Diagnostika bronchiálního ho astmatu HPLC/MS analýzou Kamila Syslová Ústav organické technologie
Bronchiální astma Civilizační onemocnění rostoucí počet případů snižující se věková hranice prvních projevů -u více než 50% nemocných výskyt do 3 let věku astma kojenců a batolat Leukotrieny Bronchokonstrikce hladkého svalstva bronchů a bronchiol Překrvení a otok sliznice Zvýšená sekrece hlenu Opakované epizodická stavy výdechové dušnosti Astmatický záchvat Astma atopické - alergická reakce na cizorodé látky inhalované částice - prach, pyly, plísně, roztoči, nebo požité potraviny či léky pylové zrno ambrózie roztoč Astma neatopické vyvolává fyzická, psychická zátěž, stres, změna teploty a tlaku, infekce
Diagnostika bronchiálního lního astmatu Vyšetření Invazivní zatěžují organismus pacienta, může vzniknout astmatický záchvat Kožní imunologické vyšetření Bronchoprovokační test provádí se nespecifickým podnětem histamin, acetylcholin Neinvazivní Poslechově pískot, šumy vyskytuje i u jiných nemocí Spirometricky - měří ventilační funkce plic Analýza dechového kondenzátu HPLC/MS metodou spirometr
Membránové fosfolipidy glutamyltransferáza Leukotrieny v lidském m organismu fosfolipáza A 2 HOOC LTC 4 CH 2 CH 2 CH NH 2 Markery bronchiálního astmatu Kyselina arachidonová LTA 4 OH S O NH CH 2 N CH H 2 CH 2 O CH NH 2 5-lipoxygenáza glutation S transferáza glutation OH O LTA 4 hydroláza OH LTB 4 LTD 4 OH S O NH 2 NH C H2 H 2 N CH 2 dipeptidáza LTE 4 OH S NH 2
Dechový kondenzát Aerosolové částice ve vydechnutém vzduchu odráží složení bronchoalveolární extraceluární tekutin, která koresponduje s ději odehrávajících se v plicích Složení dechového kondenzátu: -plynnáfáze -těkavé látky (CO,CO 2, NO) - kapalná fáze ve formě aerosolů vodní fáze, H 2 O 2 a netěkavé látky - metabolity kyseliny arachidonové, řada proteinů, histamin, serotonin, vazoaktivní peptidy náustek lamelární kondensátor kondenzovaný vzorek chladící manžeta jednosměrný dechový ventil
Kapalinová chromatografie - HPLC Separační metoda pro MS u vysokomolekulárních (netěkavých) látek HPLC kolona Pumpa Autosampler nástřik vzorku pumpa vstup do MS MS HPLC kolony mobilní fáze
Hmotnostní spektrometr Vstup do MS Ionizace Separace iontů Detektor Hmotové spektrum Ionizace Podmínka pro MS -molekula v plynné fázi a iontovém stavu ESI Ionizace pomocí ESI ElectroSpray Ionisation sprejovací kapilára Taylorův kužel rozpouštědlo - - - - + + - - - - - + + ++ + - odpařování rozpouštědla Culombická exploze analyzované molekuly nabité kapičky + Zdroj vysokého - napětí analyzované ionty
Hmotnostní spektrometr Separace iontů Kvadrupolový separátor Hmotnostní spektrometr se třemi kvadrupoly kvadrupolové tyče ionty + - - + turbomolekulární pumpa Q1 ESI kolizní kvadrupol detektor Q3 průřez kolizním kvadrupolem
Imunoseparace Známé množství izotopově značeného standardu Sorbenty s antileukotrieny Dechový kondenzát SPE (Solid Phase Extraction) Molekuly imunochemicky navázané na sorbent Molekuly nepodlehlé imunochemické reakci Použitá antiséra na pevném sorbentu - odpad Zkoncentrované molekuly po imunoseparaci Zkoncentrované molekuly po SPE Biologický vzorek bez sledovaných molekul - odpad HPLC/MS analýza
MS/MS mode MRM multiple reaction monitoring -analýza většího počtu iontů současně SRM selected reaction monitoring -analýza jednoho iontu, vysoká selektivita a citlivost (fg/µl) i pro vzorky se složitou matricí LTD 4 LTE 4 100% 176 75% MRM spektrum LTD 4 LTD 4 LTC 4 142 177 Optimalizace kolizní energie u LTD 4 50% 25% 495 0% 100% 75% 50% 167 460 493 317 113 100 200 300 400 500 SRM spektrum LTD 4 176 m/z Relativní intenzita % 100 80 60 40 20 0 8 16 24 Collision energie [ev] 25% ion 495,2 ion 176 malé fragmenty
Výsledky měřeníěřen Kalibrační křivka LTE 4 1200000 1600000 Area 800000 400000 0 0 100 200 300 400 500 C(pg/20µl) LTD 4 Mez detekce: 0,05 pg/µl Mez kvantifikace: 0,1 pg/µl LTC 4 Kinetika LTC 4, LTD 4, LTE 4 LTD 4 LTC 4 LTE 4 c (pg/ml) 0 5 hod. Čas
Výsledky 200 180 160 (LTC 4, LTD 4, LTE 4 ) [pg/ml] 140 120 100 80 60 40 20 0 zdraví astmatici Fyziologická hladina: 1-100 pg/ml Patologická hladina: > 110 pg/ml
Závěrem Byla vyvinuta metoda pro detekci leukotrienů jako markerů bronchiálního astmatu Odběr vzorku Uchování vzorku při 80 C Extrakce monitorovaných látek- využití imunoseparace Diagnóza Kvalitativní a kvantitativní informace o markeru HPLC/MS analýza Touto metodou bylo vyšetřeno cca 500 pacientů Dlouhodobá klinická studie bude probíhat v následujících 3 letech na 1. LF UK
Děkuji za pozornost