lipidové rafty, které hrají klíčovou roli v translokaci AC domény CyaA do cytosolu. Významný pokrok v chápání mechanismu translokace přinesla práce Bumby a kolektivu (Bumba et al., 2010, v tisku). Ta odhalila, že adenylátcyklázový toxin se nejprve naváže na integrin CD11b/CD18, to indukuje vtok extracelulárního vápníku do cytosolu a současně dojde k přesunu komplexu toxin-receptor do lipidového raftu. Významnou složkou lipidových raftů je cholesterol, který díky své struktuře umožní rozvolnění této mikrodomény. Takové prostředí je příznivé pro dokončení translokace AC domény přes buněčnou membránu. Z dalších toxinů využívá podobný mechanismus například Ltx produkovaný bakterií Actinobacillus actinomycetemcomitans, patřící také do RTX rodiny proteinů. Ten však způsobuje uvolnění cytosolického vápníku a nikoliv extracelulárního, jako v případě CyaA. Uvolnění Ca 2+ iontů pak vede ke stejné posloupnosti dějů, jako je tomu u CyaA. Také antraxový toxin bakterie Bacillus anthracis využívá lipidové rafty ke zprostředkování svého toxického účinku. Průnik jeho adenylátcyklázové domény do cytosolu hostitelské buňky je zajištěn klatrin-dependentní endocytózou receptoru ATR, na který je 20

prostřednictvím protektivního antigenu tato doména navázána. K endocytóze dochází v oblasti lipidových raftů. Aerolysinový toxin bakterie Aeromonas hydrophila se váže na receptor, který je v membráně uchycen prostřednictvím GPI kotvy. Tato forma uchycení se vyskytuje převážně v lipidových raftech. Vazbou toxinu na receptory, které jsou díky lokalizaci v raftech nahloučeny blízko sebe, dojde k zakoncentrování aerolysinu a usnadnění jeho oligomerizace. Ta je nutná pro tvorbu pórů v membráně, vedoucí k lyzi hostitelských buněk. Vzhledem k tomu, že se doposud nepodařilo zcela objasnit funkční význam transmembránové a cytosolické domény integrinu CD11b/CD18 pro vazbu CyaA na receptor a vstup toxinu do buňky, tak bych se této problematice chtěla věnovat ve své diplomové práci. 21

10 Použitá literatura Abrami, L., Liu, S.H., Cosson, P., Leppla, S.H. and van der Goot, F.G. (2003). Anthrax toxin triggers endocytosis of its receptor via a lipid raft-mediated clathrin-dependent process. Journal of Cell Biology 160, 321-328. Abrami, L. and van der Goot, F.G. (1999). Plasma membrane microdomains act as concentration platforms to facilitate intoxication by aerolysin. Journal of Cell Biology 147, 175-184. Agramonte-Hevia, J., Gonzalez-Arenas, A., Barrera, D. and Velasco-Velazquez, M. (2002). Gram-negative bacteria and phagocytic cell interaction mediated by complement receptor 3. Fems Immunology and Medical Microbiology 34, 255-266. Ahmed, S.N., Brown, D.A. and London, E. (1997). On the origin of sphingolipid/cholesterolrich detergent-insoluble cell membranes: Physiological concentrations of cholesterol and sphingolipid induce formation of a detergent-insoluble, liquid-ordered lipid phase in model membranes. Biochemistry 36, 10944-10953. Basar, T., Havlicek, V., Bezouskova, S., Halada, P., Hackett, M. and Sebo, P. (1999). The conserved lysine 860 in the additional fatty-acylation site of Bordetella pertussis adenylate cyclase is crucial for toxin function independently of its acylation status. Journal of Biological Chemistry 274, 10777-10783. Basler, M., Knapp, O., Masin, J., Fiser, R., Maier, E., Benz, R., et al. (2007). Segments crucial for membrane translocation and pore-forming activity of Bordetella adenylate cyclase toxin. Journal of Biological Chemistry 282, 12419-12429. Basler, M., Masin, H., Osicka, R. and Sebo, P. (2006). Pore-forming and enzymatic activities of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin synergize in promoting lysis of monocytes. Infection and Immunity 74, 2207-2214. Bellalou, J., Sakamoto, H., Ladant, D., Geoffroy, C. and Ullmann, A. (1990). Deletions affecting hemolytic and toxin activities of Bordetella-pertussis adenylate cyclase. Infection and Immunity 58, 3242-3247. Benz, R., Maier, E., Ladant, D., Ullmann, A. and Sebo, P. (1994). Adenylate cyclase toxin (CyaA) of Bordetella pertussis. Evidence for the formation of small ion-permeable channels and comparison with HlyA of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry 269, 27231-27239. Betsou, F., Sebo, P. and Guiso, N. (1993). CyaC-mediated activation is important not only for toxic but also for protective activities of Bordetella pertussis adenylate cyclasehemolysin. Infection and Immunity 61, 3583-3589. Bumba, L., Masin, J., R., F. and P., S. (2010, v tisku). Bordetella adenylate cyclase toxin mobilizes its β2 integrin receptor into lipid rafts to accomplish translocation across target cell membrane in two steps. PLoS Pathogens. Fiser, R., Masin, J., Basler, M., Krusek, J., Spulakova, V., Konopasek, I. and Sebo, P. (2007). Third activity of Bordetella adenylate cyclase (AC) toxin-hemolysin - Membrane translocation of AC domain polypeptide promotes calcium influx into CD11b(+) monocytes independently of the catalytic and hemolytic activities. Journal of Biological Chemistry 282, 2808-2820. Fong, K.P., Pacheco, C.M.F., Otis, L.L., Baranwal, S., Kieba, I.R., Harrison, G., et al. (2006). Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin requires lipid microdomains for target cell cytotoxicity. Cellular Microbiology 8, 1753-1767. Galbiati, F., Volonte, D., Meani, D., Milligan, G., Lublin, D.M., Lisanti, M.P. and Parenti, M. (1999). The dually acylated NH2-terminal domain of G(i1 alpha) is sufficient to target a green fluorescent protein reporter to caveolin-enriched plasma membrane domains - 22

Palmitoylation of caveolin-1 is required for the recognition of dually acylated G- protein alpha subunits in vivo. Journal of Biological Chemistry 274, 5843-5850. Gordon, V.M., Young, W.W., Lechler, S.M., Gray, M.C., Leppla, S.H. and Hewlett, E.L. (1989). Adenylate cyclase toxins from Bacillus anthracis and Bordetella pertussis. Different processes for interaction with and entry into target cells. Journal of Biological Chemistry 264, 14792-14796. Guermonprez, P., Khelef, N., Blouin, E., Rieu, P., Ricciardi-Castagnoli, P., Guiso, N., et al. (2001). The adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis binds to target cells via the alpha(m)beta(2) integrin (CD11b/CD18). Journal of Experimental Medicine 193, 1035-1044. Hanski, E. (1989). Invasive adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis. Trends in Biochemical Sciences 14, 459-463. Harris, E.S., McIntyre, T.M., Prescott, S.M. and Zimmerman, G.A. (2000). The leukocyte integrins. Journal of Biological Chemistry 275, 23409-23412. Howard, S.P. and Buckley, J.T. (1985). Activation of the hole-forming toxin aerolysin by extracellular processing. Journal of Bacteriology 163, 336-340. Hynes, R.O. (2002). Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell 110, 673-687. Jacobson, K. and Dietrich, C. (1999). Looking at lipid rafts? Trends in Cell Biology 9, 87-91. Kumar, P., Ahuja, N. and Bhatnagar, R. (2002). Anthrax edema toxin requires influx of calcium for inducing cyclic AMP toxicity in target cells. Infection and Immunity 70, 4997-5007. Ladant, D., Glaser, P. and Ullmann, A. (1992). Insertional mutagenesis of Bordetella pertussis adenylate cyclase. Journal of Biological Chemistry 267, 2244-2250. Lafont, F., Abrami, L. and van der Goot, F.G. (2004). Bacterial subversion of lipid rafts. Current Opinion in Microbiology 7, 4-10. Lisanti, M.P., Scherer, P.E., Vidugiriene, J., Tang, Z.L., Hermanowskivosatka, A., Tu, Y.H., et al. (1994). Characterization of caveolin-rich membrane domains isolated from an endothelial-rich source: implications for human disease. Journal of Cell Biology 126, 111-126. Locht, C. (2001). Bordetella pertussis virulence factors. Medecine Et Maladies Infectieuses 31, 20S-28S. Morova, J., Osicka, R., Masin, J. and Sebo, P. (2008). RTX cytotoxins recognize beta(2) integrin receptors through N-linked oligosaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 5355-5360. Navratil, A.M., Bliss, S.P., Berghorn, K.A., Haughian, J.M., Farmerie, T.A., Graham, J.K., et al. (2003). Constitutive localization of the gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor to low density membrane microdomains is necessary for GnRH signaling to ERK. Journal of Biological Chemistry 278, 31593-31602. Osickova, A., Masin, J., Fayolle, C., Krusek, J., Basler, M., Pospisilova, E., et al. (2010). Adenylate cyclase toxin translocates across target cell membrane without forming a pore. Molecular Microbiology 75, 1550-1562. Osickova, A., Osicka, R., Maier, E., Benz, R. and Sebo, P. (1999). An amphipathic alphahelix including glutamates 509 and 516 is crucial for membrane translocation of adenylate cyclase toxin and modulates formation and cation selectivity of its membrane channels. Journal of Biological Chemistry 274, 37644-37650. Otero, A.S., Yi, X.B., Gray, M.C., Szabo, G. and Hewlett, E.L. (1995). Membrane depolarization prevents cell invasion by Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin. Journal of Biological Chemistry 270, 9695-9697. 23

Pike, L.J. (2004). Lipid rafts: heterogeneity on the high seas. Biochemical Journal 378, 281-292. Razani, B., Woodman, S.E. and Lisanti, M.P. (2002). Caveolae: From cell biology to animal physiology. Pharmacological Reviews 54, 431-467. Rogel, A. and Hanski, E. (1992). Distinct steps in the penetration of adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis into sheep erythrocytes. Translocation of the toxin across the membrane. Journal of Biological Chemistry 267, 22599-22605. Rose, T., Sebo, P., Bellalou, J. and Ladant, D. (1995). Interaction of Calcium with Bordetella pertussis Adenylate Cyclase Toxin. Journal of Biological Chemistry 270, 26370-26376. Rothberg, K.G., Heuser, J.E., Donzell, W.C., Ying, Y.S., Glenney, J.R. and Anderson, R.G.W. (1992). Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell 68, 673-682. Sakamoto, H., Bellalou, J., Sebo, P. and Ladant, D. (1992). Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin. Structural and functional independence of the catalytic and hemolytic activities. Journal of Biological Chemistry 267, 13598-13602. Sebo, P. and Ladant, D. (1993). Repeat sequences in the Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin can be recognized as alternative carboxy-proximal secretion signals by the Escherichia coli alpha-haemolysin translocator. Molecular Microbiology 9, 999-1009. Simons, K. and Ikonen, E. (1997). Functional rafts in cell membranes. Nature 387, 569-572. Singer, S.J. and Nicolson, G.L. (1972). The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science 175, 720-731. Stefanova, I., Horejsi, V., Ansotegui, I.J., Knapp, W. and Stockinger, H. (1991). GPIanchored cell-surface molecules complexed to protein tyrosine kinases. Science 254, 1016-1019. Taichman, N.S., Iwase, M., Lally, E.T., Shattil, S.J., Cunningham, M.E. and Korchak, H.M. (1991). Early changes in cytosolic calcium and membrane potential induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin in susceptible and resistant target cells. Journal of Immunology 147, 3587-3594. van der Goot, F.G., Ausio, J., Wong, K.R., Pattus, F. and Buckley, J.T. (1993). Dimerization stabilizes the pore-forming toxin aerolysin in solution. Journal of Biological Chemistry 268, 18272-18279. Vitale, G., Pellizzari, R., Recchi, C., Napolitani, G., Mock, M. and Montecucco, C. (1998). Anthrax lethal factor cleaves the N-terminus of MAPKKs and induces tyrosine/threonine phosphorylation of MAPKs in cultured macrophages. Biochemical and Biophysical Research Communications 248, 706-711. Vojtova-Vodolanova, J., Basler, M., Osicka, R., Knapp, O., Maier, E., Cerny, J., et al. (2009). Oligomerization is involved in pore formation by Bordetella adenylate cyclase toxin. Faseb Journal 23, 2831-2843. Weiss, A.A. and Hewlett, E.L. (1986). Virulence factors of Bordetella pertussis. Annual Review of Microbiology 40, 661-686. Welch, R.A. (1995) Phylogenetic analyses of the RTX toxin family, pp. 195-206. Wolff, J., Cook, G.H., Goldhammer, A.R. and Berkowitz, S.A. (1980). Calmodulin activates prokaryotic adenylate cyclase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America-Biological Sciences 77, 3841-3844. 24