Svoluji k zapůjčení své diplomové práce ke studijním účelům a prosím, aby byla vedena přesná evidence vypůjčovatelů. Převzaté údaje je vypůjčovatel

Transkript

1 Svoluji k zapůjčení své diplomové práce ke studijním účelům a prosím, aby byla vedena přesná evidence vypůjčovatelů. Převzaté údaje je vypůjčovatel povinen řádně ocitovat.

2

3 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Studijní program: Biologie Studijní obor: Mikrobiologie Bc. Eliška Doktorová Vliv vápenatých iontů a cholesterolu na kanálotvornou aktivitu Adenylát-cyklázového toxinu Effect of calcium ions and cholesterol on channel forming activity of Adenylate-cyclase toxin Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: RNDr. Radovan Fišer, Ph.D. Praha, 2013

4 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, dne Podpis

5 Na tomto místě bych chtěla poděkovat mému školiteli RNDr. Radovanu Fišerovi, Ph.D., za pomoc při vypracovávání mé diplomové práce. Především za jeho trpělivost. Velký dík patří mým rodičům za podporu během celého mého studia. Také děkuji mému příteli Zdeňkovi Jankovskému za pochopení a trpělivost při sepisování diplomové práce.

6 Abstrakt Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) je jedním z hlavních virulenčních faktorů bakterie Bordetella pertussis, která způsobuje onemocnění černý kašel. CyaA působí na hostitelskou buňku dvěma možnými, na sobě nezávislými, způsoby. Jedním je tvorba malých kationt-selektivních kanálů, která může vést až ke koloidně osmotické lyzi cílových buněk. Druhým je rozvrat buněčné signalizace po translokaci adenylátcyklázové (AC) domény do cytozolu hostitelské buňky, což vede k přeměně ATP na cyklické AMP. V nedávné době bylo dokázáno, že cholesterol má vliv na průběh endocytózy CyaA. CyaA translokuje svou AC doménu až po přesunu celé molekuly CyaA do místa bohatého na cholesterol, tzv. lipidového raftu (Bumba et al. 2010). V této práci jsem se zabývala vlivem cholesterolu na kanálotvornou aktivitu a iontovou selektivitu CyaA kanálů. Pro měření byla užívána umělá membrána obohacená o cholesterol. Kanály CyaA jsou závislé na elektrickém napětí. Pro zabudování molekuly CyaA do membrány je potřeba kladného elektrického napětí na straně toxinu. Snažila jsem se zjistit, zda má hodnota vloženého elektrického napětí na membránu vliv na dobu otevření kanálu a dobu, za kterou se molekula CyaA zabuduje do membrány. Pro toxickou aktivitu CyaA jsou zásadní vápenaté ionty. Jsou potřeba pro hemolytickou aktivitu i pro přenos AC domény. Druhým cílem této práce bylo zjistit, zda vápenaté ionty prochází kanálem CyaA. Dalším cílem této práce bylo zjistit velikost CyaA kanálů. Doposud je velikost odhadována na 0,6-0,8 nm. Pro pokusy v této práci jsem používala neelektrolyty, látky bez celkového náboje. Na základě změn ve vodivosti CyaA kanálů lze usuzovat, jak velké molekuly jimi prochází. Všechny pokusy probíhaly na aparatuře, určené k měření na černých lipidových membránách. Klíčová slova: Adenylát-cyklázový toxin, Bordetella pertussis, CyaA, černé lipidové membrány, lipidový raft, neelektrolyt, vápenaté ionty, elektrické napětí

7 Abstract Adenylate cyclase toxin (CyaA) is one of the major virulence factors of bacterium Bordetella pertussis, which is a causative agent of whooping cough. CyaA belongs to the family of RTX toxin-hemolysins. The toxin targets primarily cells expressing integrin receptor CD11b/CD18 but it can also penetrate cells lacking this receptor. CyaA acts on host cells by two independent activities. One is formation of small cation-selective channels, which can lead to colloid osmotic lysis of target cells. The second is disruption of cell signaling through the translocation of the adenylate cyclase (AC) domain to host cell cytosol, which leads to the conversion of ATP into cyclic AMP. It was recently shown that cholesterol affects endocytosis of CyaA. CyaA translocates it s AC domain after relocation of CyaA molecule to the cholesterol-rich lipid raft (Bumba et al. 2010). In this work I examined the effect of cholesterol on channelforming activity and selectivity of ion channels created by CyaA. For measurements I used artificial membranes enriched with cholesterol. CyaA channels are voltage-dependent. The positive membrane potential on the side of toxin is rquired for incorporation of CyaA molecule into cell membrane. I tried to find out whether the value of voltage has effect on channels opening time. Calcium ions are essential for toxic activity of CyaA. CyaA requires calcium ions for formation of hemolytic channels and for folding of RTX domain, delivery of its AC domain into cells. The second objective of this study was to determine whether calcium ions pass through the CyaA channel. The last aim of this work was to determine the size of CyaA channels. The estimated inner diameter ranges from 0.6 to 0.8 nm, so far. I used nonelectrolytes, uncharged substances, for the experiments in this work. Based on changes in the conductivity of CyaA channels it can be considered how large molecules can pass through pore. All experiments were carried out on apparatus for measuremets on black lipid membranes. Keywords: Adenylate-cyclase toxin, Bordetella pertussis, CyaA, black lipid membranes, lipid raft, nonelectrolyte, calcium ions, voltage

8 Obsah Obsah... 8 Seznam použitých zkratek Úvod Přehled literatury RTX hemolyziny Bordetella pertussis Adenylát-cyklázový toxin Struktura CyaA Adenylát-cyklázová (AC) doména CyaA (1-400 AK) RTX hemolyzinová doména ( AK) Interakce CyaA s hostitelskou membránou Vliv vápenatých iontů na kanálotvornou aktivitu CyaA Závislost aktivity CyaA na napětí Velikost kanálů tvořených CyaA Vliv cholesterolu na kanálotvornou aktivitu CyaA, lipidové rafty Černé lipidové membrány Materiál a metody Seznam použitých chemikálií Přístrojové vybavení Roztoky a pufry Kultivační média Směsi pro přípravu umělých membrán Metody a pracovní postupy Produkce a purifikace CyaA Příprava superkompetentních buněk Escherichia coli Transformace plazmidové DNA do kompetentních buněk... 37

9 3.6.4 Produkce toxinu v 500 ml kulturách Příprava močovinového extraktu CyaA a jeho derivátů Purifikace proteinu iontoměničovou chromatografií na DEAE-Sepharose Purifikace proteinu hydrofobní chromatografií na Phenyl-Sepharose SDS-polyakrylamidová elektroforéza Stanovení koncentrace proteinů Měření na černých lipidových membránách Výsledky Vliv cholesterolu na kanálotvornou aktivitu CyaA Výskyt velkých kanálů tvořených CyaA v membránách s cholesterolem Iontová selektivita kanálů CyaA v cholesterolových membránách Vliv elektrického napětí na aktivitu CyaA Závislost rychlosti zabudování CyaA na elektrickém napětí Závislost doby otevření kanálu CyaA na napětí Velikost kanálů CyaA Vliv vápenatých iontů na iontovou selektivitu kanálů CyaA Vliv vápenatých iontů na iontovou selektivitu CyaA kanálů Propustnost kanálů CyaA pro vápenaté ionty Diskuze Vliv cholesterolu na kanálotvornou aktivitu CyaA Iontová selektivita kanálů CyaA v cholesterolové membráně Vliv elektrického napětí na aktivitu CyaA Velikost kanálů CyaA Propustnost kanálů CyaA pro vápenaté ionty Souhrn Seznam literatury...67

10 Seznam použitých zkratek AC ATP BLM BSA CaM camp CyaA Da DEAE EDTA HEPES HlyaA IPTG LB médium PAGE adenylát-cykláza adenosin-5 -trifosfát černé lipidové membrány (z anglického Black Lipid Membranes) hovězí sérový albumin kalmodulin cyklický adenosin-3, 5 -monofosfát adenylát-cyklázový toxin bakterie Bordetella pertussis dalton (jednotka molekulové hmotnosti) diethlaminoetyl etylendiamintetraoctová kyselina N-2-hydroxyetylpiperazin-N -2-etansulfonová kyselina α-hemolyzin bakterie Escherichia coli isopropyl β-d-thiogalaktopyranosid kultivační médium Luria-Bertani pro bakteriální kultury elektroforéza v polyagrylamidovém gelu (z anglického PolyAcrylAmide Gel Electrophoresis) PEG RTX SDS Tris Tris-HCl polyetylenglykol označení skupiny cytotoxinů (Repeats in ToXin) dodecylsulfát sodný tris(hydroxymetyl)aminometan tris(hydroxymetyl)aminometan-hydrochlorid

11 v/v w/v w/w wt poměr objemů dvou látek v roztoku koncentrace látky v rozpouštědle kg/l poměr hmotností látek v roztoku divoký typ (z anglického wild type)

12 1 Úvod Adenylát-cyklázový toxin (CyaA, ACT) je jedním z hlavních virulenčních faktorů bakterie Bordetella pertussis, která je původcem onemocnění černý kašel. Černý kašel je vážné respirační onemocnění, které postihuje zejména kojence a malé děti. Přestože Bordetella pertussis produkuje řadu toxických látek, má adenylát-cyklázový toxin pro její virulenci zásadní význam. Kmeny Bordetella pertussis bez tohoto toxinu jsou avirulentní. Adenylát-cyklázový toxin patří do rodiny RTX hemolyzinů (z angl. Repeats in ToXin) a stejně jako ostatní RTX hemolyziny se váže do buněčné membrány hostitelských buněk, kde tvoří malé kation-selektivní póry. CyaA obsahuje katalytickou adenylátcyklázovou doménu (AC), která je translokována do buňky. Zde je aktivována cytozolickým calmodulinem a konvertuje nekontrolovatelně ATP na camp. To vede k narušení buněčné signalizace až k apoptóze. CyaA se primárně váže na buňky nesoucí na své membráně receptor CD11b/CD18 (CR3, Mac-1, α Mβ 2) mezi které patří NK buňky, monocyty, neutrofily, T-lymfocyty, makrofágy. Nicméně může napadat i buňky, které tento receptor nemají (Gordon et al. 1989). CyaA je možno geneticky modifikovat. Byly vyvinuty nosiče antigenů založené na translokaci AC domény s inzercí různě dlouhých polypeptidových fragmentů. Většina CyaA toxoidů s inzerty aminokyselin byla schopna se vázat na buňky ovčích erytrocytů a AC doménu translokovat. To ukazuje na flexibilitu CyaA toxoidů jako nástroje pro přenos heterologních proteinů do buněk. Detoxifikovaný adenylátcyklázový toxin by mohl sloužit jako vektor antigenů vedoucí k indukci obranné odpovědi vůči intracelulárním patogenům, jako jsou viry, nebo jako imunoterapie při tumorech (Simsova, Peter Sebo, and Claude Leclerc 2004). Já jsem se ve své diplomové práci věnovala především měření vlastností CyaA, které lze pozorovat na umělých lipidových membránách - průchod iontů kanály CyaA, který je možné měřit jako elektrický proud. Prvním cílem mé diplomové práce bylo zjistit, zda mají černé lipidové membrány s přídavkem cholesterolu vliv na kanálotvornou aktivitu CyaA v těchto membránách a případně zda cholesterol ovlivňuje iontovou selektivitu kanálů CyaA. Bylo totiž zjištěno, že cholesterol hraje roli při translokaci 12

13 katalytické AC domény toxinu přes membránu. K translokaci dochází po přesunu CyaA do lipidového raftu, místa bohatého na cholesterol (Bumba et al. 2010). CyaA kanály jsou ovládané napětím, které má vliv i na translokaci AC domény. Aby byla AC doména přenesena, je potřeba kladného membránového potenciálu na straně toxinu. V této práci jsem sledovala, zda má hodnota vloženého elektrického napětí vliv na dobu, po jakou je CyaA kanál otevřený. Také jsem sledovala, zda existuje závislost rychlosti zabudování molekuly CyaA do membrány na elektrickém napětí. Dalším cílem práce bylo zjistit velikost kanálů, které tvoří adenylát-cyklázový toxin. Velikost CyaA kanálů je odhadována na 0,6-0,8 nm (Benz et al. 1994; Ehrmann et al. 1991). Ve své práci jsem pro stanovení průměru CyaA kanálů používala neelektrolyty, látky bez celkového náboje. Posledním cílem této práce bylo zjistit, zda vápenaté ionty procházejí póry, které tvoří CyaA v černých lipidových membránách a zda ovlivňují jejich iontovou selektivitu. Vápenaté ionty jsou nezbytné pro toxickou aktivitu CyaA. 13

14 2 Přehled literatury 2.1 RTX hemolyziny RTX toxiny jsou exoproteiny gram-negativních bakterií. Jejich společnou vlastností je způsob transportu přes bakteriální membránu a nonapeptidové repetice v RTX hemolyzinové doméně, které jsou bohaté na glycin a aspartát, podle kterých celá rodina dostala své pojmenování. Používaný sekreční systém typu I je společný široké skupině gram negativních bakterií. Sekrece probíhá oligomerním kanálem, který prochází celým bakteriálním obalem, to znamená cytoplazmatickou membránou, periplazmatickým prostorem i vnější membránou. Na C-konci molekuly toxinu je sekreční signál. Sekrece RTX polypeptidu probíhá v jednom kroku, z cytozolu do extracelulárního prostředí, bez mezikroku v periplamatickém prostoru. Nonapeptidová repetice má sekvenci (L/I/F)-X-G-G-X-G-(N/D)-D-X), X označuje libovolnou aminokyselinu. Aminokyseliny v závorkách značí, že v této pozici se mohou nalézat různé aminokyselinové zbytky. Tyto repetice jsou lokalizovány na C-terminálním konci proteinu a jsou místem, kam se váží ionty vápníku (Boehm, Welch, and Snyder 1990). Potřeba vápenatých iontů pro aktivitu RTX toxinů byla prvně popsána u α-hemolyzinu E. coli (Jr and Kurtz 1971) a adenylát-cyklázového toxinu B. pertussis (Hanski and Farfeln 1985). Vazba vápenatých iontů nastává až po sekreci z buňky ven, v cytoplazmě bakterií je velmi nízká koncentrace vápníku (méně než 100 nm) (Gangola and Rosen 1987). Rodina RTX toxinů zahrnuje cytolytické toxiny, metaloproteiny a lipázy. Podle specifity hostitelské buňky je možné RTX toxiny rozdělit na dvě skupiny, hemolyziny a leukotoxiny. Hemolyziny napadají široké spektrum hostitelských buněk. Vazba leukotoxinů je oproti hemolyzinům vázáná na specifický typ buňky nebo specifického hostitele (Lally et al. 1999). Ačkoli existují určité odlišnosti, tak jsou ve většině případů geny RTX toxinů seskupeny v operonu sestávajícího ze čtyř genů, rtxc, A, B, D. RTX toxiny pro svou aktivaci a hlavně pro interakci s hostitelskou membránou vyžadují posttranslační modifikaci. (Boehm et al. 1990; Nicaud et al. 1985). Touto modifikací je acylace genového produktu rtxa genu za pomoci produktu rtxc genu a ACP (acyl carrier protein) (Ludwig et al. 1996; Moayeri and Welch 1997). Ačkoli není doposud přesně známo 14

15 proč, tak všechny pórotvorné RTX toxiny potřebují být acylované, aby mohly uplatnit všechny své toxické aktivity. Posttranslačně nemodifikované formy HlyA a CyaA sice tvoří póry v planárních lipidových dvojvrstvách, ale s mnohem menší ochotou (Ludwig et al. 1996; Masin et al. 2005). Transport RTX toxinů z cytoplazmy probíhá za účasti transportních proteinů kódovaných rtx B a rtxd geny (Lally et al. 1999). Sekreční signál leží v C-terminální části proteinu rtxa v úseku přibližně posledních 60 aminokyselin. Pro samotný transport je také důležitá sekundární struktura signální sekvence, která má podobu amfipatického helixu (Hui et al. 2000). Hlavním, a nejlépe prostudovaným, představitelem RTX toxinů je HlyA bakterie Escherichia coli. Dalšími zástupci RTX hemolyzinů jsou ApxI A bakterie Actionobacillus pleuropneumoniae a CyaA bakterie Bordetella pertussis (Lally et al. 1999). Hemolytickou aktivitou se rozumí schopnost tvorby selektivního, vodivého kanálu v membráně. Zatímco HlyA je znám zejména svou hemolytickou aktivitou, tak CyaA interaguje s cílovou membránou složitěji. Po navázání na cílovou membránu translokuje svou N-terminální AC doménu do cytoplazmy, kde rychle konvertuje ATP na camp. Je však schopen i tvorby kation-selektivních pórů v membráně hostitelské buňky. 2.2 Bordetella pertussis Bordetella pertussis je gramnegativní, aerobní, nesporulující kokobacil. Je striktně lidský patogen. Kolonizuje respirační trakt lidí a je příčinou černého kašle (dávivého kašle nebo též pertuse). Onemocnění se šíří aerosolem nebo přímým kontaktem. Černý kašel je nebezpečný zejména pro kojence. Nakažený pacient trpí úmorným kašlem, během kterého se nemůže nadechnout. Dochází k celkovému vyčerpání organismu. V zemích, kde není očkování zavedeno, je černý kašel stále běžným onemocněním (Mattoo and Cherry 2005). V České republice po zavedení účinné chloramfenikolové terapie v padesátých letech a po zavedení povinného očkování v roce 1958 počty hlášených případů onemocnění začaly rychle klesat (Fabiánová et al. 2011). Bordetella pertussis disponuje řadou mechanismů, které jí umožňují proniknout do hostitelského organismu. Produkuje množství faktorů virulence, mezi které patří pertusový toxin, adenylát-cyklázový toxin, filamentózní hemaglutinin, 15

16 dermonekrotický toxin, pertaktin, tracheální cytotoxin, fimbrie (Weingart and Weiss 2000). Virulenční faktory Bordetella pertussis lze rozdělit do dvou skupin na adheziny a toxiny. Adheziny umožňují bakterii po proniknutí do dýchacích cest přichycení k řasinkovému epitelu. Sem patří filamentózní hemaglutinin, pertaktin, fimbrie (Mobberley-schuman and A. A. Weiss 2005). Toxiny se účastní dalších fází infekce, když se bakterie pomnoží, a mají za úkol oslabit obranyschopnosti hostitele. Mezi toxiny patří adenylát-cyklázový toxin, pertusový toxin, dermonekrotický toxin. Onemocnění trvá většinou 4 až 8 týdnů a jeho průběh můžeme rozdělit do tří fází. V první fází dochází ke kolonizaci horních cest dýchacích, bakterie přilnou na povrch řasinkového epitelu sliznice nosohltanu, hltanu, průdušnice a průdušek, a začíná se objevovat dráždivý kašel provázený zvýšenou teplotou. V tomto stádiu onemocnění je možno černý kašel léčit antibiotiky. V druhé fázi se bakterie pomnoží a začínají produkovat toxiny. Dochází k destrukci sliznice dýchacích cest. Objevuje se charakteristický dráždivý kašel, který může končit zvracením (odtud název dávivý kašel). Dráždění sliznice dýchacích cest způsobuje pertusový toxin, který vyvolává kašel, pro toto onemocnění typický V tomto stádiu se již v plicích nevyskytují živé bakterie. V poslední fázi onemocnění mizí příznaky a dochází k rekonvalescenci. Imunita po proběhnutém onemocnění ani po očkování není celoživotní, trvá přibližně 4-20 let. V roce 1959 bylo v České republice zavedeno celoplošné očkování celobuněčnou vakcínou v kombinaci s očkováním proti záškrtu a tetanu. Kvůli častým nežádoucím účinkům vakcíny (bolestivost, zarudnutí v místě vpichu, horečka, křeče a další) bylo od celobuněčné vakcíny upuštěno. Od roku 2007 se očkuje hexavakcínou (proti černému kašli, záškrtu, tetanu, virové hepatitidě typu B, dětské obrně a infekcím způsobeným Haemophilus influenzae typu B), která je acelulární. Imunita po očkování acelulární vakcínou je však kratší než po očkování celobuněčnou. V posledních dvou desetiletích se výskyt pertuse zvyšuje, jak je patrné z grafu na Obr. 1, což může být dáno několika faktory. Jednak zvýšením hlášení černého kašle, zavedením acelulární očkovací látky a také existence rezervoáru mezi dospělými a adolescenty, kteří nepodstupují přeočkování proti pertusi (Havlík 2008). 16

17 Obr. 1 Vývoj nemocnosti pertuse v ČR, , nemocnost na 100 tisíc obyvatel (Fabiánová et al., 2011) 2.3 Adenylát-cyklázový toxin Adenylát-cyklázový toxin, jak již bylo zmíněno dříve, patří mezi RTX toxiny. Je jedním z nejvýznamnějších faktorů virulence patogenních bordetel. Lidé nakažení Bordetella pertussis jsou snadno náchylní k sekundárním infekcím (Confer and Eaton 1982). Toxin CyaA hraje důležitou roli v prvních fázích onemocnění, při kolonizaci respiračního traktu. Mutanty defektní v CyaA jsou avirulentní (Goodwin and Weiss 1990). CyaA je kódován genem cyaa, který leží v cya lokusu. Pro sekreci CyaA je nutná exprese ještě dalších tří genů cyab, D, E. Tyto geny jsou zodpovědné za transport toxinu. Mechanismus sekrece je podobný jako u α-hemolyzinu Escherichia coli (Philippe Glaser, A. Danchin, et al. 1988). Schopnost CyaA vázat se na cílové buňky s receptorem CD11b je podmíněna posttranslační modifikací (El-Azami-El-Idrissi et al. 2003), kterou je palmitoylace. Palmitoylaci zajišťuje acyltransferáza CyaC. CyaC připojuje kyselinu palmitovou k aminoskupinám lyzinových zbytků v pozicích Lys983 (Hackett et al. 1994) a Lys860 (Masin et al. 2005). 17

18 2.4 Struktura CyaA CyaA je polypeptid sestávající z 1706 aminokyselin o molekulové hmotnosti 177 kda. Molekula CyaA se skládá ze dvou hlavních domén: 1. Adenylát-cyklázová doména, 2. RTX hemolyzinová doména. Obě lze dále rozdělit na několik částí: hydrofobní doména, acylační místa, repetitivní doména, C-koncový sekreční signál. Obr. 2 Schématické znázornění RTX toxinu CyaA bakterie Bordetella pertussis. CyaA se skládá z adenylát-cyklázové domény a RTX hemolyzinové domény. Po translokaci do buňky váže AC doména buněčný kalmodulin (CaM). V dolní části obrázku je zobrazena krystalová struktura CaM s navázanou AC doménou. Červenou a růžovou barvou je vyobrazena krystalová struktura AC domény (T25 a T18 oblasti). Šedou barvou je znázorněn C-koncový úsek kalmodulinu (C-CaM). Žlutě jsou vyobrazeny vápenaté ionty. Struktura (1YRT) stažena ze serveru a upravena v programu PyMol. 18

19 2.4.1 Adenylát-cyklázová (AC) doména CyaA (1-400 AK) Prvních 400 aminokyselin N-terminálního konce CyaA zahrnuje invazivní adenylátcyklázovou doménu. Je to část, která je po translokaci a odštěpení aktivována vnitrobuněčným kalmodulinem (CaM), čímž dochází ke štěpení buněčného ATP na camp a pyrofosfát (Wolff et al. 1980). Translokace AC domény je zajišťována zbytkem molekuly CyaA zatím ne zcela objasněným mechanismem (Philippe Glaser, Hiroshi Sakamoto, et al. 1988). AC doména se skládá ze dvou částí T25 a T18. Část T25 (1-224 AK) obsahuje katalytické místo, kde dochází k přeměně ATP na camp. Část T18 ( AK) obsahuje vazebné místo pro kalmodulin (P Glaser et al. 1989). Po proteolytickém štěpení si obě části zachovávají své funkce (Munier et al. 1991). Trojrozměrná struktura AC domény s C-koncovým úsekem kalmodulinu byla objasněna v roce 2005 (Guo et al. 2005) a je zobrazena na Obr. 2. Zatím není zcela jasné, jakým způsobem se AC doména dostává přes buněčnou membránu hostitele. Doposud je známo, že pro translokaci AC domény je nutný negativní membránový potenciál (Otero et al. 1995), přítomnost vápenatých iontů ve fyziologické koncentraci a aby byla AC doména rozvolněna RTX hemolyzinová doména ( AK) Hemolyzinová doména obsahuje sekvence, které řadí CyaA k RTX proteinům. Nachází se zde pět ohraničených, od sebe oddělených, úseků. Každý úsek obsahuje nonapeptidové repetitivní sekvence bohaté na glycin a aspartát (L/I/F)-X-G-G-X-G- (N/D)-D-X) (Philippe Glaser, Hiroshi Sakamoto, et al. 1988). Hlavní oblast, která se účastní vazby na cílovou buňku nesoucí receptor CD11b, je umístěna v RTX oblasti bohaté na glycinové a aspartátové repetice. Katalytická doména není nutná pro vazbu na tento receptor (El-Azami-El-Idrissi et al. 2003). Hydrofobní doména ( AK) Tato oblast molekuly CyaA obsahuje zvýšený výskyt hydrofobních aminokyselin a je důležitá pro schopnost vazby CyaA na biologické membrány, které nenesou specifický receptor. Osičková et al. (Osicková et al. 1999) ve své práci z roku 1991 ukazují, že v této části molekuly pravděpodobně vznikají α-alfa helixy, které obsahují glutamátové 19

20 zbytky. Tyto glutamátové zbytky hrají důležitou roli při translokaci AC domény a zároveň ovlivňují tvorbu pórů v membránách a jejich kation-selektivitu. Striktní kation-selektivita CyaA kanálů naznačuje, že se uvnitř či v blízkém okolí kanálu nachází negativně nabité aminokyselinové zbytky. Cílenou mutagenezí bylo připraveno několik bodových mutant v oblasti , tedy oblasti předpokládaného transmembránového α-helixu. Záměna glutamátového zbytku za prolin znemožnila translokaci AC domény bez toho, aby byla narušena hemolytická aktivita CyaA. Záměna za lyzin výrazně snížila schopnost translokace AC domény, naopak hemolytická aktivita byla zvýšena díky vyššímu počtu tvořených kanálů. Substitucí lyzinem byl změněn náboj, který tento úsek nese. Tato skutečnost se odrazila ve snížené kationselektivitě kanálu. Z uvedeného vyplývá, že se oblast s největší pravděpodobností podílí na tvorbě kation-selektivních kanálů v cílových membránách (Osicková et al. 1999). Acylační doména ( AK) Schopnost CyaA vázat se na cílové buňky závisí na jeho aktivaci pomocí posttranslační modifikace. Touto modifikací je palmitoylace ε-amino skupiny lyzinových zbytků K860 a K983 bakteriální acyltransferázou CyaC (Barry et al. 1991). Stejně jako u ostatních RTX toxinů je tato modifikace nezbytná pro to, aby se CyaA mohl vázat na buněčné membrány. Repetitivní RTX doména ( AK) RTX doména je oblast, která řadí CyaA k RTX proteinům. Nachází se zde přibližně 45 nonapeptidových, na aspartát a glycin bohatých, repetic (L/I/F)-X-G-G-X-G-(N/D)-D-X) kde X představuje jakoukoli aminokyselinu. Tyto repetice jsou místem vazby vápenatých iontů. Přibližně 3-5 míst je vysokoafinitních a jsou důležité pro schopnost vazby CyaA na membrány. Zbývající místa pro vazbu vápníku jsou nízkoafinitní, s největší pravděpodobností jsou důležité pro to, aby CyaA mohl translokovat svou katalytickou AC doménu do cílových buněk (Rose et al. 1995). Vápenaté ionty způsobují konformační změnu CyaA což je nezbytné pro interakci CyaA s receptorem CD11b/CD18 (Guermonprez et al. 2001). Změna konformace je důležitá nejen pro vazbu na biologické membrány, ale i na translokaci AC domény skrze cytoplazmatickou membránu hostitelských buněk (Rogel and Meller 1991). 20

21 C-koncový sekreční signál C-terminální úsek sestávající z 1306 AK vykazuje 25% homologii s α-hemolyzinem (HlyA) E.coli (Philippe Glaser, Hiroshi Sakamoto, et al. 1988). C-terminální úsek obsahuje hydrofobní doménu s amfifilní a hydrofobní alfa-helikální strukturou (úsek AK), tato oblast je podobná pórotvorné oblasti alfahemolyzinu (HlyA) z E.coli. 2.5 Interakce CyaA s hostitelskou membránou CyaA primárně napadá buňky exprimující na svém povrchu CD11b/CD18 integrin receptor (αmβ2, Mac-1) ten se vyskytuje převážně na myeloidních buňkách (Guermonprez et al. 2001). CD11b/CD18 hraje klíčovou roli v imunitní odpovědi leukocytů. CyaA se primárně vážně na fagocyty, které na svém povrchu tento integrin receptor nesou, ale váže se i na buňky, které CD11b/CD18 na svém povrchu neexprimují, například erytrocyty. Tím CyaA obejde receptorem zprostředkovaný vstup do buňky a přímo proniká cytoplazmatickou membránou do cílových buněk (Gentile et al. 1988; Guermonprez et al. 1999). Po navázání CyaA na receptor CD11b/CD18 zanořuje do hostitelské membrány svou AC doménu, což je provázeno vstupem vápenatých iontů z extracelulárního prostředí do cytoplazmy. Molekula CyaA se tak přímo podílí na vstupu vápníku do buněk (Fiser et al. 2007). Vstup vápenatých iontů aktivuje na vápníku závislou proteázu calpain, která uvolňuje komplex CyaA-CD11b/CD18 z vazby k cytoskeletu. CyaA se pak přesouvá do lipidového raftu, místa bohatého na cholesterol, AC doména je odstřižena od zbytku molekuly CyaA a váže se na cytozolický calmodulin a dochází ke konverzi ATP na camp (Bumba et al. 2010). Translokace AC domény je znázorněna na Obr. 3. V cytozolu se N-terminální AC doména CyaA váže intracelulární calmodulin a katalyzuje nekontrolovatelnou konverzi ATP na camp. camp funguje jako druhá klíčová signální molekula (Confer and Eaton 1982). Dochází k narušení signalizace v buňce, což vede u fagocytů ke ztrátě baktericidních vlastností. Při vysokých koncentracích CyaA dochází k tak rychlému snížení koncentrace ATP v buňce, že buňka odumírá. 21

22 Obr. 3 Model translokace AC domény do cytozolu hostitelské buňky. Nejdříve se CyaA váže na integrin CD11b/CD18. Poté se CyaA zanořuje do cytoplazmatické membrány za vzniku translokačního intermediátu. V tomto okamžiku dochází ke vstupu Ca 2+ do cytozolu. Proteáza calpain odstřihne komplex CyaA-CD11b/CD18 od cytoskeletu a celý komplex se přesouvá do lipidového raftu, kde je proces translokace AC domény dokončen jejím odstřižením od CyaA. Převzato z (Bumba et al. 2010) a upraveno. Adenylát-cyklázový toxin reaguje s hostitelskou membránou dvěma způsoby. V roztoku se CyaA vyskytuje ve dvou různých konformacích, Obr. 4. V závislosti na konformaci pak dochází buď k translokaci AC domény přes cytoplazmatickou membránu, nebo k tvorbě kationt-selektivních kanálů. Translokace AC domény je přitom zajišťována monomerem, zatímco pro tvorbu kanálů je třeba oligomerizace několika jednotek CyaA. Pro tvorbu kationt-selektivních kanálů v membráně erytrocytů je třeba nejméně dvou jednotek CyaA (Basler et al. 2007; Osicková et al. 1999; Vojtova-Vodolanova et al. 2009). 22

23 Obr. 4 Schématické znázornění možných interakcí CyaA s cílovou membránou. Translokační prekurzor vede k přenosu AC domény do hostitelské buňky, zatímco kanálotvorný prekurzor vede k tvorbě kationt selektivních kanálů v cílové membráně. Převzato z (Basler et al. 2007) a upraveno. Translokace AC domény do buněk a tvorba pórů jsou tedy dvě různé aktivity. Lze je od sebe oddělit teplotou, koncentrací volných vápenatých iontů, specifickou mutací nebo acylací či absencí acylace proteinu (Basler et al. 2007; Osicková et al. 1999; Sakamoto et al. 1992). 2.6 Vliv vápenatých iontů na kanálotvornou aktivitu CyaA Bakteriální toxiny mohou v hostitelské buňce vyvolávat změny v koncentraci volných vápenatých iontů (TranVan Nhieu et al. 2004). Vápenaté ionty jsou klíčové ionty v každé buňce, regulují zde široké spektrum procesů zahrnující exocytózu, kontrolu enzymů, genovou regulaci, růst buňky, proliferaci, apoptózu (Parekh and Putney 2005). Vápenaté ionty v buňkách fungují jako sekundární intracelulární poslové a kalmodulin (CaM) je jedna z molekul, které na přítomnost vápníku reaguje (Berridge, Bootman, and Roderick 2003). Kalmodulin má N- a C-terminální globulární domény. Každá globulární doména CaM má dvě místa pro vazbu vápníku. Pokud se vápník naváže na kalmodulin, dojde k jeho konformační změně a tím se otevírají nová reakční místa (Guo et al. 2005). Koncentrace volných iontů vápníku je důležitá pro hemolytickou aktivitu i pro translokaci AC domény do cílové buňky (J Bellalou et al. 1990; Hanski and Farfeln 23

24 1985). K napadení buňky dochází jen za přítomnosti volných iontů vápníku v koncentraci vyšší než 0,2 mm (Gordon et al. 1989). Jejich navázání vede ke konformační změně CyaA, která je nutná pro toxickou aktivitu (Hewlett et al. 1991). Tato konformační změna následně vede k translokaci katalytické domény CyaA skrze cytoplazmaticou membránu cílové buňky (Rose et al. 1995). V nedávné době bylo prokázáno, že CyaA při translokaci své AC domény umožňuje vstup vápenatých kationtů do buňky. Pokusy byly prováděny na myeloidních fagocytech, které na svém povrchu exprimují CD11b receptor (Fiser et al. 2007). Naproti tomu jiný RTX toxin, HlyA bakterie E.coli, zvyšuje cytoplazmatickou koncentraci vápenatých iontů tvorbou pórů v membráně hostitelské buňky. Původně se tedy předpokládalo, že CyaA bude propouštět vápenaté ionty stejným mechanismem (Valeva et al. 2005). Důvodem, proč CyaA využívá jiný mechanismus vstupu Ca 2+ může být fakt, že oproti HlyaA tvoří mnohem menší póry (Benz et al. 1994; Ehrmann et al. 1991). Szabo et al. (Szabo and Gray 1994) ve své práci naznačují, že póry tvořené CyaA jsou kation-selektivní s lehkou preferencí pro vápenaté ionty oproti monovalentním kationtům. Také ve své práci dochází k názoru, že pro tvorbu vodivého póru je třeba více než jedna molekula adenylát-cyklázového toxinu. Pravděpodobně je pór tvořen agregací transmembránových monomerů. CyaA ovlivňuje intracelulární iontové prostředí, viz Tab. 1, hostitelské buňky i jiným způsobem. Při tvorbě kationt selektivního kanálu, který vzniká oligomerizací CyaA (Vojtova-Vodolanova et al. 2009), dochází k úniku draselných kationtů z erytrocytů (Gray et al. 1998; Pospíšilová 2010). Iont Buňka (mm) Krev (mm) K Na Cl Ca 2+ < 0,0002 1,8 Tab. 1 Typické koncentrace iontů v savčí buňce a krvi (Lodish, Berk, and Kaiser 2008). 24

25 2.7 Závislost aktivity CyaA na napětí Membránový potenciál je důležitým faktorem, který má vliv na biologickou aktivitu CyaA in vivo. Bylo prokázáno, že pro přenos AC domény je třeba negativní membránový potenciál uvnitř buněk (Otero et al. 1995). Na buněčné membráně je na cis straně (strana přídavku CyaA) pozitivní potenciál a na trans straně negativní potenciál. Při přepnutí pozitivního potenciálu na cis straně na potenciál negativní dochází k zavírání CyaA pórů, a tím k poklesu vodivosti membrány (Knapp et al. 2008). Pórotvorná aktivita CyaA tak není závislá pouze na vápníku, ale také na polaritě vloženého napětí na membránu (Knapp et al. 2008; Otero et al. 1995; Szabo and Gray 1994). Stejné chování vykazuje i hemolyzin z E.coli. Při vkládání negativního napětí na membránu se póry otevírají a naopak při pozitivních potenciálech zavírají (Menestrina and Ropele 1989). Knapp et al. (Knapp et al. 2008) pozorovali změny elektrického proudu v závislosti na použitém kladném či záporném napětí různých hodnot na cis straně membrány. Při zvyšujících se hodnotách kladného potenciálu na cis straně se zvyšují i hodnoty elektrického proudu. Při negativním potenciálu na cis straně se hodnoty elektrického proudu přibližují směrem k nule nebo zůstávají konstantní. Závislost aktivity kanálu CyaA na napětí se zdá být asymetrická. Pro kladná napětí na cis straně se zdá být závislost exponenciální, pro negativní napětí na cis straně zůstala amplituda elektrického proudu víceméně konstantní. 2.8 Velikost kanálů tvořených CyaA Iontové kanály jsou obvykle tvořeny jedním nebo několika integrálními membránovými proteiny. Geometrie póru, stejně jako distribuce nábojů, je zásadní pro vodivost, iontovou selektivitu, obecně pro membránový transport. Pro studium průměru a vodivosti iontových kanálů je využíváno nevodivých látek, neelektrolytů. Tyto nevodivé látky mají vliv na vodivost a viskozitu KCl roztoků, stejně tak jako na vodivost studovaných iontových kanálů. Užití neelektrolytů (např. glycerol, polyetylenglykoly - PEG) různých velikostí tak může sloužit pro studium velikosti pórů, které tvoří kanálotvorné proteiny, mezi které patří i CyaA. 25

26 Takovýmto způsobem Sobko et al. (Sobko et al. 2006) určili průměry kanálů, které tvoří kolicin E1. V závislosti na složení lipidové dvojvrstvy tvoří kolicin E1 v membráně buď malé póry, vodivost okolo 60 ps, nebo velké póry s vodivostí okolo 600 ps. Průměr těchto kanálů byl stanoven pomocí glycerolu, a polyetylenglykolů různých molekulových hmotností (PEG 300 a PEG 3350). Vliv neelektrolytů na vodivost membrány je vidět na Obr. 5. Přidáním glycerolu do kyvety na cis stranu došlo k poklesu vodivosti velkých i malých kanálů. Byl-li přidán pouze PEG 300, došlo k poklesu vodivosti pouze velkých kanálů. PEG 3350 neovlivnil vodivost ani malých, ani velkých kanálů. Obr. 5 Vliv přidání neelektrolytů různých molekulových hmotností na elektrický proud procházející malými (A) a velkými (B) kanály. Převzato z (Sobko et al., 2006) a upraveno. Vodivost jednotlivých kanálů CyaA je v porovnání s jiným hemolyzinem, HlyA z E. coli, při stejných podmínkách měření přibližně 55krát menší. Autoři (Benz et al. 1994) z toho usoudili, že velikost kanálu CyaA bude menší, než je tomu u HlyA. Velikost CyaA (177 kda) kanálů je odhadována na 0,6-0,8 nm (Benz et al. 1994; Ehrmann et al. 1991),hemolyzin HlyA (110 kda) z Escherichia coli tvoří kanály o průměru 2-3 nm (Benz et al. 1989; Ehrmann et al. 1991). Je tedy patrné, že kanály tvořené CyaA jsou poměrně malé v porovnání s jeho celkovou velikostí oproti HlyaA. 2.9 Vliv cholesterolu na kanálotvornou aktivitu CyaA, lipidové rafty Cholesterol je steroidní látka amfipatické povahy. Jeho hydroxylová skupina představuje polární část, steroidní jádro část nepolární, viz pravá strana na Obr. 6. Je součástí plazmatických membrán eukaryotických buněk. Ovlivňuje jejich fyzikální vlastnosti, zejména viskozitu. Cholesterol zabraňuje volnému pohybu fosfolipidů v plazmatické membráně, a tím snižuje její fluiditu. Snižuje průchodnost malých, ve vodě rozpustných, molekul skrze lipidovou dvojvrstvu. 26

27 Cholesterol spolu se sfingolipidy a některými membránovými proteiny tvoří v biomembránách mikrodomény, tzv. lipidové rafty (Simons and Ikonen 1997). Pro svou rezistenci k detergentům a svému složení bývají také nazývány DRM (detergent resistant membranes) nebo GEMs (glykolipid-enriched microdomains). V poslední době jsou mikrodomény bohaté na cholesterol a sfingomyelin v popředí zájmu, protože se ukázalo, že některé integrální proteiny jsou v nich přednostně lokalizovány. Tyto mikrodomény se podílí na buněčné signalizaci a transportu membránových proteinů (Simons and Toomre 2000). Ukázalo se, že CyaA translokuje svou AC doménu až po přesunu do lipidového raftu. Nejdříve se CyaA naváže na receptor a posléze se přesouvá do raftu, kde dojde k samotné translokaci (Bumba et al. 2010). Existuje celá řada patogenních bakterií, které nepatří mezi RTX toxiny (Clostridium, Streptococcus, Listeria, Bacillus, Arcanobacterium), a které sekretují pórotvorné toxiny, jež pro tvorbu pórů vyžadují přítomnost cholesterolu v membráně, tzv. CDCs (cholesterol-dependent cytolysins) (Tweten 2005). Obr. 6 Lipidový raft, molekula cholesterolu. Převzato z (Sergent et al. 2012) a upraveno Černé lipidové membrány Lipidová dvojvrstva je centrální komponentou buněčných membrán. Membrány vymezují prostor buněk, oddělují jednotlivé kompartmenty, hrají zásadní roli při transportu látek dovnitř i ven z buňky, přenáší signál, podílí se na buněčné adhezi. Metoda černých lipidových membrán (BLM, z anglického black lipid membranes), prvně popsána Muellerem a jeho kolegy v roce 1962 (MUELLER et al. 1962), se blíží fyziologickým podmínkám. Umožňuje zkoumat vlastnosti závislé na biomembránách 27

28 jako je například iontový transport nebo vlastnosti kanálotvorných molekul. Pro účely této práce byly BLM užívány pro zkoumání vlastností pórů, které v membránách tvoří CyaA. CyaA vytvoří v membráně pór, kterým se přesouvají ionty. Tento přesun je možné registrovat jako elektrický proud, tedy zvýšení vodivosti membrány. Název černé lipidové membrány pochází z jejich vlastností, které lze pozorovat optickým zařízením. Umělá fosfolipidová membrána je vytvářena na malém otvoru (řádově desetiny milimetru) v přepážce kyvety, která je naplněná elektrolytem. Při nanášení membrány ze směsi fosfolipidů s organickými rozpouštědly je možno pozorovat barevné interferenční obrazce. Postupně, jak se vytváří dvojvrstva, se nános směsi lipidů ztenčuje a membrána se jeví jako černá. Lipidová dvojvrstva může být vytvořena ze syntetických nebo přírodních lipidů. Přirozeným podmínkám se nejvíce blíží směs několika syntetických či přírodních lipidů. Membrány z čistých lipidů, jako například fosfatidylcholin, fosfatidyletanolamin nebo fosfatidylserin, jsou málo napadány CyaA (Benz et al. 1994). CyaA tvoří v umělých lipidových membránách malé kation-selektivní póry s velmi nízkou vodivostí oproti kanálům, které tvoří HlyA z E. coli (Ludwig et al. 1996; Menestrina and Ropele 1989). Tvorba těchto kanálů je zodpovědná za koloidněosmotickou lyzi erytrocytů (Benz et al. 1994). Výhodou černých lipidových membrán oproti jiným technikám, jako je například měření na lipozomech, je snadné měření vodivosti membrány. Umožňují zaznamenat jednotlivé kanály, které toxin tvoří. Zabudování molekuly proteinu do lipidové membrány vede k okamžitému vzrůstu vodivosti. Můžeme tak rozlišit jednotlivé vodivostní stavy. U lipozomů získáme pouze průměrnou hodnotu, nikoli informaci o výskytu velkých či malých kanálů nebo jak dlouho jsou kanály otevřené. 28

29 3 Materiál a metody 3.1 Seznam použitých chemikálií 1-butanol. Fluka, USA Akylamid, Serva, SRN Ampicilin, Biotika, SR. Azolektin, Sigma, USA Coomassie Brilliant Blue R250, Serva, SRN Diethylaminoethyl-Sepharosa (DEAE-Sepharosa) CL-6B, Sigma-Aldrich, USA Dimethylsulfoxid (DMSO), Sigma-Aldrich, USA Dodecylsulfát sodný (SDS), Serva, SRN Etanol, Lach-Ner, s.r.o., ČR Glycerol, Sigma-Aldrich, USA Chlorid draselný, Lachema, ČR Chlorid vápenatý, Lachema, ČR Chloroform, Lachema, ČR Cholesterol, Sigma-Aldrich, USA Izopropyl β-d-thiogalaktopyranosid (IPTG), Sigma-Aldrich, USA Kyselina octová, Lach-Ner s.r.o., ČR Kyselina ortofosforečná 85%, Lach-Ner s.r.o., ČR Močovina, Merck, SRN n-decane, Sigma, USA Octan draselný, Lachema, ČR 29

30 Tetracyklin, Sigma-Aldrich, USA Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris), Serva, SRN Tris-hydrochlorid (Tris-HCl), Serva, SRN 3.2 Přístrojové vybavení Centrifuga Rotana 406 R, Hettich Zentrigugen, SRN Centrifuga Universal 32 R, Hettich Zentrifugen, SRN Centrifuga Sorvall RC26 Plus, DU Pont Instruments, USA Digitální analytické váhy, Mettler, Bonn, Německo Digitální analytické váhy, OHAUS, Explorer Pro, USA Elektroforéza Mini-PROTEAN II, Bio-Rad, USA Lupa, Carl Zeiss, Lena Magnetické míchadlo, IKA, RH basic 2, Německo Mrazicí box (-20 C), Zanussi, Itálie Mrazicí box (-80 C), Jouan, Francie ph metr, Thermo electron corporation, Orion 2 star, USA Spektrofotometr SECOMAM S.250I+, ALC-SECOMAM, Francie Termostatová vodní lázeň typ UH8, VEB MLW, Mnichov, SRN Ultrasonikátor S3000, Misonix, USA Vortex MS2 minishaker, IKA-Works, Inc., USA Zdroj pro elektroforézu PowerPac, Basic Power Supply, Bio-Rad, USA 30

31 3.3 Roztoky a pufry 30% roztok akrylamidu pro SDS-PAGE elektroforézu Akrylamid... 29% (w/v) N, N -metylen-bisakrylamid... 1% (w/v) Barvící roztok pro SDS-PAGE elektroforézu Metanol ml Voda ml Kyselina octová ml Coomassie Brilliant Blue R ,5 g Činidlo Bradfordové Coomassie Brilliant Blue R ,01% (v/v) Etanol... 4,7% (v/v) H3PO4... 8,7% (v/v) Odbarvovací roztok pro SDS-PAGE elektroforézu Metanol ml Voda ml Kyselina octová ml Rozdělovací gel pro SDS-PAGE elektroforézu 7,5%, ph=8,8 30% roztok akrylamidu... 1,24 ml 31

32 Destilovaná voda... 1,8 ml 1M Tris-HCl pufr (ph=8,8)... 1,87 ml 10% SDS μl 25% APS... 12,5 μl TEMED... 12,5 μl TB pufr HEPES mm CaCl mm KCl mm ph se upraví na 6,7 pomocí 1 M KOH a poté se přidá MnCl2 do výsledné koncentrace 55 mm. Roztok se sterilizuje filtrací přes filtry o velikosti pórů 0,22 μl. TUC pufr Tris-HCl ph= mm Močovina... 8 M CaCl2... 0,2 mm TUE-A pufr, ph=8,0 Tris-HCl mm Močovina... 8 M EDTA... 2 mm 32

33 TUE-B pufr, ph=8,0 Tris-HCl mm Močovina... 8 M EDTA... 4 mm TUN-A pufr, ph=8,0 Tris-HCl mm Močovina... 8 M NaCl mm TUN-B pufr, ph=8,0 Tris-HCl mm Močovina... 8 M NaCl... 8 M NaCl mm Zaostřovací gel pro SDS-PAGE elektroforézu 5%, ph=6,8 30% roztok akrylamidu μl Destilovaná voda... 1,23 ml 1 M Tris-HCl pufr (ph=6,8) μl 10% SDS μl 20% APS μl TEMED... 5 μl 33

34 3.4 Kultivační média LB médium (Luria-Bertani médium) Bacto-tryptone g NaCl... 5 g Kvasniční extrakt... 5 g Deionizovaná voda... doplní se do 1000 ml ph upraveno na hodnotu 7,2 přidáním 5 M NaOH MDO médium, ph=7,0 NaH2PO g Na2HPO g NH4Cl... 2 g Na2SO4... 0,5 g Thiamin... 0 mg Kvasničný extrakt mg Glycerol mg Deionizovaná voda... doplní se do 1000 ml ph upraveno na hodnotu 7,0 přidáním 5 M NaOH Médium sterilováno autoklávem (0,12 MPa, 120 C, 20 min) 3.5 Směsi pro přípravu umělých membrán Směs 1: Membrána azolektin Azolektin... 6 mg Butanol μl 34

35 Decane μl Směs 2: Membrána azolektin, cholesterol 20% Azolektin... 8 mg Cholesterol... 2 mg Butanol... 33,33 μl Decane μl Směs 3: Membrána azolektin, cholesterol 30% Azolektin... 7 mg Cholesterol... 3 mg Butanol... 33,33 μl Decane μl Směs 4: Ošetření teflonové kyvety před nanesením membrány Azolektin mg Chloroform μl Elektrolyty pro měření na umělých membránách KCl, ph=6,6 KCl... 74,55 g Destilovaná voda... doplněno do 1000 ml 35

36 KCl, ph=7,4 KCl... 74,55 g Destilovaná voda... doplněno do 1000 ml Tris mm KCl ph=7,4, glycerol 50 %: KCl 1 M ml Gylcerol ml Tris mm KCl ph=7,4, glycerol 10 %: KCl 1 M ml Glycerol... 5 ml Destilovaná voda ml Tris mm 3.6 Metody a pracovní postupy Pro úplnost uvádím všechny postupy a kroky, které vedou k získání rekombinantního CyaA z E.coli. Osobně jsem se účastnila kroků: Adenylát-cyklázový toxin používaný v mých pokusech pocházel z Akademie věd ČR z laboratoře molekulární biologie bakteriálních patogenů. Koncentrace zásobního roztoku toxinu byla 0,67 mg/ml. Pro produkci CyaA byl použit bakteriální kmen Escherichia coli XL-1 Blue, reca1 enda1 gyra96 thi-1 hsdr17 supe44 rela1 lac [F proab lac1q Z M15Tn10(Tetr)]. 36

37 3.6.1 Produkce a purifikace CyaA Kmeny Escherichia coli XL1-Blue a BL21(λDE3) byly krátkodobě uchovávány na agarových LB plotnách s příslušným antibiotikem při 4 C. Dlouhodobě byly uchovávány ve 40% glycerolu při -80 C Příprava superkompetentních buněk Escherichia coli Na tuhé LB médium s tetracyklinem byla nanesena suspenze buněk dlouhodobě uchovávaného kmene E. coli a dále kultivována (37 C, hodin). Následně byly 2-3 kolonie E. coli z tuhého LB média přeneseny do 50 ml LB média s tetracyklinem a kultivovány přes noc při teplotě 30 C. Druhý den ráno bylo přeneseno 5 ml noční kultury do 500 ml SOB média a pokračovalo se v kultivaci při 30 C za intenzivního třepání a měření optické denzity bakteriální kultury. Po dosažení požadované optické denzity (OD600 = 0,6) byla kultura prudce ochlazena v ledové lázni a poté centrifugována (6000 g, 4 C, 10 minut). Sediment bakteriálních buněk E. coli byl resuspendován ve 32 ml ledového TB pufru. Následovala inkubace buněčné suspenze v ledové lázni (4 C, 10 minut) a opětovná centrifugace buněk (6000 g, 4 C, 10 minut). Po odstranění supernatantu byl sediment bakteriálních buněk resuspendován ve 4 ml ledového TB pufru. Poté bylo přidáno DMSO do koncentrace 7 % (v/v) a po inkubaci v ledové lázni (4 C, 10 minut) byla buněčná suspenze rozplněna po 200 μl do mikrozkumavek a zamražena v tekutém dusíku. Takto připravené superkompetentní buňky E. coli byly dlouhodobě uchovávány při teplotě 80 C Transformace plazmidové DNA do kompetentních buněk K 50 μl suspenze superkompetentních buněk byl přidán 1 μl plazmidové DNA (pcact3) ze zásobních roztoků. Obsah byl šetrně, ale důkladně, zamíchán. Směs byla inkubována (4 C, 10 minut) a následně přenesena na 5 minut do vodní lázně o teplotě 37 C a poté ochlazena po dobu 2 minut v ledu. Po přidání 1 ml předehřátého tekutého LB média byla kultura inkubována 60 minut (37 C). Během této doby se plazmid uvnitř transformovaných buněk replikuje a zároveň dochází k produkci určitého množství β-laktamázy. Nakonec bylo vyseto μl suspenze na tuhé LB médium s příslušným antibiotikem. Buňky byly inkubovány (37 C, hodin). 37

38 3.6.4 Produkce toxinu v 500 ml kulturách Buňky E.coli byly transformovány plazmidem určeným k expresi požadovaného proteinu a inkubovány přes noc na tuhém LB médiu s ampicilinem. Druhý den byly do 50 ml tekutého MDO média, obsahujícího ampicilin, přeneseny 2-3 bakteriální kolonie, které nesly plazmid s požadovaným genem, a bakterie byly kultivovány za stálého třepání (37 C, hodin). Poté bylo odebráno 5 ml pro zaočkování 500 ml čerstvého MDO média s ampicilinem. Bakteriální kultura byla inkubována za nepřetržitého třepání při teplotě 37 C do optické denzity OD600 = 0,6. Poté byla produkce proteinu indukována přídavkem IPTG, protože geny kódující CyaA, popřípadě CyaC, jsou pod kontrolou inducibilního lac promotoru. Kultura se za stálého třepání nechala růst další 4 hodiny. Nakonec byla kultivace bakterií ukončena prudkým ochlazením narostlé bakteriální kultury v ledové lázni. Pro analýzu množství proteinu v buňkách E.coli byl z narostlé bakteriální kultury odebrán vzorek (1 ml), který byl centrifugován (12000 g, pokojová teplota, 1 minuta). Po odstranění supernatantu byl pelet buněk resuspendován ve 200 μl TUC pufru. Následně bylo odebráno 20 μl této směsi pro analýzu množství vyprodukovaného toxinu pomocí SDS-PAGE Příprava močovinového extraktu CyaA a jeho derivátů Narostlá bakteriální kultura byla po kultivaci centrifugována (4000 g, 4 C, 20 minut). Pelet buněk byl resuspendován v TUC pufru (10 ml) a sonikován (2 minuty, 35 W, 0 C, 15 sekund sonikace, 60 sekund pauza pro chlazení). Po sonikaci byly zbývající celistvé buňky odstraněny centrifugací (18000 g, 4 C, 30 minut). Protein přítomný v inkluzních tělíscích bakterií se poté nacházel v peletu. Supernatant byl odstraněn a membrány buněk byly odstraněny opatrným odmýváním sedimentu v TUE-B pufru. Inkluze s proteinem byly poté resuspendovány v deionizované vodě a celý obsah zkumavky byl centrifugován (18000 g, 4 C, 10 minut). Supernatant byl znovu odstraněn a k vytvořenému peletu bylo přidáno 4,8 g pevné močoviny a 6 ml 50 mm roztoku Tris-HCl (ph=8,0). Obsah zkumavky byl šetrně promíchán po dobu 45 minut, aby došlo k úplnému rozpuštění močoviny na výslednou koncentraci 8 M. Obsah zkumavky byl poté centrifugován (18000 g, 4 C, 30 minut). Supernatant (močovinový extrakt) obsahující denaturovaný CyaA byl převeden do nových zkumavek 38

39 a uchováván při teplotě -20 C. Pro analýzu množství toxinu v močovinovém extraktu byla použita SDS-PAGE Purifikace proteinu iontoměničovou chromatografií na DEAE-Sepharose Chromatografická kolona byla naplněna 10 ml DEAE-Sepharosy a promyta deionizovanou vodou. Tím dojde k odstranění etanolu, ve kterém je CyaA uchováván. Kolona byla ekvilibrována TUN-A pufrem do doby, než ph pufru vytékajícího z kolony bylo stejné jako ph nanášeného pufru. V močovinovém extraktu připraveném k purifikaci byla upravena koncentrace NaCl na výslednou hodnotu 50 mm. Takto upravený vzorek byl nanesen na předem připravenou kolonu s DEAE-Sepharosou, kde došlo k zachycení CyaA. Většina kontaminujících proteinů byla odstraněna promýváním kolony TUN-A pufrem. Navázaný toxin byl z kolony eluován roztokem TUN-B. Během eluce bylo množství proteinu měřeno orientačním testem podle Bradfordové (10 μl eluovaného vzorku a 90 μl činidla Bradfordové). Přítomnost a čistota získaného CyaA z DEAE-Sepharosy byla poté zjištěna pomocí SDS-PAGE Purifikace proteinu hydrofobní chromatografií na Phenyl-Sepharose Chromatografická kolona byla naplněna 2 ml Phenyl-Sepharosy a promyta deionizovanou vodou, aby došlo k odstranění etanolu, ve kterém byla matrice uchovávána. Poté byl ekvilibrován TN pufrem. Vzorek, který obsahoval požadovaný toxin a byl purifikován na iontoměničové DEAE- Sepharose v předchozím kroku, byl čtyřikrát zředěn pomocí TN pufru a nanasen na kolonu s Phenyl-Sepharosou. Kolona byla poté promyta 20 ml 50 mm Tris-HCl (ph=8,0). Toxin navázaný na Phenyl-Sepharosu byl eluován TUE-A pufrem a odebírán postupně v 1 ml frakcích. Množství proteinu bylo v každé frakci měřeno orientačním testem podle Bradfordové (10 μl frakce a 90 μl činidla Bradfordové). Přítomnost a čistota CyaA v jednotlivých frakcích byla poté zjišťována pomocí SDS- PAGE. Konečné stanovení koncentrace proteinu v jednotlivých frakcích bylo provedeno metodou podle Bradfordové SDS-polyakrylamidová elektroforéza Ke 20 μl proteinu bylo přidáno 5 μl pětkrát koncentrovaného vzorkového pufru určeného pro elektroforézu v SDS-polyakrylamidovém gelu. Po zahřátí na 100 C po 39

40 dobu 5 minut byly takto připravené vzorky nanášeny na gel, který se skládal z horního 5% zaostřovacího gelu a ze spodního 7,5% rozdělovacího gelu. Elektroforéza byla nastavena na konstantní proud 30 ma, použitý pufr byl Tris-glycinový o ph = 8,3. Po proběhnutí elektroforézy byl odstraněn zaostřovací gel a rozdělené proteiny byly vizualizovány barvicím roztokem SDS-PAGE s Coomassie Brilliant blue R-250. Gel byl následně odbarven v odbarvovacím roztoku pro SDS-PAGE, promyt destilovanou vodou a vysušen. Pro porovnání molekulové hmotnosti rozdělených proteinů byl použit standard molekulových hmotností PageRuler Unstained Protein Ladder Stanovení koncentrace proteinů Ke stanovení koncentrace proteinů ve vzorku bylo použito metody Bradfordové. Byla připravena série ředění BSA v rozmezí μl/ml, která sloužila jako kalibrační standard. K ředění byl použit stejný pufr, který je užíván k přípravě měřeného vzorku. Poté bylo ke 100 μl jednotlivých ředění standardů, vzorků a samotného pufru, který sloužil jako referenční standard, přidáno 900 μl čnidla Bradfordové. Vzorky byly promíchány a inkubovány při pokojové teplotě 15 minut. Poté byla měřena absorbance série standardů a měřeného vzorku proti referenčnímu standardu při vlnové délce 595 nm. Nakonec byla sestavena kalibrační křivka, z níž byla odvozena koncentrace proteinu ve vzorku Měření na černých lipidových membránách Aparatura pro BLM Měření na černých lipidových membránách jsem prováděla pomocí aparatury pro BLM, Obr. 7. Aparatura se skládala z teflonové kyvety, elektrod, přepínače pro nastavení elektrického napětí, baterií, Faradayovy klece, lupy. Celé zařízení bylo umístěno na mramorové desce se vzduchovým odpružením, aby případné mechanické otřesy nerušily měření. Faradayova klec pak sloužila podobně pro odstínění elektrického rušení. 40

41 Obr. 7 Aparatura pro měření na BLM. Teflonová kyveta byla rozdělena na dvě části přepážkou. Čelní stěny byly tvořeny sklem, aby bylo možné pozorovat stav membrány. V přepážce kyvety byl otvor o průměru přibližně 0,5 mm. Membrána byla vytvářena nanášením směsi lipidů přes otvor v přepážce. Složení membrány záviselo na druhu pokusu. Nejčastěji jsem používala azolektin (směs fosfolipidů ze sójových bobů) rozpuštěný v n-dekanu a butanolu (9:1 v/v). Pro některá měření byl ještě přidán cholesterol. Jako elektrolyt jsem používala roztok KCl o koncentraci od 100 mm do 1 M, 50 mm Tris, ph = 7,4. K měření elektrického proudu jsem užívala Ag/AgCl elektrody, zesilovač Femto LCA- 4k-1G a LCA G. Signál byl digitalizován kartou Keithly KPCI-3108 a následně zpracováván v softwaru BLM2 (vytvořeno doc. Jiřím Bokem, MFF, Univerzita Karlova v Praze). Pro vkládání napětí na membránu sloužily dvě AA baterie. Hodnota napětí byla dle potřeby měněna přepínačem napětí (odporovým děličem). Před samotným měřením bylo nutné teflonovou kyvetu vymýt od případných kontaminací. Nejdříve jsem ji vypláchla horkou vodou a poté etanolem. Nechala jsem kyvetu přibližně minut vyschnout a poté jsem na otvor v přepážce kyvety a jeho 41

42 okolí nanesla směs azolektinu s chloroformem (Směs 4). Tato směs byla užívána z důvodů vlastností teflonové kyvety, jejíž výhodou je, že je inertní a snadno omyvatelná, zároveň je však lipofobní a je tedy nutné ji před samotným nanášením azolektinové membrány ošetřit malým množstvím (cca 1-5 μl) směsi lipidů s chloroformem. Po minutách od nanesení směsi chloroformu a lipidů jsem naplnila obě části kyvety elektrolytem. Objem elektrolytu byl na každé straně přepážky 2,5 ml. Na jednu stranu přepážky jsem přidala CyaA wt (wild type, divoký typ toxinu). Strana, na kterou byl přidáván toxin, je označována jako cis Obr. 8. Takovéto uspořádání napodobuje cytoplazmatickou membránu cílové buňky (Karimova et al. 1998). Na cis stranu jsem také přidávala 2 mm CaCl2. Před každým měřením bylo vždy nutné zjistit čistotu kyvety, tedy zda se v kyvetě nevyskytuje kontaminace. Do kyvety jsem na cis stranu přidala CaCl2 a pipetou promíchala její obsah. Takto připravenou kyvetu jsem vložila do aparatury pro měření na černých lipidových membránách, ponořila jsem elektrody do kyvety, zavřela aparaturu a spustila měření. Pokud se v záznamu bez přidání CyaA objevila kontaminace, bylo nutné kyvetu opět vyčistit výše popsaným postupem. Pokud se žádná kontaminace neobjevila během přibližně 10 minut záznamu a na průměrně 3-5 membránách, přidala jsem toxin na cis stranu, promíchala pipetou a mohla jsem přistoupit k samotnému měření. Během jednoho dne měření jsem vytvořila přibližně membrán. Azolektinové membrány měly životnost průměrně 5-10 minut, někdy i méně. Membrány s přídavkem cholesterolu byly stabilnější a měly průměrnou životnost o něco delší, okolo 10 minut. 42

43 Obr. 8 Schéma pokusu z hlediska přidání CyaA. Strana, na kterou byl přidáván toxin, je označována jako cis. Na stejnou stranu jako CyaA byly přidávány vápenaté ionty ve formě 2 mm CaCl 2. Na cis stranu bylo vkládáno kladné napětí, na trans stranu záporné. Koncentrace elektrolytu se měnila v závislosti na pokusu od 0,1 M až 1 M Záznam jednotlivých CyaA kanálů Na membránu bylo vkládáno napětí o známé hodnotě. V mém případě to bylo v rozmezí hodnot -18 mv až 92 mv. Při konkrétní hodnotě nastaveného elektrického napětí byl měřen elektrický proud, který procházel pórem tvořeným CyaA. Zabudování molekuly CyaA do umělé fosfolipidové membrány a otevření kanály bylo možné sledovat jako nárůst naměřeného elektrického proudu. Jednotlivé kanály byly zaznamenávány programem BLM2. Samotné zpracování probíhalo v programu QuB (Milescu, Nicolai, and Bannen 2013). Pro názornost uvádím na Obr. 9 záznam ze softwaru QuB, abych zde ukázala, která měření jsem brala v potaz při vyhodnocování. Na obrázku je znázorněn průběh měřeného elektrického proudu v čase. V okamžiku, kdy se molekula CyaA zabuduje do membrány, je patrný nárůst elektrického proudu. V části A je zobrazen výběr kanálů, které je možné dále vyhodnocovat. V části B je záznam, který není možné vzít do vyhodnocování. Nelze zde rozeznat jednotlivé kanály. 43

44 Změřené hodnoty elektrického proudu byly vynášeny v závislosti na elektrickém napětí do grafu. Na Obr. 10 je záznam jednotlivých kanálů při různých hodnotách elektrického napětí. Obr. 9 Výběr záznamu pro další zpracovávání. Červenou barvou je znázorněn průběh měřeného elektrického proudu v čase. Nárůst elektrického proudu směrem nahoru znázorňuje elektrický proud, který prochází kanálem CyaA po jeho zabudování do membrány. V části A je znázorněn kanál, který je možné vzít pro další pracování. Je zde patrný nárůst změřeného elektrického proudu, když se CyaA kanál otevřel, byl určitou dobu otevřený, a poté se opět zavřel. V části B je záznam, který nelze dále zpracovávat. Z jednoho dne měření vzniklo průměrně výřezů kanálů, které byly dále zpracovány. Počet otevření a zavření kanálů v jednotlivých výřezech záviselo na konkrétním výběru. Ukázkový výřez a jeho analýza jsou zobrazeny na Obr

45 Obr. 10 Záznam jednotlivých kanálů při různých hodnotách elektrického napětí. V levé části zobrazeny ukázkové výřezy měření z programu QuB. Každý bod v grafu odpovídá jednomu takovému výřezu. Data slouží ke stanovení iontové selektivity, které probíhá v gradientu elektrolytů na stranách membrány. 45

46 Obr. 11 Analýza výřezu v programu QuB. Červená linie znázorňuje změřený elektrický proud procházející kanálem CyaA. Modrá linie zobrazuje analýzu tohoto kanálu, počet otevření (horní úroveň linie) a zavření (spodní úroveň linie) kanálu CyaA. V tomto výřezu se kanál 17x otevřel a 18x zavřel. Záznam při 54 mv, záznam signálu nefiltrován Stanovení iontové selektivity kanálů CyaA Každá buňka je od svého okolí ohraničena buněčnou membránou. Uvnitř a vně buňky je různá koncentrace iontů. Tok různých iontů přes membránu je dán koncentračními gradienty mezi oběma stranami membrány, propustností pro jednotlivé ionty a rozdílem napětí na membráně. Iontovou selektivitu kanálů, zabudovaných do umělé fosfolipidové dvojvrstvy, je tedy možné definovat jako poměr propustnosti kanálu pro jednotlivé kationty a anionty. Stanovení iontové selektivity vychází z Goldman-Hodgkins-Katzovy rovnice (Rovnice 1). Máme-li membránu, na které je koncentrační gradient a známe-li koncentrace iontů na obou stranách membrány, můžeme pomocí Goldman-Hodgkins- Katzovy rovnice vypočítat hodnotu elektrického napětí vznikajícího samovolně na membráně. Rovnice 1 U elektrické napětí (V) R plynová konstanta; 8,31 (J.mol -1.K -1 ) T teplota, 293 (K) 46