nastavení real-time PCR cykleru CFX 96 Real-Time System

Verze: 1.2 Datum poslední revize: 24.9.2014 nastavení real-time PCR cykleru CFX 96 Real-Time System (BioRad) generi biotech

OBSAH 1. Spuštění již existujícího či nastavení nového teplotního profilu...3 1.1. Spuštění již uloženého teplotního profilu...3 1.2. Nastavení nového teplotního profilu...8 2. Odečet hodnot Ct...15 3. Vyhodnocení alelické diskriminace...21 generi biotech 2/24

1. Spuštění již existujícího či nastavení nového teplotního profilu 1.1. Spuštění již uloženého teplotního profilu 1.1.1. Před vložením CFX plata se vzorky do real-time PCR cykléru jej stočte na centrifuze. 1.1.2. Vložte plato do cykléru (ujistěte se, že je plato v cykléru umístěno správně souřadnice A1 v levém horním rohu) 1.1.3. Pomocí ikony Bio-Rad CFX Manager spusťte software cykléru (Verze 2.0) U novějších software (např. verze 3.1) je třeba vybrat typ runu User-defined generi biotech 3/24

1.1.4. Vyberte možnost nový run (Create a new Run) (Verze 2.0) generi biotech 4/24

1.1.5. V záložce Protocol zvolte již existující profil Select Existing Po otevření okna vyberte zvolený profil a otevřete jej. Následně se vám název zvoleného profilu zobrazí v rámečku Selected Protocol V rámečku Preview je možno zkontrolovat nastavení teplotního profilu, snímání plata, objem vzorku ( Sample Volume ) a počet opakování cyklů generi biotech 5/24

1.1.6. Po stisknutí tlačítka Next se dostanete do záložky Plate, kde je možno zkontrolovat, zda je v profilu nastaveno správné rozvržení plata a snímané fluorescenční kanály ( Fluorophores ) generi biotech 6/24

1.1.7. Po stisknutí tlačítka Next se dostanete do záložky Start Run, kde lze spustit run. Po zmáčknutí tlačítka Start Run se objeví vámi přednastavená složka, do které bude soubor uložen. Po stisknutí tlačítka Uložit (Save) se run spustí a po skončení zůstane v této složce uložen. generi biotech 7/24

1.2. Nastavení nového teplotního profilu 1.2.1. Před vložením CFX plata se vzorky do real-time PCR cykléru jej stočte na centrifuze. 1.2.2. Vložte plato do cykléru (ujistěte se, že je plato v cykléru umístěno správně souřadnice A1 v levém horním rohu) 1.2.3. Pomocí ikony Bio-Rad CFX Manager spusťte software cykléru a vyberte nový run (Create a new Run) (verze 2.0) U novějších software (např. verze 3.1) je třeba vybrat typ runu User-defined generi biotech 8/24

1.2.4. Nastavení teplotního profilu vám umožní Startup Wizard 1.2.5. V záložce Protocol zvolte Create New generi biotech 9/24

1.2.6. V nově otevřeném okně lze nastavit parametry teplotního profilu Nejprve nastavte objem reakce (obvykle 20 nebo 25 µl) Ve světle modře vybarveném poli je možno měnit nastavení teplotu a čas (jak dlouho bude zvolená teplota udržována) změna se provede dvojitým kliknutím na číslo v tmavě modrém políčku Je zde možnost nastavit počet opakování. Pokud si přejete, aby byl úsek označený tmavě červenou šipkou opakován např. 40, je potřeba zvolit počet opakování 39 (tedy kolikrát se bude opakovat, ne kolikrát celkem proběhne) V levé dolní části okna je možno teplotní profil upravovat pomocí Vložení kroku Vložení gradientu teploty (podrobně viz dále) Vložení opakování určitých kroků Vložení křivky tání Přidaného snímání destičky navíc Nastavení teploty a doby daného kroku Odstranění kroku generi biotech 10/24

1.2.6.1. Nastavení gradientu teploty Po stisknutí tlačítka Insert Gradient je možné do teplotního profilu zařadit gradient teploty. Změna se provede dvojitým kliknutím na číslo v tmavě modrém políčku, přičemž se nastavuje minimální a maximální hodnota. Teplotní rozmezí gradientu je pak zobrazeno v pravé dolní části okna. 1.2.7. Jakmile je profil nastaven, po stisknutí tlačítka OK budete vyzváni k uložení souboru. generi biotech 11/24

1.2.8. V záložce Plate zvolte opět tlačítko Create New V okně Plate Editor - New je možno nastavit vzhled plata, snímání ve fluorescenčních kanálech, skupiny vzorků apod. Tlačítkem Select Fluorophores je možno zvolit fluorescenční kanály, ve kterých chcete snímat signál generi biotech 12/24

1.2.9. Po stisknutí tlačítka OK budete vyzváni k uložení nastavení. Název souboru bude zobrazován v nabídce Express Load při každém dalším spuštění runu. generi biotech 13/24

1.2.10. Po stisknutí tlačítka Next se dostanete do záložky Start Run, kde lze spustit run. Po zmáčknutí tlačítka Start Run se objeví vámi přednastavená složka, do které bude soubor uložen. Po stisknutí tlačítka Uložit (Save) se run spustí a po skončení zůstane v této složce uložen Pro zobrazení odečtu času zbývajícího do konce runu klikněte chvilku po spuštění runu na záložku Time Status. generi biotech 14/24

2. Odečet hodnot Ct 2.1. Spusťte program Bio-Rad CFX Manager na vašem počítači a pomocí ikony otevřete požadovaný soubor 2.2. V záložce Quantification zvolte flouorecenční kanály, ve kterých byl run snímám a zašktrněte Log Scale v případě, že chcete hodnoty převést do logaritmické škály (doporučeno) generi biotech 15/24

2.3. Následně je třeba nastavit hodnotu threshold (linie prahového cyklu by měla být umístěna v polovině lineální části křivky při zobrazení v logaritmické škále) V záložce Settings Baseline Threshold je zobrazena hodnota automaticky zvolené hodnoty threshold ( Auto Calculated ) nebo si můžete hodnotu zvolit podle svého uvážení ( User Defined ) generi biotech 16/24

Pro případ nevhodně vypočítané hodnoty Baseline Cycles pro některou z křivek je možné upravit rozsah manuálně v polích Begin a End (v režimu User Defined ) generi biotech 17/24

2.4. Chcete-li si vzorky barevně rozlišit, stiskněte ikonu Trace Style a po označení zvolených vzorků na platu vyberte v kolonce Selected Wells barvu, kterou chcete vybrané vzorky označit. Postup lze opakovat pro více barev (např. barevné rozlišení NTC, standardu a vzorků) 2.5. Jamky plata, které neobsahovaly žádné vzorky je možné odoznačit (šedá barva). Nebudou se dále zobrazovat jejich hodnoty Ct. generi biotech 18/24

2.6. Pro zobrazení hodnot Ct nejdříve nastavte správný mód. V záložce Settings Analysis Mode zvolte možnost Baseline Subtracted Curve Fit (verze 2.0) Pro zobrazení hodnot Ct nejdříve nastavte správný mód. V záložce Settings Baseline Setting zvolte možnost Baseline Subtracted Curve Fit (verze 3.1) 2.7. V záložce Quantification Data s volbou Results je pak zobrazeno: označení jamky ( Well ) zvolený fluorofor ( Fluor ) hodnoty prahového cyklu ( Threshold Cycle ) generi biotech 19/24

Kliknutím na položku v liště (na obrázku vyznačeno zelenou šipkou) se hodnoty seřadí podle této zvolené položky. Lze také sloupce mezi sebou různě přesouvat Poznámka: Funkci zvýraznění křivky, je-li na ní zrovna umístěný kurzor myši lze vypnout v nabídce Settings Mouse Highlighting. 2.8. Další záložky Run Information V této záložce jsou uvedeny parametry proběhlého runu: teplotní profil a jeho název, datum a čas runu nebo např. objem reakce. Gene Expression End Point Allelic Discrimination (viz kapitola 3) Data pro alelickou diskriminaci musí pocházet z multiplex reakce s obsahem nejméně dvou fluoroforů. Pomocí jednoho fluoroforu je možné identifikovat jeden typ alely ve vzorku. generi biotech 20/24

3. Vyhodnocení alelické diskriminace 3.1. Po spuštění programu (dvojklikem na soubor s příponou.pcrd ) nejprve odstraňte fluorescenční kanály, které nechcete mít zobrazeny. Při vyhodnocování alelické diskriminace se používají dva různé fluorescenční kanály (obvykle FAM/Sybr a HEX/JOE). generi biotech 21/24

3.2. V záložce Allelic Discrimination se zobrazí jednotlivé vzorky rozdělené podle genotypu. V levém horním okně jsou data znázorněna v grafu, kde na ose x jsou RFU ( relative fluorescence units ) pro alelu 1 a na ose y pro alelu 2. Skupina heterozygotních vzorků leží mezi oběma homozygoty. V pravém horním okně se zobrazí tabulka s výslednými genotypy pro jednotlivé vzorky (sloupec Call ) včetně hodnot RFU. Poznámka: jamky plata, které neobsahovaly žádné vzorky je možné odoznačit (šedá barva). Nebudou se dále zobrazovat jejich genotypy. generi biotech 22/24

3.3. Další způsob grafického znázornění jednotlivých genotypů se objeví po zaškrtnutí volby Polar Coordinates. Na ose x je zobrazen úhel (vztahuje se k zobrazení bez této volby - viz předchozí kapitola). (verze 3.1) generi biotech 23/24

3.4. Po zaškrtnutí volby View call map se jednotlivé jamky na platu vybarví podle příslušného genotypu. (Zde oranžová WT, zelená HET, modrá MUT). generi biotech 24/24