MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE VIRULENČNÍ FAKTORY ESCHERICHIA COLI Bakalářská práce Iva Jaborníková Vedoucí práce: doc. MUDr. David Šmajs, Ph.D. Brno 2013

Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Iva Jaborníková Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Virulenční faktory Escherichia coli Experimentální biologie Speciální biologie, zaměření Mikrobiologie a molekulární biotechnologie doc. MUDr. David Šmajs, Ph.D. Akademický rok: 2012/2013 Počet stran: 54 Klíčová slova: Virulenční faktory, Escherichia coli, patogen, enterocyt

Bibliographic Entry Author Title of Thesis: Degree programme: Field of Study: Supervisor: Iva Jaborníková Faculty of Science Masaryk University Department of Experimental Biology Bacterial virulence factors of Escherichia coli Bachelors degree programme Special Biology, specialization Microbiology and molecular biotechnology doc. MUDr. David Šmajs, Ph.D. Academic Year: 2012/2013 Number of Pages: 54 Keywords: Virulence factors, Escherichia coli, pathogen, enterocyte

Abstrakt Virulenční faktory jsou proteiny nebo jiné molekuly, které u bakterií podmiňují jejich patogenitu, tj. schopnost infikovat eukaryotické organizmy a způsobovat jejich poškození. Obecně můžeme tyto faktory charakterizovat jako produkty metabolismu, struktury buňky a různé proteiny. Kromě symbiotických bakterií Escherichia coli existují i kmeny, které kódují rozmanité faktory virulence a jsou tudíž schopny kolonizovat a napadat tkáně hostitele. Bakalářská práce shrnuje všechny známé a potenciální virulenční faktory Escherichia coli a charakterizuje patotypy, do kterých se bakterie tohoto druhu podle kódovaných faktorů virulence dělí. Abstract Virulence factors are specific proteins or other molecules which ensure pathogenicity in bacteria, i.e. the ability to infect eukaryotic organisms and cause their damage. In general, these factors can be characterized as products of metabolism, cell structures and various proteins. In addition to symbiotic Escherichia coli, there are also strains which encode different virulence factors and are thus able to colonize and attack host tissues. This thesis summarizes all known and potential virulence factors of Escherichia coli and characterizes pathotypes of this bacterium.

Poděkování Ráda bych zde poděkovala svému vedoucímu bakalářské práce doc. MUDr. Davidu Šmajsovi, Ph.D, a své konzultantce Mgr. Lence Micenkové za odbornou pomoc, cenné rady, připomínky a čas, který mi při vytváření práce věnovali. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Lukáši Chrástovi a Mgr. Juraji Bosákovi za odbornou konzultaci. Děkuji mé rodině za podporu v průběhu celého mého studia. Práce byla vypracována na pracovišti Biologického ústavu LF MU v Brně.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 7. května 2013 Iva Jaborníková

Obsah 1. ÚVOD... 13 2. CÍL PRÁCE... 14 3. CHARAKTERISTIKA RODU ESCHERICHIA... 15 3.1. TAXONOMIE... 15 3.1.1. ESCHERICHIA ALBERTII... 15 3.1.2. ESCHERICHIA COLI... 15 3.1.3. REKLASIFIKACE NĚKOLIKA DRUHŮ ESCHERICHIÍ... 15 3.1.4. PROBLEMATIKA RODU ESCHERICHIA A SHIGELLA... 17 3.2. GENETICKÁ INFORMACE BAKTERIE ESCHERICHIA COLI... 18 4. ROZMANITOST UVNITŘ DRUHU E. COLI... 20 5. VIRULENČNÍ FAKTORY... 21 5.1. GENY VIRULENCE... 21 5.2. PATOGENNÍ E. COLI... 23 6. ENTEROTOXIGENNÍ E. COLI... 26 6.1. VIRULENČNÍ FAKTORY... 26 6.1.1. TEPELNĚ LABILNÍ TOXIN... 26 6.1.2. TEPELNĚ STABILNÍ TOXIN... 28 6.1.3. KOLONIZAČNÍ FAKTORY... 28 7. ENTEROPATOGENNÍ E. COLI... 30 7.1. VIRULENČNÍ FAKTORY... 30 7.1.1. ATTACHING-EFFACING LÉZE... 30 8. ENTEROHEMORAGICKÁ/SHIGATOXIGENNÍ E. COLI... 33 8.1. VIRULENČNÍ FAKTORY... 34 8.1.1. SHIGATOXIN... 34 8.1.2. ENTEROHEMOLYZIN... 35 9

8.1.3. INTIMIN... 35 8.1.4. PO157 PLAZMID... 35 9. ENTEROAGREGATIVNÍ E. COLI... 36 9.1. VIRULENČNÍ FAKTORY... 37 9.1.1. ADHEZINY... 37 9.1.2. ENTEROTOXIN EAST1... 37 10. DALŠÍ SKUPINY INTESTINÁLNÍCH E. COLI... 39 11. EXTRAINTESTINÁLNÍ E. COLI... 41 12. DALŠÍ POTENCIÁLNÍ VIRULENČNÍ FAKTORY... 43 12.1. KOMBINACE VIRULENČNÍCH FAKTORŮ... 43 13. ZÁVĚR... 44 10

Seznam zkratek A/E léze AA AIEC AK bp BFP camp CF CFA CS DA DAEC DNA EAEC EAHEC EHEC EIEC EPEC ETEC EPEC způsobující vymizení mikroklků střeva (attaching effacing lesion) agregativní adherence (aggregative adherence) adherentně invazivní E. coli (adherent-invasive E. coli) aminokyselina párů bází (base pair) pilusy tvořící svazky (bundle forming pilus) cyklický adenosinmonofosfát (cyclic adenosine monophosphate) kolonizační faktor (colonizating factor) kolonizační antigeny fimbrií (colonization fimbriae antigens) povrchový antigen (coli surface antigen) difuzní adherence (diffuse adherence) difuzně adherentní E. coli (diffusely adherent E. coli) deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid) enteroagregativní E. coli (enteroaggregative E. coli) enteroagregativní-hemoragická E. coli (enteroaggregative hemorrhagic E. coli) enterohemoragická E. coli (enterohemorrhagic E. coli) enteroinvazivní E. coli (enteroinvasive E. coli) enteropatogenní E. coli (enteropathogenic E. coli) enterotoxigenní E. coli (enterotoxigenic E. coli) ExPEC extraintestinální patogenní E. coli (extraintestinal pathogenic Escherichia coli) HK HUS IPEC LA LEE LT MK hemoragická kolitida (hemorrhagic colitis) hemolyticko uremický syndrom (haemolytic uremic syndrome) intestinální E. coli (intestinal pathogenic Escherichia coli) lokalizovaná adherence (localized adherence) lokus pro vymizení mikroklků (locus of enterocyte effacement) tepelně labilní toxin (heat labile toxin) mastné kyseliny 11

MLEE multilokusová enzymová elektroforéza (multi locus enzyme electrophoresis) MLST mrna PAI RNA ST UPEC UTI VF multilokusová sekvenční typizace (multi locus sequence typing) mediátorová RNA (messenger RNA) ostrovy patogenity (pathogenicity islands) ribonukleová kyselina (ribonucleic acid) tepelně stabilní toxin (heat stable toxin) uropatogenní E. coli (uropathogenic E. coli) infekce močového ústrojí (urinary tract infections) faktor virulence (virulence factor) 12

1. Úvod Ačkoli je bakterie Escherichia coli přirozenou součástí naší střevní mikroflóry, v průběhu evoluce získaly některé kmeny vlastnosti, díky kterým jsou schopny napadat hostitele a způsobovat onemocnění. Tyto vlastnosti jsou podmíněny systémem tzv. virulenčních faktorů. Patogenní E. coli můžeme rozdělit do dvou velkých skupin: intestinální (průjmové) E. coli a extraintestinální E. coli. Podle charakteristických kombinací virulenčních faktorů se dělí escherichie do skupin (patotypů). Patogenní E. coli mají obdivuhodnou schopnost způsobovat různé onemocnění u zvířat i lidí. Nejsou neobvyklé ani epidemie, kdy tato bakterie infikuje tisíce jedinců a onemocnění může vést až ke smrti. Poznání mechanizmu působení virulenčních faktorů bakterie má velký význam, detailní studie nám umožní vyvinout vakcíny proti patotypům E. coli. Znalost faktorů virulence je důležitá při diagnóze, léčbě i prevenci onemocnění způsobených těmito kmeny E. coli. 13

2. Cíl práce Cílem této práce je literární rešerše o známých i potenciálních virulenčních faktorech bakterie Escherichia coli a charakterizovat mechanizmus jejich působení na hostitelský organizmus. 14

3. Charakteristika rodu Escherichia Bakterie rodu Escherichia tvoří minoritní složku střevní mikroflóry trávicího traktu lidí a jiných teplokrevných živočichů (Simon a Gorbach 1984). Vyskytuje se zde přirozeně a jako symbiont napomáhá například syntetizovat některé vitamíny (zejména vitamín K), svojí přítomností zabraňuje ostatním patogenům v adherenci na povrch slizničního epitelu a inhibuje jejich růst syntézou kolicinů a mikrocinů. Generační doba bakterie Escherichia coli žijící v intestinálním traktu zdravého jedince je 12 hodin, generační doba in vitro je asi 20 minut (Madigan a kol. 2012). 3.1. Taxonomie Rod Escherichia je klasifikován do čeledi Enterobacteriaceae, řádu Enterobacteriales, třídy Gammaproteobacteria (rrna superčeleď I. fermentující tyčky), kmene Proteobacteria a domény Bacteria (Sedláček 2007). V čeledi Enterobacteriaceae se rod Escherichia vyskytuje s mnoha dalšími rody, souhrnně se označují jako tzv. koliformní bakterie. 3.1.1. Escherichia albertii V současnosti jsou v rodu Escherichia validní taxony Escherichia coli a Escherichia albertii, která byla popsána na začátku devadesátých let minulého století M. Johnem Albertem v Bangladéži a označena jako skupina Hafnia-like bakterií (Huys a kol. 2003). Byla izolována ze stolice pacientů s průjmem, především u dětí. Bakterie však vykazuje vyšší fenotypovou i genotypovou podobnost k rodu Escherichia, a proto byla v roce 2003 do tohoto rodu zařazena (Huys a kol. 2003). 3.1.2. Escherichia coli První označení této bakterie bylo Bacterium coli commune, popsal ji tak v roce 1885 rakouský bakteriolog a pediatr Theodor Escherich. V roce 1895 byla přejmenována jako Bacillus coli či Bacterium coli. Současné označení tohoto druhu, nesoucí jméno objevitele, bylo uznáno v roce 1919 (Castellani a Chalmers 1919). 3.1.3. Reklasifikace několika druhů escherichií Rod Escherichia nebyl historicky zdaleka tak chudý na druhy jako dnes. V průběhu minulého století bylo popsáno několik escherichií, provedla se ovšem jejich zpětná 15

reklasifikace. V roce 1962 byla popsána E. adecarboxylata, která v biochemických testech měla negativní test na tvorbu lyzinu, argininu a ornitinu. V souladu s molekulárně diagnostickými metodami byla však bakterie roku 1987 přeřazena do rodu Leclercia (Tamura a kol. 1986). V roce 1973 byla izolována bakterie ze střeva švába a označena jako E. blattae. I tato bakterie byla ale zařazena chybně a v roce 2010 byla reklasifikována jako nový rod Shimwellia (Priest a Barker 2010). Pomocí několika molekulárně diagnostických metod (například DNA reasociace a distribuce guaninu a cytozinu) a fenotypových charakteristik, byly postupně popsány další tři druhy escherichií. Roku 1982 to byly druhy E. hermannii a E. vulneris a roku 1985 druh E. fergusonii. Byly izolovány především z klinického materiálu teplokrevných živočichů a ojediněle z prostředí. U popisu těchto tří druhů nebyl využit tzv. polyfázový přístup, který kombinuje všechny dostupné klasifikační metody, tj. studuje se jak genotyp, tak fenotyp a fylogeneze bakterie. Při druhovém zařazování bakterie je pak třeba využít všech dostupných technik. Pozdější studie ukázaly, že E. fergusonii je vlastně nepatogenní zástupce druhu E. coli a E. hermannii spolu s E. vulneris jsou příbuzné spíše citrobakterům, nebo mohou tvořit zcela odlišný rod (znázorněno v Obr. 1). Oficiální reklasifikace však u těchto druhů zatím neproběhla (Sedláček 2011). 16

Obr. 1: Fylogenetický strom skupiny bakterií Escherichia Popis příbuznosti bakterie Escherichia coli a Shigella s dalšími taxonomicky neplatnými druhy escherichií a s několika odlišnými rody z čeledi Enterobacteriaceae. Druh E. blattae je reklasifikován jako nový rod Shimwellia. E. vulneris a E. hermannii jsou příbuzné citrobakterům, neproběhla ale zatím oficiální reklasifikace. Bakterie označené v tmavé elipse jsou považovány v současné taxonomii za E. coli (druh E. fergusonii ani shigely však nebyly oficiálně reklasifikovány). Upraveno podle publikace Sedláček (2011). 3.1.4. Problematika rodu Escherichia a Shigella Rod Shigella byl poprvé popsán roku 1898 japonským bakteriologem K. Shigem (Shiga 1898) jako původce nemoci úplavice. Shiga také popsal typový druh Shigella dysenteriae, který se tímto stal platným taxonem. Kromě toho, že způsobuje úplavici, vykazuje Shigella i některé odlišnosti od E. coli, například Shigella zpravidla nesyntetizuje bičíky. Dále je považována za obligátního patogena, je neschopná zkvašovat laktózu a je negativní na lyzin, dekarboxylázu a indol (Edwards a Ewing 1972). Celkem se v průběhu let popsalo mnoho druhů rodu Shigella, některé z nich byly reklasifikovány (např. S. dispar, S. equirulis, S. septicemiae, S. pfaffi, 17

S. alkalescens a S. gintottensis ); (Ewing 1949). Do současnosti se zachovaly celkem čtyři druhy shigel: S. dysenteriae, S. flexneri, S. sonnei a S. boydii. Rozvoj molekulárně diagnostických technik umožnil nové metody zkoumání genomů bakterií, konkrétně nejdříve metody multilokusové enzymové elektroforézy (MLEE) a později, díky akumulaci nukleotidových sekvencí, vylepšené metody multilokusové sekvenční typizace (MLST). MLST analýza vyhodnotila E. coli a shigely jako velmi podobné a zařadila je do jednoho druhu (Pupo a kol. 2000). Jednotlivé druhy shigel tedy představují sérovary 1 patogenních kmenů E. coli. Taxony Escherichia a Shigella se však v klinické mikrobiologii nadále používaly a dodnes zůstávají jako dva oddělené taxony, pravděpodobně kvůli obavám ze zmatků, které by mohly nastat (Sedláček 2011). Nedávným sekvencováním genomů E. coli a shigel a jejich analýzou metodou CVTree 2 se rody Escherichia a Shigella rozdělily do dvou jasně definovaných monofyletických klastrů podle těchto výsledků Shigella není synonymem k E. coli, ale dalším druhem v rodu Escherichia, a byla by tedy sesterských druhem E. coli a E. albertii. Všechny tři druhy by tak byly na stejné taxonomické úrovni (Zuo a kol. 2013). 3.2. Genetická informace bakterie Escherichia coli Bakteriální chromozom E. coli, stejně jako u většiny prokaryot, má podobu jedné molekuly cirkulární dvoušroubovice (Obr. 2), která je přichycena k cytoplazmatické membráně. Velikost genomu kmene E. coli K-12 je 4 639 221 bp (Blattner a kol. 1997). 1 Vnitrodruhové rozlišení na základě antigenních vlastností bakterie. 2 Z anglického Composition Vector Tree. Je to jedna z nejnovějších technik zkoumání genomů využívající celogenomové sekvencování. Slouží ke zkoumání příbuznosti mezi mikrobiálními organizmy prostřednictvím analýzy jejich oligopeptidů v proteomu (Zuo a kol. 2013; Qi a kol. 2004). 18

Obr. 2: Chromozom E. coli K-12. Vnější okraj mapy je uvedeno umístění několika genů a operonů i se směrem, kterým probíhá transkripce. Čísla 0 100 z vnitřní strany pozice v genomu v minutách. Replikace probíhá obousměrně od OriC na 84,3. minutě. Modře je vyznačeno 5 transpozonů IS3 nalezených u určitých kmenů E. coli. Gen gal (označen růžově) - oblast, do které se začleňuje bakteriofág lambda. Gen rpsl (73. min) kóduje ribozomální protein, mutace tohoto genu vede k rezistenci na streptomycin. Upraveno podle publikace Madigan a kol. (2012). 19

4. Rozmanitost uvnitř druhu E. coli Ačkoli je druhová rozmanitost rodu Escherichia malá, druh E. coli vykazuje rozmanitost značnou. Sahá od kmenů, které jsou pro člověka neškodné, a které žijí jako komenzálové ve střevním traktu teplokrevných živočichů, přes kmeny, které způsobují lehčí formy onemocnění, jako je průjem, po kmeny, které vyvolávají závažná střevní a průjmová onemocnění, sepse a neonatální meningitidy, vedoucí sporadicky i ke smrti pacienta. Mezi prospěšný kmen E. coli se řadí například kmen Nissle 1917, který prokazatelně zabraňuje adhezi a následné invazi patogenní E. coli ze skupiny AIEC (adherentně invazivní E. coli), který bývá izolován ve spojení s chronickým zánětem střeva Crohnovou chorobou (Boudeau a kol. 2003). Lyofilizovaná biomasa z E. coli kmene Nissle 1917, sérotyp O6:K5:H1, se v klinické praxi používá jako probiotikum pod názvem Mutaflor (Lukáš 2003). Tento příklad demonstruje variabilitu druhu a poukazuje na fakt, že nepatogenní kmen E. coli může dokonce inhibovat působení jiného patogenního kmene E. coli. 20

5. Virulenční faktory Jako virulenční faktory (VF) jsou označovány všechny proteiny, molekuly nebo struktury bakterie, které se účastní na vzniku onemocnění (Madigan a kol. 2012). Jsou to produkty metabolismu a struktury buňky, které pomáhají překonat imunitní systém, kolonizovat prostředí a napadat buňky hostitele (Johnson 1991). Při ztrátě genu, nebo více genů, které kódují VF, může bakterie přijít o patogenní vlastnosti a ztratit schopnost způsobovat onemocnění. Všechny bakterie, které jsou patogenní vůči lidem a zvířatům, mají své VF. Ze známých VF patogenních bakterií lze jmenovat například toxin antraxu bakterie Bacillus anthracis, TCP pilus bakterie Vibrio cholerae (Nataro a Kaper 1998), toxin CdtB bakterie Salmonella enterica, poddruh enterica, sérovar Typhi (Spanò a kol. 2008), Ymt toxin a kapsulární F1 antigen bakterií rodu Yersinia (Zavialov a kol. 2003), nebo gen opa bakterie Neisseria gonorrhoeae (Freissler a kol. 2000). Výše jmenované VF nejsou jedinými faktory podílejících se na virulenci, typicky disponuje patogenní bakterie několika VF. U bakterie E. coli, stejně jako u většiny patogenů sliznic, spočívá infekce v kolonizaci slizničního epitelu a potlačení lokální imunitní odpovědi hostitele. Následné pomnožení bakterií může vést i k celkovému postižení organizmu hostitele. 5.1. Geny virulence Geny, které kódují VF, jsou u různých patotypů E. coli neseny na plazmidech, lyzogenních fázích a také jsou seskupovány do tzv. ostrovů patogenity (PAI) na chromozomu. Tytéž geny mohou být u různých kmenů lokalizovány pouze na PAI, pouze na plazmidech, nebo na obou místech zároveň. PAI jsou velké (10 200 kb) a nestabilní oblasti na chromozomu. Často se vyskytují u určitých kmenů bakterií v rámci druhu, zatímco u jiných chybí (Hacker a Kaper 2000). Geny pro VF tak E. coli získává horizontálním přenosem. Některé ostrovy patogenity nesou gen pro integrázu, usuzuje se tedy, že se přenášejí podobným způsobem jako konjugativní transpozony. Přenos se děje nejspíše mechanizmem transformace, transdukce nebo konjugace. To, že ostrovy patogenity jsou cizího původu, se předpokládá na základě studia repetitivních sekvencí, které obklopují tyto oblasti celá oblast byla patrně vložena transpozicí do chromozomu v průběhu evoluce (Hacker a Kaper 2000). 21

Genomy kmenů Escherichia coli nejsou identické (Obr. 3). Umístění většiny genů patogenních kmenů odpovídá nepatogennímu laboratornímu kmeni E. coli K-12. Kromě genů, které jsou přítomny plošně u všech zástupců, mají však patogenní kmeny genetický materiál navíc, a to geny, které kódují VF. Tyto geny se vyskytují na chromozomu v podobě PAI o značné velikosti, a tak se mohou velikosti genomu nepatogenního a patogenního kmene velmi lišit. Například EHEC kmen O157:H7 obsahuje asi o 20 % více DNA než E. coli K-12 (Hayashi a kol. 2001). Obr. 3: Srovnání genetických map různých kmenů E. coli. Patogenní kmen 536 (E. coli O6:K15:H31, UPEC), patogenní kmen 073 (CTFO73, UPEC) a nepatogenní E. coli kmen K-12. Vnitřní kruh srovnání genomů kmenů E. coli. Patogenní kmeny obsahují ostrovy patogenity a mají tudíž větší genom. Prostřední kruh srovnání distribuce guaninu a cytozinu. Místa v genomu, ve kterých se distribuce významně liší, jsou označena červeně. Vnější kruh celkové srovnání všech tří genomů. Zeleně jsou geny společné, červeně jen geny patogenních kmenů, modře jen geny z kmene 073. Upraveno podle publikace Madigan a kol. (2012). PAI = ostrov patogenity, CI = chromozomální ostrov 3, Prophage = DNA z temperovaného fága. 3 Geny cizího původu, které pomáhají bakteriím v adaptaci a mohou být zahrnuty v symbióze i patogenezi. Jsou vloženy do genomu bakterie transpozicí v průběhu evoluce. 22

5.2. Patogenní E. coli Patogenita je definována jako schopnost patogena poškodit a vyvolat onemocnění u svého hostitele. Kvantitativní míra patogenity je zvána virulence (Madigan a kol. 2012). Patogenní E. coli můžeme rozdělit do dvou velkých skupin. Podle typu onemocnění, které způsobují, spadají patovary do skupiny intestinálních E. coli (IPEC), které způsobují střevní infekce, nebo do extraintestinálních E. coli (ExPEC), které zapříčiňují infekce močového traktu, sepse, bakteriémie a meningitidy (Johnson 1991). Strategie patogeneze nejznámějších IPEC jsou shrnuty v Obr. 4. Zpočátku byly všechny kmeny E. coli považovány za nepatogenní. V roce 1940 byly však v několika západních zemích identifikovány kmeny E. coli ve spojení s průjmem u dětí. Tyto kmeny byly společně označeny jako patotyp enteropatogenní E. coli (EPEC); (Bray 1945). První patotypy byly tedy rozděleny podle klinických příznaků onemocnění, které způsobovaly (diarhogenní E. coli DEC; uropatogenní E. coli UPEC; E. coli způsobující septikémie SePEC a E. coli způsobující neonatální meningitidy NMEC), nebo podle svých hostitelů (avianpatogenní ptačí E. coli APEC). Později se k rozlišování patovarů začalo využívat sérotypizace pomocí povrchových antigenů zahrnujících O antigen (somatický), H antigen (flagelární) a K antigen (kapsulární); (Orskov a kol. 1977). Koncem roku 1960 byly objeveny specifické vlastnosti, které umožnily rozlišit nepatogenní kmeny od patogenních a také rozlišit patogenní kmeny mezi sebou. Podle těchto charakteristik se u diarhogenní E. coli vytvořily nejdříve tři patotypy (ETEC, EIEC, EPEC). V následujících dvou desetiletích bylo objeveno mnoho dalších patotypů, které byly rozděleny podle adherence k povrchu a vlastností exkretovaných toxinů. V dnešním rozdělení escherichií jsou některé patotypy pojmenovány zastarale podle klinických projevů nemoci, kterou způsobují, zatímco ostatní patotypy se odvozují podle jejich virulenčních faktorů (Shrnuto v publikaci Mainil 2013). V současnosti rozeznáváme přibližně 180 typů O antigenů a 60 typů H antigenů (Robins-Browne a Hartland 2002). Právě kombinace typů O a H antigenů vytváří sérotyp charakteristický pro jednotlivé kategorie E. coli. Přehled nejvýznamnějších sérotypů patřících do kategorií průjmových E. coli je zobrazen v Tab. 1. 23

Obr. 4: Strategie patogeneze u diarhogenních E. coli. Enterotoxigenní E. coli (ETEC): kolonizace tenkého střeva díky rozmanitým kolonizačním faktorům (CF) a následná produkce tepelně stabilního enterotoxinu (ST) nebo tepelně labilního enterotoxinu (LT); Enteropatogenní E. coli (EPEC): tvorba attaching-effacing lézí lokalizovaná adherence BFP fimbriemi, intimní adherence proteinem vnější membrány bakterie, změny v cytoskeletálním systému a vymizení mikroklků; Enterohemoragická E. coli (EHEC): mechanizmus patogeneze obdobný jako u EPEC, EHEC navíc vylučuje shigatoxin, který působí na enterocyty a inhibuje proteosyntézu. Shigatoxin pravděpodobně přechází i do krve; Difuzně adherentní E. coli (DAEC): difuzní adherence je doprovázena prodloužením mikroklků do prstovitých útvarů; Enteroagregativní E. coli (EAEC): agregativní adherence na sliznici tenkého i tlustého střeva (díky různým typům adhezinů) spojená se ztrátou mikroklků. Bakterie vytváří mukózní biofilm a produkují toxiny; Enteroinvazivní E. coli (EIEC): intracelulární patogen vykazující řízený pohyb po cytoplazmě. Upraveno podle publikace Nataro a Kaper (1998). 24

Tab. 1: Sérotypy charakteristické pro diarhogenní E. coli. Upraveno podle publikace Nataro a Kaper (1998). Kategorie O antigen Přidružený H antigen ETEC EPEC EHEC/STEC EAEC EIEC O6 O8 O11 O15 O20 O25 O27 O78 O128 O148 O149 O159 O173 O55 O86 O111 O119 O125ac O126 O127 O128 O142 O26 O55 O111 O113 O117 O157 O103 O145 O118 O121 O3 O15 O44 O86 O77 O104 O111 O127 O a O28ac O29 O112ac O124 O136 O143 O144 O152 O159 O164 O167 H16 H9 H27 H11 NM H42, NM H7 H11, H12 H7 H28 H10 H20 NM H6, NM H34, NM H2, H12, NM H6, NM H21 H27, NM H6, NM H2, H12 H6 H11, H32, NM H7 H8, NM H21 H14 H7 H2 H28 H16 H19 H2 H18 H18 NM H18 H4 H21 H2 H10 NM NM NM H30, NM NM NM NM NM H2, NM NM H4, H5, NM O a = antigen prozatím nepopsaný konvenčními metodami; NM ( nonmotile ) = bakterie nesyntetizuje bičík a nevlastní H antigen; ac = antigenní varianta 25

6. Enterotoxigenní E. coli Enterotoxigenní E. coli (ETEC) je intestinální patogen, který se vyskytuje zejména v rozvojových zemích. Způsobuje tzv. průjem cestovatelů a také průjem u dětí po odstavení. Stolice je při infekci ETEC řídká, obvykle bez příměsi krve a hnisu, občas se u pacientů vyskytuje horečka a zvracení. Průjem může být mírný s krátkým trváním, nebo může přerůst až do úporného vodnatého průjmu podobného infekci způsobenou bakterií V. cholerae (Levine a kol. 1977). Zdrojem nákazy je kontaminované jídlo a voda, k rozvoji infekce je nutná poměrně vysoká infekční dávka. Inkubační doba je krátká, obvykle mezi 14 50 hodinami (DuPont a kol. 1971). Přenos z člověka na člověka nebyl zatím zaznamenán. Nejvíce ohroženi tímto patogenem jsou novorozenci a jedinci s oslabenou imunitou. Nákaza skupiou ETEC může probíhat i asymptomaticky, avšak hostitelé nadále vylučují velká množství bakterií ve stolici a přenášejí tak nemoc dál. Díky tomuto faktu je ETEC v oblastech s výskytem endemických onemocnění převládajícím patogenem (Nataro a Kaper 1998). ETEC kolonizuje tenké střevo a vyznačuje se vylučováním alespoň jednoho ze dvou enterotoxinů: tepelně stabilního enterotoxinu (ST) nebo tepelně labilního enterotoxinu (LT). Kromě těchto toxinů také některé kmeny vylučují enterotoxin EAST1. Kolonizace probíhá za pomocí kolonizačních faktorů (CF), které jsou nezbytné pro adhezi k povrchu střeva. V současnosti je známo více než 25 různých kolonizačních faktorů (Walker a kol. 2007). 6.1. Virulenční faktory 6.1.1. Tepelně labilní toxin Enterotoxin LT je termolabilní oligomerní toxin blízce příbuzný toxinu V. cholerae (Sixma a kol. 1993). Dělí se do dvou velkých skupin LT-I a LT-II. Strukturu všech LT tvoří jedna podjednotka A a pět podjednotek B (Obr. 5). 26

Obr. 5: Struktura tepelně labilního enterotoxinu ETEC. Enterotoxin ze skupiny LT-I. Skládá se z podjednotky A a pěti podjednotek B. Váže se na receptor GM-1 typický pro tuto skupinu. Převzato z publikace Nataro a Kaper (1998). LT-I: tento oligomerní toxin má molekulovou hmotnost 86 kda. Podjednotka A, zodpovídající za enzymatickou aktivitu toxinu, má molekulovou hmotnost 28 kda, a podjednotky B 11,5 kda (Streatfield a kol. 1992). LT-I se dále rozlišuje na varianty LTp a LTh lišící se svými antigenními vlastnostmi (názvy podle prvotního objevu u prasat a u lidí). Geny pro LT (gen elt nebo etx) leží na plazmidech, které zároveň mohou obsahovat i geny pro shigatoxin a geny pro CF. Mechanizmus působení LT-I je následovný: LT-I se naváže na buněčnou membránu enterocytu, je endocytózou pohlcen a translokován buňkou pomocí Golgiho aparátu (Lencer a kol. 1995). Cílovým objektem LT-I je adenylát-cykláza, enzym umístěný na bazolaterální membráně epitelových buněk střeva. Podjednotka B toxinu se naváže k receptoru GM-1 (glykosfingolipid obsahující jeden zbytek kyseliny sialové), zatímco podjednotka A způsobuje permanentní aktivaci adenylát-cyklázy, což vede ke zvýšeným hladinám cyklického AMP (camp). Kaskáda reakcí nakonec vede k vylučování Cl - iontů z Lieberkühnových krypt ve střevě a k inhibici absorpce NaCl iontů. Ukázalo se, že LT také snižuje absorpci tekutin a elektrolytů z lumenu střeva (Field a kol. 1972). Osmotický tlak vlivem změn koncentrací iontů ve střevě vede nakonec k průjmu. ETEC syntetizující LT-I je patogenní jak pro lidi, tak pro zvířata (Nataro a Kaper 1998). LT-II: tento enterotoxin má stejně jako LT-I podjednotku A (asi 56% podobnost s LT- I) a pět podjednotek B, které jsou strukturou od LT-I odlišné (Fukuta a kol. 1988). Byly popsány dvě antigenní varianty LT-IIa a LT-IIb. Mechanizmus působení LT-II 27

je podobný LT-I, enterotoxin LT-II také zvyšuje podobným mechanizmem hladinu camp, v kaskádě reakcí však může být zahrnut jiný receptor (Fukuta a kol. 1988). LT- II je typický pro zvířecí ETEC, u lidských kmenů se vyskytuje jen zřídkakdy. 6.1.2. Tepelně stabilní toxin Tepelně stabilní enterotoxiny (ST) jsou malé monomery s mnoha cysteinovými zbytky pospojovaných disulfidickými můstky, které odpovídají právě za tepelnou stabilitu. ST se rozděluje do dvou tříd: STa: je to peptid tvořený z 18-19 AK (Obr. 6) s molekulovou hmotností 2 kda. Podobně jako v případě LT, jsou známy dvě varianty tohoto toxinu STp a STh. Obě varianty se mohou vyskytovat u lidských ETEC. Receptor pro STa je guanylát cykláza C na apikálním konci epiteliální buňky střeva. Při vazbě STa na receptor se zvyšuje hladina camp a dochází ke stimulaci sekreci Cl - a inhibuje se absorpce NaCl. Vše vede k vylučování tekutin do střeva a nastává průjmem (Nataro a Kaper 1998). STb: se vyskytuje hlavně u ETEC izolovaných z prasat, nicméně byla popsána i ETEC infikující člověka. Je to protein tvořený ze 48 AK, s molekulovou hmotností 5,1 kda (Arriaga a kol. 1995; Dreyfus a kol. 1992). STb poškozuje klky střeva a způsobuje jejich atrofii. Vyvolává sekreci hydrogenuhličitanů ze střeva (Nataro a Kaper 1998). 6.1.3. Kolonizační faktory Kolonizace střeva kmeny ETEC je možná díky různým typům kolonizačních faktorů (CF). CF se vyskytují u většiny kmenů ETEC a je jich produkována celá řada (Tab. 2). Můžou to být například antigeny na povrchu buňky (CS), kolonizační antigeny fimbrií (CFA); (Sommer a kol. 2010) a afimbriální struktury (Qadri a kol. 2005). Fimbriální struktury se dělí na základě morfologie do čtyř skupin: fimbrie sensu stricto (tlusté, rigidní, s centrálním otvorem, s délkou 5-7 nm), fibrily ( fibrillae, tenké, flexibilní, s délkou 2-3 nm), fimbrie typu 4 (flexibilní, středně tlusté, s délkou 4-6 nm) a curli (vysoce flexibilní, velmi tenké, spirální); (Orskov a Orskov 1990). CFA se také dělí dle morfologie, a to do tří velkých skupin, které představují rigidní tyčky, flexibilní tyčky shlukující se do tvaru svazků ( bundle-forming flexible rods ) a tenké flexibilní tyčky s drátovitou strukturou ( wiry structures ). Prototypem rigidních tyček je CFA/I (Nataro a Kaper 1998). 28

Geny pro CF jsou kódovány na plazmidech. Nejčastěji se u ETEC v rozvojových zemích objevuje afimbriální faktor CS6, který je kódován čtyřmi geny (cssa, cssb, cssc, cssd) uspořádanými v operonu. Přesný mechanizmus adheze zatím nebyl objasněn (Wajima a kol. 2011). Obr. 6: Srovnání sekvence aminokyselin u variant enterotoxinu STa. STa je tvořen z 18 AK (varianta STp) nebo z 19 AK (varianta STh ). Ec-STp a Ec-STh byly izolovány z prasečích a lidských kmenů ETEC. Čísla udávají pozici AK v sekvenci. V rámečcích jsou označeny AK s neměnnou pozicí (tuto pozici zastávají i v ostatních tepelně stabilních enterotoxinech produkovaných jinými střevními bakteriemi, např. v toxinu Vc-ST bakterie V. cholerae, nebo toxinu Y-ST bakterie Yersinia enterocolitica). Upraveno podle publikace Sato a Shimonishi (2004). Tab. 2: Různé druhy CF popsané u ETEC. Upraveno podle publikace Qadri a kol. (2005). Název CF CFA/I CS1 CS2 CS3 CS4 CS5 CS6 CS7 CS8 CS10 CS11 CS12 CS13 CS14 CS15 CS17 CS18 CS19 CS20 CS21 CS22 Typ F F F f F H nf H F nf f F f F nf F F F F F f F = fimbriální CF; f = fibrily ( fibrillae ); nf = afimbriální CF; H = helikální CF. 29

7. Enteropatogenní E. coli Enteropatogenní E. coli (EPEC) se vyskytuje především v rozvojových zemích u dětí mladších dvou let, ale při vysokých infekčních dávkách může postihovat i dospělé jedince (Nataro a Kaper 1998). Přenos se děje fekálně-orální cestou. Rezervoárem EPEC jsou nemocné děti a dospělí jedinci s asymptomatickým průběhem nemoci. EPEC způsobuje vodnaté průjmy, často se zvracením, zvýšenou teplotou a nevolností (Levine 1987), možná je i asymptomatická infekce EPEC. Některé kmeny mohou produkovat enterotoxin EAST1. Charakteristickým znakem EPEC je tvorba tzv. attaching-effacing lézí. 7.1. Virulenční faktory 7.1.1. Attaching-effacing léze Nápadné změny, které EPEC způsobuje, sestávají z intimní adherence bakterie k buňkám epitelu a vymizení mikroklků v této oblasti tvoří se tzv. attachingeffacing léze (A/E léze). Po adherenci bakterie narušují kartáčový lem střeva a dochází k hlubokým změnám v cytoskeletálním systému, zahrnující akumulaci polymerizovaného F-aktinu, α-aktininu, talinu, ezrinu a myozinu (Finlay a kol. 1992). Někdy vykazují adherované EPEC pohyb po povrchu epitelu střeva, právě díky polymerizovanému aktinu. Buněčná membrána epitelových buněk se často zvedá do charakteristického útvaru podobnému podstavci ( pedestal-like structure ) pod bakterií (Obr. 7), který může měřit až 10 µm (Moon a kol. 1983). Obr. 7: Sliznice střeva infikovaná EPEC. Pod adherovanými bakteriemi se epitel zvedá a tvoří podstavec. Snímek z elektronového mikroskopu, zvětšení 45 000x. Upraveno podle publikace Deborah Chen a Frankel (2005). E = bakterie EPEC; MV = mikrovili (mikroklky) 30

A/E léze se tvoří podle třístupňového modelu (Obr. 8) v těchto krocích: V prvním kroku vykazují EPEC lokalizovanou adherenci (LA) k epitelu střeva. Lokalizovaná adherence je kódována na plazmidu zvaném EAF (adherentní faktor EPEC) s molekulovou hmotností 60 MDa. Adherenci následně zprostředkovávají BFP fimbrie ( bundleforming pilus ), které se shlukují a vytvářejí mezi sebou svazky (Nataro a Kaper 1998). BFP mají na svědomí adherenci jednotlivých bakterií mezi sebou, díky tomu mohou EPEC vytvářet charakteristické mikrokolonie na povrchu buněk. BFP také pravděpodobně zprostředkovávají adherenci bakterií k epitelu střeva (Cleary a kol. 2004). Jako receptor pro BFP nejspíše slouží oligosacharidy nebo fosfolipid fosfatidylethanolamin (cefalin); (Nougayrede a kol. 2003). Adherence následně indukuje kaskádu signálních transdukcí: - Zvyšuje se intracelulární koncentrace Ca 2+, inhibuje se absorpce NaCl a vylučuje se Cl - z enterocytů (Nataro a Kaper 1998). - Probíhá fosforylace proteinů v epiteliálních buňkách na zbytcích serinu, treoninu a tyrozinu (Manjarrez-Hernandez a kol. 1992). - Aktivuje se proteinkináza C (PKC) a zvyšuje se hladina inozitoltrifosfátu (IP3); (Lu a Walker 2001). Jedním z hlavních proteinů s fosforylovaným zbytkem tyrozinu je Hp90 (Rosenshine a kol. 1992). Hp90 je součástí A/E lézí, nachází se v enterocytech v místě adheze bakterií. Zjistilo se, že Hp90 je bakteriální protein, který slouží jako receptor pro intimin, byl tedy nazván jako protein Tir ( translocated intimin receptor ); (Kenny a kol. 1997). Původně byl Tir považován pouze za protein hostitelských buněk, ale ukázalo se, že je tento protein původu bakteriálního. Tir je z bakterie translokován do membrány enterocytu, kde jsou jeho tyrozinové zbytky fosforylovány. Poté je schopen fungovat jako receptor a váže intimin bakterie (Philpott a kol. 1998). Intimní (těsná) adherence je zprostředkována intiminem, proteinem vnější membrány bakterie s molekulovou hmotností 94 97 kda. Je kódován genem eae (Jerse a kol. 1990). Všechny druhy intiminů se vyznačují vysokou konzervovaností N-konce proteinu a variabilitou C-konce (Nataro a Kaper 1998). Sekreční systém typu III je kódován geny sep (Jarvis a kol. 1995), je to systém užívaný mnoha střevními bakteriemi a zodpovídá za sekreci a translokaci proteinů Esp. K tvorbě 31

A/E lézí jsou zapotřebí alespoň tři sekretované proteiny: EspA (Kenny a kol. 1996), EspB (Kenny a Finlay 1995) a EspD (Lai a kol. 1997) Geny pro signální transdukci, sekreční systém typu III, sekreci proteinů Esp a intimin jsou uložené na LEE ( locus of enterocyte effacement ) - PAI s molekulovou hmotností 35 kb. LEE je pro tvorbu A/E lézí nezbytný, není to však jediný faktor, který za jejich tvorbu zodpovídá. LEE se nenachází u nepatogenních E. coli, ani u ETEC. U kmenů EHEC se mohou nacházet jeho sekvenční homology (Nataro a Kaper 1998). Obr. 8: Třístupňový model tvorby A/E lézí. A: lokalizovaná adherence BFP fimbriemi; B: narušení mikroklků, vylučování virulenčních faktorů sekrečním systémem typu III a translokace Tir receptoru z bakterie do hostitelské buňky. EPEC následně vykazuje intimní adherenci díky proteinu intiminu, který se váže na receptor Tir; C: kaskáda reakcí (aktivace proteinkinázy C, inozitoltrifosfátu a zvýšení intracelulární hladiny Ca 2+ ) vedoucí k vylučování Cl - z enterocytů a průjmu. Polymerizovaný aktin tvoří podstavec pod adherovanou bakterií. Upraveno podle publikace Donnenberg a kol. (1997). BFP = pilusy tvořící svazky ( bundle forming pilus ); Tir = receptor intiminu ( translocated intimin receptor ); IP3 = inozitoltrifosfát; PKC = proteinkináza C. 32

8. Enterohemoragická/Shigatoxigenní E. coli Pro tuto skupinu kmenů existují synonymní označení: Enterohemoragická E. coli (EHEC), Shigatoxigenní E. coli (STEC) nebo Verotoxigenní E. coli (VTEC). Označení EHEC se používá spíše v americké literatuře a v publikacích WHO, zkratka STEC je více užívána v evropské literatuře (Špelina a Ostrý 2004). E. coli produkující dva typy cytotoxinu byla poprvé popsána roku 1977 (Konowalchuk a kol. 1977). Cytotoxin byl nazván verotoxin (tj. toxické pro buňky Vero z ledvin afrických opic), pro nějž se nyní používá název shigatoxin (O Brien a kol. 1983). Podle autorů Nataro a Kaper (1998) zahrnuje STEC označení mimo jiné i atypické kmeny E. coli, které nevykazují typický fenotyp v průběhu nemoci (nevytváří se A/E léze). Dále v textu bude používána zkratka EHEC, která zahrnuje všechny patogenní kmeny E. coli způsobující hemoragickou kolitidu, hemolyticko-uremický syndrom, A/E léze a nesoucí plazmid s molekulovou hmotností 60 MDa a exprimující gen pro shigatoxin (Nataro a Kaper 1998). EHEC způsobuje tři typy onemocnění. Hemoragická kolitida (HK) se vyznačuje krví ve stolici, silnou bolestí břicha, zvracením, obvykle bez horečky. Hemolyticko-uremický syndrom (HUS) je onemocnění, jemuž předchází krvavý průjem, následuje akutní neuropatie, selhání ledvin, trombocytopenie a mikroangiopatická hemolytická anémie (Nataro a Kaper 1998). Trombotická trombocytopenická purpura se projevuje podobnými symptomy jako HUS, s horečkou a poruchami centrálního nervového systému (Zheng a Sadler 2008). Nejznámější a nejvýznamnější sérotyp je O157:H7, jeho rezervoárem je střevní trakt hospodářských zvířat. Nákaza pochází ze syrového masa (hamburgery), nepasterizovaného mléka nebo ze syrové zeleniny kontaminované výkaly. Alimentární onemocnění způsobená EHEC jsou ve vyspělých zemích častější než onemocnění připisovaná ETEC, EPEC, EIEC nebo EAEC. E. coli O157:H7 je závažným problémem, minimální infekční dávka je podle posledních poznatků velmi nízká, pravděpodobně méně než 100 buněk (Tilden a kol. 1996). Studium E. coli O157:H7 je řazeno mezi priority bezpečnosti potravin v ČR (Špelina a Ostrý 2004). Ve světové literatuře se v současné době uvádí pět séroskupin EHEC, nejčastěji izolovaných od pacientů s HUS: O157, O26, O111, O103 a O145 (Tzschoppe a kol. 2012). 33

8.1. Virulenční faktory Mechanizmus patogeneze EHEC nebyl dosud zcela vysvětlen, ale byla identifikována řada důležitých faktorů virulence (Špelina a Ostrý 2004). Geny VF jsou uloženy na chromozomu nebo na 60MDa plazmidu. Stejně jako EPEC, i EHEC vlastní ostrov patogenity LEE, který kóduje intimin, sekretované proteiny Esp a sekreční systém typu III (Nataro a Kaper 1998). Díky LEE jsou schopny EHEC vytvářet A/E léze. Určité kmeny EHEC (zejména kmen O157:H7) produkují enterotoxin EAST1 (Savarino a kol. 1996). 8.1.1. Shigatoxin Hlavním VF skupiny EHEC je produkce jednoho ze dvou, nebo obou druhů cytotoxinů označovaných jako shigatoxin 1 (Stx 1) a shigatoxin 2 (Stx 2). Geny stx jsou přenášeny temperovaným fágem lambda. Shigatoxiny sestávají obecně z podjednotky A (32 kda) s oddíly A 1 a A 2. Podjednotka A je nekovalentně spojená s pentametrem podjednotky B (Obr. 9). Podjednotka B zprostředkovává vazbu k receptorovým molekulám Gb 3 (globotriaosylceramid) na povrchu eukaryotických buněk (Nataro a Kaper 1998). Obr. 9: Obecná struktura shigatoxinu. Peptid A 1 vykazuje enzymatickou aktivitu, peptid A 2 připojuje podjednotku A k pentametru podjednotek B. A 1 a A 2 jsou spojeny disulfidickým můstkem. Převzato z URL 1. Po navázání k receptoru na eukaryotické buňce je celý toxin endocytován a transportován do endoplazmatického retikula (Sandvig a Van Deurs 1994). Podjednotka A je následně translokována do cytoplazmy, kde zabraňuje ribozomům v proteosyntéze. Afinita Stx k endoteliálním buňkám ve střevě může způsobit jejich narušení projevující se právě krví ve stolici. Varianty Stx 1 a Stx 2 se liší uspořádáním AK a také řadou biologických vlastností. 34

Stx 1 je vysoce konzervovaný cytotoxin (Nataro a Kaper 1998). Stx 1 je strukturálně a imunologicky obtížně odlišitelný od shigelového toxinu (99% shoda na úrovni sekvence AK). Dvě varianty tohoto toxinu, Stx 1c a Stx 1d, se vyskytují především u jelenů, ovcí a koz (Martin a Beutin 2011). U lidí vyvolává E. coli kódující tento toxin nemoci s mírným, nebo asymptomatický průběhem. Regulace genu pro Stx 1 probíhá pomocí iontů železa, při jejich nízké koncentraci se produkce toxinu zvyšuje. Stx 2 má přibližně 50% homologii k Stx 1. Byly u něj postupně izolovány různé varianty (např. Stx 2c, Stx 2d, Stx 2e, Stx 2f, Stx 2v, Stx 2vha). Nakao a kol. (2002) je následně rozdělili podle sekvencí nukleotidů do 4 skupin (Stx 2G1 Stx 2G4). Všechny cytotoxiny ze skupiny Stx 2G1 patřily mezi toxiny produkované séroskupinou O157. Skupina Stx 2G1 je považována u lidí za nejvíce patogenní. Zatímco pro většinu druhů Stx 1 i Stx 2 je hlavním receptorem Gb 3, pro Stx 2e slouží jako receptor Gb 4. Stx 2e způsobuje nemoci hlavně u prasat, u lidí je ojediněle izolován ve spojitosti s HUS nebo průjmem (Nataro a Kaper 1998). 8.1.2. Enterohemolyzin Enterohemolyzin produkuje naprostá většina kmenů E. coli O157:H7 a i u dalších sérotypů je velmi rozšířen. Geny pro enterohemolyzin jsou kódovány na 60MDa plazmidu (Nataro a Kaper 1998). Tento toxin patří k tzv. RTX toxinům ( Repeats in ToXins ). Prochází do vnějšího prostředí skrz cytoplazmatickou membránu a buněčnou stěnu bakterie a napadá hostitelské buňky. V jejich buněčné stěně pak utváří póry a tím buňky zabíjí. U lidí to jsou pouze erytrocyty, u dobytku erytrocyty i leukocyty (Bauer a Welch 1996). 8.1.3. Intimin Intimin je protein vnější membrány s molekulovou hmotností 94 kda až 97 kda, který funguje jako adhezin a je kódován genem eae. Podle zastoupení AK na C-konci proteinu lze rozlišit minimálně 21 druhů intiminů. 8.1.4. po157 plazmid Vysoce konzervovaný plazmid po157, jehož velikost se pohybuje kolem 100 kb, nesou všechny sérotypy O157:H7 (Schmidt a kol. 1996). Vyskytuje se také u sérotypů O26:H11 a u většiny Stx-produkujících E. coli. 3,4kb velký fragment tohoto plazmidu kóduje enterohemolyzin (Schmidt a kol. 1995). 35

9. Enteroagregativní E. coli Enteroagregativní E. coli (EAggEC, jednodušeji EAEC) se charakteristicky vyznačují adherencí k povrchu enterocytů v podobě tzv. agregativní adherence (AA). Kmeny EAEC nesou plazmid paa s molekulovou hmotností 60 MDa až 65 MDa, který kóduje fimbrie agregativní adherence (AAF/I a AAF/II). Produkují enterotoxin EAST1 a vlastní sérinovou proteázu Pet, která má enterotoxigenní a cytotoxické účinky (Moon a kol. 2005). AA se vyznačuje autoaglutinací bakteriálních buněk na povrchu buněk hostitele. Bakterie adherují jak vzájemně k sobě, tak i k epitelu střeva v charakteristických útvarech připomínajících cihly naskládané na sobě ( stacked-brick configuration ). EAEC jsou schopné adherence k enterocytům tenkého i tlustého střeva (Hicks a kol. 1996). Interakce střevního epitelu s kmeny EAEC charakteristicky stimuluje sekreci sliznice za vzniku biofilmu (Obr. 10). Biofilm je tvořen hlenem a bakteriemi v něm zachycených (Nataro a Kaper 1998). Obr. 10: Tvorba biofilmu EAEC kmenem O44:H18 (EAEC 042) na podložním sklíčku. EAEC k sobě adherují a tvoří vysoké sloupce, které mají vzhled cihel naskládaných na sobě. Agregované bakterie jsou obklopeny vodními kanálky, kterými k nim proudí živiny (šipka). Snímek ze skenovacího elektronového mikroskopu. Převzato z publikace Avelino a kol. (2010). EAEC se vyskytuje zejména v rozvojových zemích, je schopna způsobit onemocnění u dětí i u dospělých jedinců (Mathewson a kol. 1986). Infekce EAEC se projevuje perzistujícím mukózním vodnatým průjmem, který přetrvává 14 dní i déle a zvýšenou teplotou, přičemž zvracení není příliš časté (Nataro a Kaper 1998). Infekce EAEC může být doprovázena mírným zánětem střevní sliznice (Steiner a kol. 1998). 36

9.1. Virulenční faktory Mechanizmus patogeneze není přesně popsán, zejména kvůli velké heterogenitě kmenů EAEC (Czeczulin a kol. 1999). U těchto bakterií byla popsána řada VF, a to fimbriální a afimbriální adheziny, enterotoxin EAST1 (Savarino a kol. 1996), toxin Pet (Navarro- Garcia a kol. 1998), Shigella enterotoxin 1 (ShET1); (Noriega a kol. 1995), mucináza Pic, která se podílí na kolonizaci střeva (Henderson a kol. 1999), a protein disperzin (Sheikh a kol. 2002). 9.1.1. Adheziny Bylo popsáno několik fimbrií agregativní adherence (AAF). Tyto fimbrie hrají důležitou roli při agregativní adherenci (Obr. 11) u AAF-pozitivních kmenů EAEC (Nataro a Kaper 1998). AAF/I (kódovány operonem agg) a AAF/II (kódovány operonem aaf) jsou fimbrie patřící do skupiny afimbriálních adhezinů Dr (zprostředkovávají adherenci ke krevnímu antigenu Dr), které se vyskytují především u extraintestinálních E. coli (Nataro a kol. 1992; Czeczulin a kol. 1997). Typ AAF/III byl popsán u EAEC kmene O104:H4 (EAEC 55989); (Bernier a kol. 2002). Podle nedávných studií však pouze menší část (asi 15 %) kmenů EAEC syntetizuje AAF (Bernier a kol. 2002). U AAFnegativních kmenů hraje roli v adherenci adhezin Hda (Boisen a kol. 2008) a E. coli common pilus (ECP), který se vyskytuje u intestinální i extraintestinální E. coli (Rendon a kol. 2007). Obr. 11: Fimbrie EAEC kmene O44:H18 (EAEC 042). Fimbrie (šipka) připojují bakterie k sobě a umožňují adherenci. Snímek ze skenovacího elektronového mikroskopu. Převzato z publikace Avelino a kol. (2010). 9.1.2. Enterotoxin EAST1 EAST1 je tepelně stabilní enterotoxin EAEC kmenů. Tento homolog tepelně stabilního enterotoxinu kmene ETEC má molekulovou hmotnost asi 4 kda (Savarino a kol. 1993). Je tvořen 38 AK a obsahuje 4 cysteinové zbytky. Ačkoli je tento enterotoxin charakteristicky produkován kmeny EAEC, vyskytuje se také u EPEC, EHEC a ETEC 37

(Savarino a kol. 1996; Paiva de Sousa a Dubreuil 2001; Choi a kol. 2001). EAST1 je nacházen u mnoha kmenů EHEC. V jedné ze studií se gen asta kódující EAST1 nacházel u všech O157:H7 kmenů EHEC, ve většině případů ve dvou kopiích na chromozomu. Prevalence genu asta mezi ostatními sérotypy skupiny EHEC se pohybovala mezi 52-89 % (Savarino a kol. 1996). Zda působí EAST1 synergicky s LT a ST toxiny ETEC není známo. Role EAST1 in vivo je stále nejasná (Konno a kol. 2012). 38

10. Další skupiny intestinálních E. coli Enteroinvazivní E. coli: Enteroinvazivní kmeny E. coli (EIEC) jsou biochemicky a geneticky blízce příbuzné bakterii Shigella. Obě jsou negativní na lyzin a dekarboxylázu, nezkvašují laktózu a nesyntetizují bičíky (Brenner a kol. 1973). Mechanizmus patogeneze mají EIEC a Shigella identický, spočívá v invazi bakterií do buněk epitelu střevní sliznice, lyzi endocytických vakuol a následné multiplikaci bakterií uvnitř hostitelských buněk. Bakterie pak vykazují řízený pohyb po cytoplazmě buněk a napadají buňky sousední (Goldberg a Sansonetti 1993). Zatímco je tedy většina patogenních E. coli extracelulárních, EIEC je patogenem intracelulárním. Geny pro patogenitu mají EIEC a některé shigely na plazmidu zvaném plnv (molekulová hmotnost 140MDa); (Sasakawa a kol. 1992). EIEC se přenáší kontaminovaným jídlem nebo vodou, je možný také přenos z osoby na osobu (Harris a kol. 1985). Infekce se projevuje vodnatým průjmem neodlišitelným od průjmu způsobeného shigelou (Nataro a Kaper 1998). V patogenezi jsou zahrnuty cytotoxiny a enterotoxiny, které EIEC vylučují. Tyto toxiny napomáhají nejspíše právě charakteristickému vodnatému průjmu (Fasano a kol. 1990). Infekční dávka EIEC je vyšší než u bakterií Shigella (Durno a kol. 1989). Difuzně adherentní E. coli: Difuzně adherentní E. coli (DAEC) způsobuje průjmy častěji u odrostlých dětí než u kojenců (Gunzburg a kol. 1993). Průjem bývá vodnatý, bez výskytu krve (Poitrineau a kol. 1995). Bakterie se shlukují na povrchu sliznice střeva v podobě tzv. difuzní adherence (DA), po adherenci k enterocytům se buňky střeva prodlužují do prstovitých útvarů, které obepínají buňku (Cookson a Nataro 1996). K DA fenotypu jim napomáhají nejspíše afimbriální adheziny ze skupiny Dr (Bilge a kol. 1993). Kromě charakteristické adherence k enterocytům díky fimbriím nejsou u DAEC známy žádné další virulenční faktory. Není také zcela jasné, zda všechny kmeny DAEC jsou enteropatogenní, a je třeba najít metodu, která by odlišovala průjmové DAEC od nepatogenních kmenů (Tanimoto a kol. 2013). Enteroagregativní-hemoragická E. coli: Tento hypervirulentní patotyp označovaný zkratkou EAHEC se objevuje v posledních letech. Byl izolován od pacientů jako sérotyp O104:H4 a vznikl kombinací kmenů EHEC a EAEC (Biju a kol. 2012). EAHEC vlastní plazmid podobný plazmidu paa kmene EAEC, který kóduje fimbrie agregativní adherence AAF/I (Rasko a kol. 2011). Zvýšená virulence EAHEC je dána přítomností 39

profága, který kóduje toxin Stx 2 charakteristický pro EHEC. Infekce EAHEC se vyznačuje gastroenteritidami a HUS (Biju a kol. 2012). Cell-detaching E. coli: Cell-detaching E. coli (CDEC) byla izolována poprvé roku 1993 od dětí s průjmem (Gunzburg a kol. 1993). CDEC in vitro dokážou oddělit střevní buňky od epitelu (Obr. 12). Tento fenotyp způsobují díky α-hemolysinu HlyA, P- fimbriím asociovanými s pyelonefritidou a cytotoxickému faktoru 1 (Elliott a kol. 1998). Toxin HlyA vzniká acylací dvou lyzinových zbytků netoxického prekurzoru prohlya. Proces řídí protein HlyC, který se váže ke specifické sekvenci prekurzoru. Sekrece HlyA je řízena proteiny HlyB a HlyD (Hughes a kol. 1992). Obr. 12: Destrukce klků ve střevě patotypem CDEC. A: střevní epitel, kontrola bez inokulace bakterií. B: destrukce klků po inokulaci CDEC. Převzato z publikace Abduch Fábrega a kol. (2002). 40

11. Extraintestinální E. coli Kromě střevních E. coli existují i extraintestinální E. coli (ExPEC), které mají schopnost způsobovat onemocnění vně intestinálního traktu. Nejčastěji způsobují infekce močového ústrojí (UTI), dále také bakteriémie (přítomnost bakterií v krvi), asymptomatické bakteriurie (přítomnost bakterií v moči) a sepse. Jsou jedna z nejčastějších příčin neonatálních meningitid a hrají významnou roli u intraabdominálních a nozokomiálních infekcí. ExPEC vlastní mnoho charakteristických VF (Obr. 13), patří sem různé adheziny (fimbrie, afimbriální struktury), bičíky, kapsulární polysacharidy (K antigen), toxiny (hemolyzin), invaziny, siderofor aerobaktin a proteázy (Johnson 1991; Johnson a Russo 2002). Kompletní výčet známých faktorů virulence ExPEC je zobrazen v Tab. 3. Mnoho z těchto VF je kódováno na PAI. ExPEC osídluje také střevo člověka, kde žije jako komenzál. Onemocnění způsobuje, pouze pokud se dostane z trávicího traktu do jiných, za normálních okolností sterilních, částí lidského těla (Johnson a Russo 2002). Obr. 13: Nejvýznamnější virulenční faktory u extraintestinální E. coli. Schématický obrázek znázorňující struktury a produkty bakteriální buňky ExPEC odpovídající za patogenitu. Siderofor aerobaktin váže Fe z hostitelských buněk Fe stimuluje růst bakterie. Černé geometrické obrazce na membráně představují membránové proteiny zahrnuté v transportu, rezistenci k séru atd. Upraveno podle publikace Eisenstein a Jones (1988). CM = cytoplazmatická membrána; VM = vnější membrána. 41