UNIVERSITA KARLOVA v PRAZE. FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI Katedra biologických a lékařských věd

UNIVERSITA KARLOVA v PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI Katedra biologických a lékařských věd Sledování antiagregační léčby u kardiologických pacientů Bakalářská práce Vedoucí práce: MUDr. Jiří Charvát, CSc. Ústí nad Labem 2011 Martina Colová

Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma Sledování antiagregační léčby u kardiologických pacientů vypracovala samostatně a veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem čerpala při zpracování této práce, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla pouţita k získání jiného nebo stejného titulu. V Ústí nad Labem.. Podpis studenta 2

Poděkování Chtěla bych poděkovat Mgr. Marcele Mikešové za poskytnuté informace a za pomoc při sestavování této bakalářské práce. Dále také chci poděkovat MUDr. Jiřímu Charvátovi, za cenné rady a čas, který mi věnoval při tvorbě práce. I své rodině za podporu a čas, který mi poskytly ke studiu. 3

OBSAH: 1 Úvod a zadání práce 6 2 Teoretická část.. 7 2.1 Primární hemostáza... 7 2.2 Antiagregační terapie.. 8 2.3 Rezistence na antiagregační terapii... 13 2.4 Metody sledování účinnosti antiagregační léčby... 16 3 Praktická část... 23 3.1 Odběr krve..... 23 3.2 Příprava vzorku a analýza.. 23 3.3 Výsledky měření 24 3.4 Diskuze výsledků... 34 4 Závěr 37 5 Seznam literatury. 38 4

ABSTRAKT Tato bakalářská práce se zabývá sledováním antiagregační léčby u kardiologických pacientů. Teoretická část této práce popisuje vznik primární hemostatické zátky, typy antiagregační léčby, příčiny rezistence antiagregační léčby. Vyhodnocuje výsledky optického a impedančního měření agregace trombocytů a účinnosti antiagregační léčby. Sledovaný soubor zahrnuje měření 94 pacientů. Klíčová slova: hemostáza agregace trombocytů antiagregační léčba kyselina acetylsalicylová - clopidogrel ABSTRACT This thesis deals with the monitoring of antiplatelet therapy for cardiac patients. The theoretical part of this work describes the primary haemostatic plug formation, types of antiplatelet therapy, antiplatelet therapy causes resistance. Evaluates the results of optical and impedance measurements of platelet aggregation and the effectiveness of antiplatelet therapy. The observed set of measurements includes 94 patients. Keywords: hemostasis platelet aggregation antiplatelet therapy acetylsalicylic acid - clopidogrel 5

1 Úvod a zadání práce Hemostatické mechanismy jsou fyziologickým procesem. Za určitých podmínek je aktivace hemostatických mechanismů neţádoucí a ţivot ohroţující a je zapotřebí tuto aktivitu tlumit. Obecně je cílem antiagregačních a antikoagulačních opatření normalizovat zvýšenou tendenci ke tvorbě trombu, zabránit zvětšování trombu (zamezit shlukování trombocytů a sníţit zvýšenou sráţlivost krve). K zajištění těchto opatření existuje řada moţností, které lze rozdělit: antikoagulační, trombolytická a antiagregační. Antikoagulační léčba je namířená proti účinku trombinu a brání přeměně fibrinogenu na fibrin. Trombolytická léčba aktivuje fibrinolytické vlastnosti krve v oblasti trombu. Antiagregační léčba je zaměřena proti shlukování trombocytů a její nejvýznamnější uplatnění je tedy v zábraně vzniku či progresi neţádoucích tepenných trombů. V této práci se budu zabývat sledováním antiagregační léčby u kardiologických pacientů. 6

2 Teoretická část 2.1 Primární hemostáza Primární hemostáza je proces tvorby primární hemostatické zátky, která uzavírá místo narušení celistvosti cévní stěny a následně dochází k zástavě krvácení. Krevní destičky v primární hemostáze se aktivují ve čtyřech krocích: a) adherují na poškozený endotel (umělé povrchy) b) uvolňují ze zásobních granulí aktivační působky, především ADP c) agregují spolu a vytvářejí hemostatickou zátku d) vytvářejí prokoagulační povrch pro aktivní koagulační proteiny Trombocyty jsou stimulovány poraněním endotelu a adherují k subendoteliární matrix (zejména kolagen) a absorbují plasmatické proteiny včetně von Willebrandova faktoru a fibrinogenu. Trombocyty se váţí na von Willebrandův faktor pomocí receptoru destičkových GPIb/IX/V a na fibrinogen pomocí GPIIb/IIIa. Adherující trombocyty mění po kontaktu s kolagenem svůj tvar. Vytvářejí se pseudopódia a rozprostírají se po exponovaném povrchu. Současně s tím dochází ke změnám povrchových vlastností membrány trombocytů a k uvolňovací reakci. Destičková adheze stimuluje intracelulární signál, který vede k uvolnění destičkové faktoru 4 (PF4) a β tromboglobulinu (β TG) růstového faktoru, dále FV a také trombospondinu z α granulí, zároveň se uvolňují fosfolipidy, které dovolují zahájení koagulační reakce na povrch trombocytů, coţ vede k tvorbě fibrinu. ADP se uvolňuje z denzních granulí, aktivuje GPIIb/IIIa receptor a podmiňuje agregaci trombocytů. Spolu s ním se uvolňuje z denzních granulí ATP, serotonin a Ca²+ionty. Hlavními fyziologickými induktory agregace jsou ADP a tromboxan A₂ (TXA₂), který vzniká metabolickým pochodem zahájeným aktivací destičkové fosfolipázy. Na agregaci se také podílí trombin, který vzniká v malém mnoţství na povrchu destiček. Agregace trombocytů je závislá na přítomnosti dalších GPIIb a GPIIIa v membráně destiček, fibrinogenu a Ca²+. Fibrinogen spojuje destičky a podmiňuje tvorbu agregátů, zatímco TXA₂ podporuje uvolňování ADP. Druhý prostaglandin PGI₂, který vzniká v cévních endoteliích uvolňováním ADP, brzdí a inhibuje agregaci destiček a zabraňuje tvorbě destičkových trombů mimo místo poranění. (Malý, 2005) 7

Posledním krokem primární hemostázy je retrakce (smrštění) vytvořené zátky. Jedná se trombocytární funkci, která odpovídá kontrakci svalů. Pseudopódia trombocytů přilnou k fibrinovým vláknům a retrakce kontraktilních bílkovin trombocytů vyvolá retrakci sraţeniny. K retrakci koagula a také konstrikci cévní stěny přispívá i vazba fibrinogenu trombocytů na trombocytový aktin prostřednictvím GP IIb/IIIa. (Matýšková, 1999) 2.2 Antiagregační terapie Pod pojmem antiagregační terapie se rozumí farmakologické zasahování do procesů primární hemostázy s cílem zabránit vzniku destičkových trombů. V současné době dostupné protidestičkové léky zasahují různými kroky do aktivačních procesů adheze, uvolňovací reakce, agregace a tím sniţují riziko arteriální trombózy. Mohou však zvýšit riziko krvácení u citlivých jedinců. Indikace protidestičkové léčby vyplývá z přítomnosti rizikových faktorů tepenné okluze. Trombocyty lze inhibovat ve fázi adheze, aktivace, agregace, popřípadě můţeme potencovat jejich stabilitu. (Pecka, 2010) Inhibice: 1. blokáda adheze trombocytů 2. blokáda aktivačních cest a cyklů 3. stabilizace trombocytů 4. blokáda agregace trombocytů 2.2.1 Blokáda adheze trombocytů na subendotelové struktury Antagonisté von Willebrandova faktoru nebo inhibitory glykoproteinových adhezních receptorů (GPIb/IIa,GP VI) vazba trombocytů na kolagenní vlákna (vnitřní vrstvy stěny větších cév) probíhá ve 2 fázích jako iniciační adheze, kterou zprostředkovává vwf a komplex GP Ib/V/IX, a pevná adheze, která je zajištěna vazbou GP Ia/IIb na kolagen * k zablokování iniciační adheze se pouţívají nefunkční fragmenty vwf, které obsahují vazebné místo pro vwf na membráně trombocytů, tím se zablokuje vazebné místo na GPIb, sníţí se adhezivní schopnosti destičky zprostředkované touto cestou a dochází k zablokování následné aktivace 8

* blokátory GPIb/IIa pouţívá se heterogenní směs polykarboxylových polymerů nebo kyselina aurinkarboxylová, které znemoţní vazbu receptorů trombocytů na obnaţená kolagenní vlákna a tím zabrání jejich adhezi, aktivaci i agregaci. (Pecka, Malý, 2009) 2.2.2 Blokáda aktivačních cest a cyklů Můţeme ji rozdělit na dvě cesty: blokáda enzymů metabolismu kys.arachidonové - blokáda cyklooxygenázy I, blokáda tromboxansyntázy a receptorů pro tromboxan A₂ (TXA₂). *blokáda cyklooxygenázy COX -1 nejběţnější inhibitor je kyselina acetylsalicylová (ASPIRIN, ANOPYRIN ASA), její mechanismus účinku je ireverzibilní acetylace enzymu cyklooxygenázy, který je zodpovědný za produkci tromboxanu A₂, dalších prostaglandinů a prostacyklinů. Prvním krokem v syntéze prostaglandinů je vznik kyseliny arachidonové z membránových fosfolipidů, ta je pak metabolizována pomocí COX aktivity prostaglandin (PG) syntázy za vzniku PGG₂ a PGH₂. PGH₂ je pak za účasti specifických syntáz přeměněn na prostacykliny a TXA₂. (obr. 1) Produkce TXA₂ trombocyty jako odpověď na nejrůznější stimuly vede k amplifikaci agregace destiček a k vazokonstrikci. Naopak PGI₂, prostacyklin produkovaný endoteliálními buňkami, má efekt antiagregační a vazodilatační. (Awtry, Loscalzo, 2000) 9

obrázek 1 Acetylace serinového rezidua COX 1, (Pecka, 2004) IBUSTRIN (Indobufen) je lék s obdobným účinkem jako ASA, ale s reverzibilní inhibicí cyklooxygenázy. Podává se v případě intolerance ASA nebo při ukončení léčby k určitému termínu. Inhibicí tromboxansyntetázy se sniţuje agregace trombocytů včetně spontánní agregace. (Zvarová, 2003) *blokáda tromboxansyntázy a receptorů pro TXA₂ - dochází k současné inhibici, vyuţívá se imidazolových přípravků vapiprost, ridogrel. Jsou to kombinované blokátory TXA₂ a tromboxansyntásy. (Pecka, Malý, 2009) blokáda receptorů trombocytů v této cestě inhibice se pouţívají selektivní inhibitory, které blokují vţdy jen jeden receptor (blokáda receptorů ADP, blokáda trombinových receptorů) a komplexní inhibitory, které inhibují více receptorů najednou: *selektivní inhibitory jsou to látky, které mají podobnou afinitu k receptorovým místům na membráně trombocytu a obsazují tak místo, kde se váţe induktor. Blokují vţdy jen jeden receptor. (Pecka, 2010) 10

* receptory ADP ADP se vylučuje z denzních granul trombocytů a z aktivovaného cévního subendotelu. Ticlopidin a clopidogrel (PLAVIX) jsou thienopyridinové preparáty, které selektivně a ireverzibilně blokují vazbu ADP na destičkové receptory. (Špác, Hlinomaz, 2006) Princip účinku je v ireversibilní inhibici trombocytárního ADP receptoru P2Y12. Blokáda funkce tohoto receptoru dlouhodobě inhibuje jak chemotaxi a aktivaci destiček na podnět ADP ve fázi jasné aktivace destiček, tak ve fázi pozdější, tj. agregaci (vzájemnou vazbu) destiček. Inhibuje expresi glykoproteinových receptorů IIb/IIIa, kterými se trombocyty váţí navzájem. Díky tomu, ţe thienopyridiny inhibují jak aktivaci krevních destiček (s uvolněním destičkových působků podporujících hemostázu), tak jejich agregaci (shlukování), tedy tvorbu trombu (destičkové krevní zátky), je místo této lékové skupiny v klinice nezastupitelné. (Bultas,Karetová, 2011) *receptory trombinu pouţívají se blokátory trombinových destičkových receptorů PAR-1, jejich účinek je zaloţen na principu protilátek proti vlastnímu receptoru; trombostatin je degradační oligopeptidový produkt bradykininu o 5 aminokyselinách, který se váţe přímo na aktivní místo receptoru PAR 1. *komplexní inhibitory inhibují více receptorů najednou např. anagrelid, který inhibuje aktivaci po řadě podnětů (ADP, kolagen, AA, trombin aj.). (Pecka, Malý, 2009) 2.2.3 Stabilizace trombocytů Zvýšením metabolických působků camp a cgmp Dipyridamol (CURANTYL) má slabší antiagregační účinky spočívající ve zvýšení camp inhibicí destičkové fosfodiesterázy, která je odpovědná za degradaci camp, zabraňuje adhezi trombocytů k poškozenému endotelu, aktivuje prostacyklin. (Špác, 2008) 2.2.4 Blokáda agregace trombocytů Můţeme ji rozdělit na blokátory receptorů GP IIb/IIIa a na inhibitory geneze trombinu blokátory GP IIb/IIIa brání vazbě bivalentních proteinů (fibrinogen nebo vwf ) k membránovým integrinovým receptorům trombocytů obsazením tohoto receptoru. Vzájemné propojení trombocytů fibrinogenovými můstky je finální krok jejich shlukování. Ačkoliv blokují agregaci navozenou různými agonisty, neovlivňují adhezivitu trombocytů ani koagulační faktory. Skupina blokátorů je chemicky heterogenní a zahrnuje 3 hlavní představitele: *inhibitory na bázi monoklonální protilátky abciximab je rekombinantní chimérická protilátka (kombinace myší části s humánní) s vysokou afinitou k receptoru GP IIb/IIIa 11

a s aditivní aktivitou proti α 1 β 3 integrinu, který zprostředkovává adhezi např. k subendotelovým strukturám. (Farmakoterapeutické informace, 2004) *inhibitory s malou molekulou tyto látky napodobují RGD sekvenci aminokyselin (Arg-Gly-Asp) fibrinogenu a váţou se na specifický receptor GPIIb/IIIa. Rozlišujeme tyto nízkomolekulární látky: peptidové inhibitory eptifibatid-cyklický heptapeptid odvozený z hadího jedu pygmejového chřestýše, obsahuje podobnou strukturu jako vazebná část fibrinogenu a váţe se tak na specifické adhezivní sekvence receptorových aminokyselin. (Zvarová, 2003) nepeptidové inhibitory tirofiban nepeptidový derivát tyrosinu a lamifiban. (Pecka, Malý, 2009) inhibitory geneze trombinu heparin má kromě antikoagulačního i antiagregační účinek, váţe se s receptory destičkové membrány, princip účinku je skrze antitrombin na FXa a tím se sniţuje geneze proagregačního trombinu.(penka, 2004) 12

2.3 Rezistence na antiagregační terapii V tomto odstavci budou podrobněji analyzovány příčiny selhání účinnosti v klinické praxi běţně uţívané antiagregační terapie pro inhibitory sledované v této práci kyselina acetylsalicylová (ASA) a thienopyridinové preparáty. 2.3.1 Aspirinová rezistence Aspirinovou rezistenci lze definovat buď klinicky jako selhání protektivního účinku léčby ASA před trombotickou komplikací, nebo laboratorně jako neschopnost způsobit prodlouţení času krvácivosti či in vitro prokazatelnou inhibici destičkových funkcí. (Hirmerová, Filipovský, 2004) Moţné příčiny vzniku rezistence na ASA: Snížená dostupnost aspirinu: neuţívání předepsaného léku omezení resorbce ASA nedostatečná dávka ASA současné uţívání nesteroidních léků, bránících vazbě ASA na vazné místo COX-1 Převaha ostatních cest stimulace trombocytů: aktivace cestami neblokovanými ASA (stimulace erytrocyty, kolagenem, adrenalinem, trombinem apod.) zvýšená citlivost destiček ke kolagenu nebo ADP syntéza tromboxanu metabolizmem neblokovaným ASA (např. COX-2 v monocytech, makrofázích a endoteliích) Zvýšená novotvorba trombocytů: typicky u nemocných po koronárním bypassu v reakci na krevní ztráty (do oběhu se tím dostávají ve zvýšené míře neaspirinované destičky destičky bez blokády COX, jsou to mladé destičky s vyšší koagulační aktivitou, vzhledem k 24hod. dávkovacímu schématu a krátkému poločasu ASA) Genetické faktory: polymorfizmy destičkových glykoproteinových receptorů: Ia/IIa, Ib/V/IX, IIb/IIIa polymorfizmy receptorů pro kolagen, pro von Willebrandův faktor polymorfizmy enzymů arachidonového metabolizmu: COX-1, COX-1, TXA 2 synt. Jiné faktory: hypercholesterolémie (zvýšená destičková agregabilita) 13

kouření zvýšená tvorba adrenalinu vlivem stresu nebo fyzické námahy tvorba izoprostanů (8 izo PGF 2 alfa) vlivem neenzymatické peroxidace (Karetová, Bultas, 2005) 2.3.2 Rezistence na thienopyridinové preparáty Kromě rezistence na ASA se také vyskytuje rezistence na léčbu clopidogrelem. Faktory vzniku rezistence jsou podobné jako faktoru vzniku rezistence na ASA. Z genetických příčin jsou to polymorfizmy cytochromu P450, polymorfizmy receptoru pro ADP. Z klinických příčin jde opět o nespolupráci v terapii, lékové interakce (mezi clopidogrelem a farmaky metabolizovanými přes cytochrom P450), přidruţené choroby (diabetes, obezita), stresová situace, či zvýšený obrat trombocytů. (Ševčíková et al., 2006) Sníţená účinnost thienopyridinových preparátů je dána: a) geneticky danou sníţenou odpovědí na lék polymorfismy genu pro CYP450 a pro receptor P2Y12 b) lékovými interakcemi:všechny thienopyridiny jsou proléčivy a k vlastnímu farmakologickému účinku je potřeba bioaktivace na aktivní metabolit. Clopidogrel je podáván jako proléčivo prodrug. K jeho biokonverzi na aktivní metabolit je potřeba řady metabolických kroků, na kterých se účastní plejáda izoenzymů cytochromu (CYP). (obr. 2). 14

obrázek 2 bioaktivace clopidogrelu izoenzymy CYP (Bultas 2009) Vzhledem k tomu, ţe 80-90% proléčiva je primárně hydrolyzováno esterázami na inaktivní metabolity a k aktivní konverzi tak zbývá jen malá část substance, je výsledná nabídka aktivního metabolitu velmi citlivá k rychlosti konverze. Inhibice kteréhokoli kroku pak velmi omezí výsledný efekt léčby. Vlastní konverze je zprostředkována v játrech řetězcem kroků, na nichţ se účastní izoenzymy CYP: 1A2, 2C19, 3A5 či 3A4. Prvé tři oxidázy jsou polymorfní, tedy u části populace jsou inaktivní, navíc všechny kroky mohou být účinně inhibovány. V praxi se setkáváme se současným podáváním antiarytmika - amiodaronu, který inhibuje CYP 1A2, 3A4 i 3A5, verapamilu inhibujícím CYP 3A4 i 3A5 či z nekardiologických léků jsou mohutnými inhibitory CYP3A4 a 3A5 antimykotika (itrakonazol, ketokonazol aj.), některá makrolidová antibiotika (zejm. klaritromycin, erytromycin) či flavonoidy z ovocných šťáv či vína (zejm. však z grapefruitu). Nejvýznamnější je pravděpodobně léková interakce na úrovni bioaktivace s inhibitory protonové pumpy (IPP). Některé IPP, konkrétně omeprazol, lanzoprazol či rabeprazol jsou mohutnými inhibitory CYP2C19, klíčového kroku bioaktivace clopidogrelu. (Bultas, 2009) 15

2.4 Metody sledování účinnosti antiagregační léčby Metody pouţívané ke stanovení účinnosti antiagregační léčby lze rozdělit na metody in vivo a in vitro. 2.4.1 Doba krvácení Metoda in vivo, globální test, který nám poskytne první informaci o funkci trombocytů. Princip: měří se čas, za který dojde k zástavě krvácení v místě standardního vpichu či řezu. Metody: Duke, Soulier, Ivy Fyziologické hodnoty: Duke 2-5 min. Soulier 2-4,5 min. Ivy 3-8 min. (Pecka, 2004) 2.4.2 Agregometry Tyto přístroje byly pouţity pro měření účinnosti antiagregační léčby v této práci, proto se principem budu zabývat podrobněji. Agregometry jsou speciálně upravené přístroje pro agregaci trombocytů. Rozlišujeme agregometry optické a impedanční. 2.4.3 Optické agregometry Optické agregometry pracují na principu turbidimetrické metody, kterou vynalezl Gustav Born (Born, 1962). Pro měření je nutné připravit tzv. plazmu bohatou na destičky (PRP). Princip:Turbidimetrické stanovení vyuţívá spektrofotometrie. Jak destičky agregují, dochází ke změně průchodu světla suspenzí destiček po přidání agonisty (dochází k vyčeření plazmy bohaté na destičky). (obr. 3) Výsledek se zaznamenává jako agregační křivka. (obr. 4) 16

obrázek 3 princip optické agregace obrázek 4 příklad agregační křivky (http://www.biodatacorp.com/plateletaggregation/aggregation-instruments.html Agregační křivka je záznam děje, ze kterého se vyhodnocují jednotlivé parametry agregační křivky: PA primární agregace, jedná se o počáteční vlnu agregace PS primary slope, primární nebo jediná směrnice (%/min.) SA sekundární agregace, je to sekundární agregační vlna SS secondary slope, sekundární směrnice sekundární vlny agregace (%/min.) AUC plocha pod křivkou, je výpočtem procent agregace za minutu (AU/min.) LP lag phase, je to čas mezi přidáním posledního činidla a iniciací agregace (sec.) DA desagregace, je měření z bodu maximální agregace do bodu, kdy se agregáty rozpadají (%) MA maximální agregace, nejvyšší agregace v průběhu testu (%) FA final aggregation, konečná agregace při zastavení testu (%) 17

V této práci byl k měření využit Agregometr PAP-8E (fy BIODATA corp., Pennsylvania, USA) Je schopen automaticky zaznamenávat a hodnotit agregační křivky v 8 nezávislých měřících kanálech najednou. Po ukončení agregace je schopen automaticky vyhodnotit parametry agregační křivky (slope a maximální amplitudu v %). Agregometr model PAP-8E měří agregaci krevních destiček v plasmě bohaté na trombocyty (PRP). (http://www.biodatacorp.com/platelet-aggregation/aggregationinstruments.html) 2.4.2.2 Impedanční agregometry Impedanční agregometr Multiplate byl vyvinut Cardinalem a Flowerem (1979) a pouţíván je od 1980 pro posouzení destičkových funkcí v plné krvi.(fy Multiplate, SRN) Princip: Agregační křivka je výsledek měření rychlosti agregace trombocytů zaloţeném na impedančním principu. Informuje o části primární hemostázy zprostředkované krevními destičkami. Na rozdíl od optických agregací se jedná o sledování chování krevních destiček v plné krvi (tzn. za přítomnosti dalších krevních elementů erytrocyty a leukocyty). Průběh agregace je monitorován přístrojem zvaným impedanční agregometr. V kaţdé kyvetě je dvojice elektrod, které jsou vyrobeny z vysoce vodivé mědi a jsou potaţeny stříbrem. Účinkem induktoru dochází u trombocytů nejprve ke změně tvaru a následné adhezi na elektrody a vzájemné agregaci. Jakmile trombocyty obalí elektrody, dochází ke zvýšení elektrického odporu mezi nimi. (obr. 5). Tato změna impedance v čase je kontinuálně zaznamenávána a graficky vyhodnocena jako agregační křivka. (obr. 6) Kombinací parametrů agregačních křivek samovolné agregace a agregace indukované různými induktory lze určit typ poškození krevních destiček. (http://www.multiplate.net/en/index.php) 18

Hodnocení agregační křivky: AUC plocha pod křivkou (AU*min) Aggregation RUO maximální amplituda (AU) Velocity RUO rychlost nárůstu agregační křivky (AU/min.) Pouţívané induktory pro základní vyšetření agregace trombocytů: ADP, kyselina arachidonová (ASPI), kolagen, ristocetin, peptid aktivující trombinový receptor TRAP - 6, prostaglandin PGE 1 Pouţívané induktory pro sledování antiagregační léčby: léčba Anopyrinem,Ibustrinem ASPI léčba Clopidogrelem,Ticlopidinem ADP, ADP-HS léčba antagonisty GPIIb/IIIa kolagen, TRAP, ADP, ADP-HS, ASPI principle of Multiplate analysis firm adhesion and aggregation of platelets on the sensor surface enhances the electrical resistance between the 2 sensor wires obrázek 5 princip impedanční agregace (http://www.multiplate.net/en/index.php) 19

Aggregation (AU) Multiplate measurement and parameters Sensor 1+2 Area under the curve (AUC) time (min) obrázek 6 hodnocení agregační křivky (http://www.multiplate.net/en/index.php) 2.4.3 Platelet Function Analyzer 100 (PFA 100 - fy Siemens Healthcare diagnostics, SRN) Slouţí k vyšetření rezistence na ASA. Tato metoda měří destičkové funkce za pouţití plné krve. Systém obsahuje malý otvor krytý kolagenem a adrenalinem nebo kolagenem a ADP. Krev je nasáta otvorem, čímţ je simulováno tření prouděním krve. Agregací trombocytů se vytvoří zátka, která uzavře otvor. Měří se čas do uzavření tzv. closure time. (Karetová, Bultas, 2005) 20

2.4.4 Verify Now (fy Accumetrics, USA) Verify Now je přístroj, který se pouţívá ke komplexnímu posouzení funkce trombocytů v plné nesráţlivé krvi. Pouţívá se téţ k monitorování antiagregační léčby na ASA, dále na inhibitory P2Y12 (clopidogrel, ticlopidin) a inhibitory GP IIb/IIIa (abciximab ReoPro, eptifibatid integrilin). Pouţívají se AA, ADP nebo trombinový receptor aktivující peptid (TRAP). Přístroj pracuje na principu optické agregometrie. (Gurbel et al., 2007) 2.4.5 Koncentrace tromboxanu B 2 v séru a 11 - dehydro-tromboxanu B 2 v moči Tromboxan B 2 je metabolitem TXA 2.Koncentrace těchto molekul se stanovuje pomocí metody ELISA. Nevýhodou je, ţe jde o nepřímé měření a ţe existuje mimodestičkový zdroj TXA 2. Při měření koncentrace 11 dehydro-tromboxanu B 2 je koncentraci nutno vztáhnout k aktuální hodnotě kreatininu. (Osmančík et al., 2010) Tato metoda se vyuţívá ve výzkumu. 2.4.6 Stanovení exprese destičkových receptorů pomocí průtokové cytometrie Průtoková cytometrie detekuje povrchové markery trombocytů, odráţející jejich aktivaci (např. P-selektin, CD63, změny v konformaci komplexu GP IIb/IIIa), opět po stimulaci různými agonisty, a to v nesráţlivé plné krvi s pouţitím monoklonálních protilátek. Jedná se o nákladnou metodu, která se provádí jen ve specializovaných laboratořích. (Hirmerová, 2009) 2.4.7 Trombelastografie Trombelastografie analyzuje kvalitativní a kvantitativní údaje, které charakterizují tvorbu trombu, kinetiku jeho růstu. Sleduje pevnost, stabilitu a schopnost retrakce krevní sraţeniny. (Pecka, 2010) Dnes se vyuţívá v akutní medicíně na anesteziologicko resuscitačních oddělení pro akutní řešení krvácivých stavů z komplexních příčin (např. při transplantaci jater). 21

2.4.8 Hematologický analyzátor krevních elementů K agregaci trombocytů potřebujeme také znát počet trombocytů v periferní krvi. K tomu nám slouţí automatický analyzátory krevních elementů, které nám kromě počtu trombocytů poskytnou další údaje o parametrech krevní destičky: MPV střední objem destičky, který vyjadřuje průměrný objem buňky PDW šíře distribuce destiček, které nám reprezentuje šíří nejčetnější populace trombocytů podle jejich objemu Pct destičkový hematokrit, který informuje o tom, jakou část objemu v celkovém objemu plasmy zaujímají izovolumetricky sférované destičky (Pecka, 2010) V této práci byl pouţit plně automatický analyzátor COULTER LH-750 Hematology Analyzer (fy Immunotech, USA), který je určen k přímému měření krevního obrazu a 5 - ti populačního diferenciálu z plné krve. (http://www.immunotech.cz/products_hem_lh750.htm) Pro správnost měření se provádí denně interní kontrola kvality - série testů tzv. START - UP, která musí splnit nastavená kriteria, dále se měří tři hladiny kontrol a provádí se mezipřístrojová kontrola kvality na dvou vzorcích pacientů s rozdílnými hodnotami. 22

3 Praktická část 3.1 Odběr krve PAP-8E Odběr krve pro vyšetření agregace se provádí do zkumavky 5ml (VACUETTE, výrobce Greiner Bio One, Rakousko). 5ml zkumavka obsahuje 0,5ml 3,2% citrátu sodného jako antikoagulancia. Uzavřeným vakuovým systémem se provede odběr krve po rysku na zkumavce (akceptovatelná odchylka je ± 10%. Vzorek se musí zpracovat do 2hodin po odběru. LH-750 Odběr krve pro vyšetření počtu trombocytů se provádí do zkumavky 2ml (VACUETTE, výrobce Greiner Bio One, Rakousko).2ml zkumavka obsahuje K 3 EDTA (1,5g na 1l krve). Multiplate Odběr krve se provádí do speciální zkumavky s hirudinem 3ml (fy Dynabyte, SRN - koncentrace hirudinu je 25ug/l). Vzorek se musí zpracovat do 3hodin po odběru. 3.2 Příprava vzorku a analýza Vzorky pro PAP-8E se centrifugují při 150g/10minut. (centrifuga Allegra X-12). Po centrifugaci se odebere plasma bohatá na destičky (PRP)do zkumavky, jedna ze zkumavek se centrifuguje při 1500-2500g/15 min. (Allegra X-12), abychom získali plasmu chudou na destičky, ve které počet destiček má být menší neţ 20x10 9 /l. Provede se analýza PRP pro zjištění počtu trombocytů, optimální počet destiček v PRP je 250-300x10 9 /l. Při vyšším počtu destiček se PRP naředí plasmou chudou na trombocyty. Zároveň se provede analýza krevního obrazu na LH - 750 pro zjištění počtu trombocytů, zkumavka se před analýzou krevního obrazu promíchává 15min.na válivé třepačce. Vzorek krve pro Multiplate se nechá 15min. na válivé třepačce promíchat, změří se počet trombocytů. Podle standardního operačního postupu a dle udané léčby z oddělení se provede vlastní vyšetření agregace trombocytů. 23

3.3Výsledky měření Pouţívané induktory pro sledování antiagregační léčby na PAP - 8E : léčba Clopidogrelem, Ticlopidinem ADP (5uM, 10uM), spontánní agregace léčba Anopyrinem AA, spontánní agregace 3.3.1 Agregace po AA Pro agregaci po AA pouţíváme lyofilizovaný přípravek kyseliny arachidonové od fy BIODATA corp., kdy pracovní koncentrace AA je 5g/l. Finální koncentrace v kyvetě je 0,5g/l. Fyziologické hodnoty pro neléčené pacienty: 58-120% Hodnota pro sledování účinnosti ASA: 0-20% 3.3.2 Agregace po ADP Pro agregaci po ADP pouţíváme lyofilizovaný přípravek adenosin-5'difosfátu od fy BIODATA corp., pracovní koncentrace rozpuštěného činidla je 200uM. Finální koncentrace v kyvetě je 10uM a 5uM. Fyziologické hodnoty pro neléčené pacienty: ADP 10uM 69-120% desagregace 0-8% ADP 5uM 56-120% desagregace 0-21% U správně léčených pacientů thienopyridiny by se hodnoty maximální amplitudy měly pohybovat pod fyziologickými hodnotami pro neléčené pacienty: ADP 10uM 0 68% ADP 5uM 0 55% Pouţívá se také slovní hodnocení v klinické praxi slabá odpověď, silná odpověď, rezistence. 3.3.3 Spontánní agregace U některých diagnostických stavů dochází in vitro v plasmě bohaté na trombocyty za definovaných podmínek (teplota, rychlost míchání) po určité době k samovolnému shlukování trombocytů. (Pecka 2010) 24

Vyšetřuje se u všech diagnostických stavů, u kterých předpokládáme zvýšenou aktivitu trombocytů (čerstvý infarkt myokardu, DIC syndrom). Fyziologické hodnoty: 0 5% Zvýšené hodnoty: nad 10% Pouţívané induktory pro sledování antiagregační léčby na Multiplate : léčba Anopyrinem,Ibustrinem ASPI léčba Clopidogrelem,Ticlopidinem ADP, ADP-HS léčba antagonisty GPIIb/IIIa kolagen, TRAP, ADP, ADP-HS, ASPI Fyziologické hodnoty: ADP 534 1220 AU*min. ADP - HS 311 1071 AU*min. kolagen 459 1166 AU*min. TRAP 6 941 1563 AU*min. ASPI 45 1361 AU*min. U správně léčených pacientů by se hodnoty plochy pod křivkou měly pohybovat pod fyziologickými hodnotami pro neléčené pacienty. 25

Číslo pac. JMENO DEN MESIC ROK Tabulka 1 výsledky měření 1 DIAG AGSP A10 A5 AA ADPI ADPH AAI Maximální povolená agregace pro hodnocení účinnosti léčby (%) 10 69 56 20 534,0 311,0 745,0 D. B. 7 1 2011 I10 3 112 81 82 287,0 197,0 171,0 PLAVIX MOŢNÁ PLAVIX (SPORNÉ VÝSLEDKY) MOŢNÁ (SPORNÉ VÝSLEDKY) ANTIAGREGAČ NÍ LÉČBA PLAVIX, 2 T. B. 30 12 2009 I10 4 21 19 5 81,0 106,0 95,0 PLAVIX, 3 S. B. 21 5 2010 I210 3 20 18 0 339,0 193,0 199,0 PLAVIX, 4 R. C. 8 12 2008 I10 2 61 46 5 344,0 129,0 168,0 5 6 V. D. 18 3 2011 E780 1 41 29 3 V. D. 24 1 2011 E780 94,0 46,0 (POUZE (POUZE PLAVIX, 7 V. D. 30 9 2008 I251 2 42 30 6 162,0 123,0 109,0 PLAVIX, 8 V. F. 1 6 2010 I258 7 32 35 9 263,0 203,0 203,0 TICLID, 9 D. F. 16 6 2010 D752 6 65 34 3 306,0 10 D. F. 15 6 2010 D752 3 58 24 3 (POUZE 11 A. F. 10 1 2011 I10 8 40 29 22 168,0 160,0 136,0 PLAVIX, 12 13 A. F. 20 12 2010 I10 17 87 73 81 440,0 386,0 400,0 P. F. 28 5 2008 I460 6 76 70 15 PLAVIX (POUZE MOŢNÁ (SPORNÉ VÝSLEDKY) (POUZE PLAVIX, ASPEGIC (ASA) POZNÁMKA AGREGACE, IMPEDANČNÍ NENÍ 26

Číslo pac. JMENO DEN MESIC ROK DIAG AGSP A10 A5 AA ADPI ADPH AAI PLAVIX ANTIAGREGAČ NÍ LÉČBA POZNÁMKA 14 T. G. 5 10 2009 I258 9 93 19 75 269,0 57,0 875,0 MOŢNÁ PLAVIX (SPORNÉ VÝSLEDKY) PLAVIX, 15 Z. G. 23 6 2008 I10 5 53 32 235,0 209,0 65,0 PLAVIX, 16 Z. G. 17 6 2008 I10 8 52 50 13 51,0 59,0 56,0 PLAVIX, 17 J. G. 7 12 2010 D689 6 36 29 8 13,0 8,0 40,0 PLAVIX, 18 19 J. G. 16 11 2010 D689 48 66 92 120 PLAVIX (POUZE M. H. 4 7 2011 I258 8 39 26 57 (POUZE (HRANIČNÍ HODNOTA) PLAVIX, PLAVIX, 20 K. H. 23 4 2008 I213 1 50 43 5 274,0 158,0 94,0 PLAVIX, 21 P. H. 26 9 2008 I10 28 120 120 57 54,0 PLAVIX (POUZE PLAVIX, 22 V. H. 2 12 2009 Z944 5 87 81 20 138,0 P. H. 10 11 2010 I258 23 72 57 16 214,0 229,0 190,0 MOŢNÁ PLAVIX (SPORNÉ PLAVIX, 23 VÝSLEDKY) F. H. 29 2 2008 I10 3 60 56 8 (POUZE 24 25 K. J. 20 4 2010 D45 4 74 60 2 1062,0 733,0 29,0 26 A. J. 28 2 2011 I10 8 49 39 16 (POUZE VE FARMAKOTERAPII UDÁVÁNA LÉČBA HELICIDEM (OMEPRAZOL) 27

Číslo pac. JMENO DEN MESIC ROK DIAG AGSP A10 A5 AA ADPI ADPH AAI PLAVIX ANTIAGREGAČ NÍ LÉČBA POZNÁMKA 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 V. K. 26 4 2011 D689 10 50 41 Z. K. 24 8 2010 D689 6 70 55 6 238,0 167,0 15,0 Z. K. 22 7 2010 D689 5 75 66 (POUZE MOŢNÁ PLAVIX (SPORNÉ VÝSLEDKY) J. K. 3 1 2011 I10 16 52 30 19 137,0 149,0 K. K. 1 7 2009 I258 7 32 26 8 (POUZE (POUZE (POUZE (POUZE J. K. 3 7 2009 I10 8 37 34 5 282,0 165,0 203,0 J. K. 24 6 2011 I258 2 13 19 4 (POUZE (POUZE J. K. 19 8 2010 D689 2 51 39 14 148,0 130,0 106,0 J. K. 27 4 2010 I259 7 50 46 61 J. K. 28 11 2008 I213 9 5 11 0 (POUZE (POUZE (POUZE APO-TIC (TICLOPIDIN) PLAVIX, PLAVIX, PLAVIX, GODASAL (ASA) PLAVIX, PLAVIX, GODASAL(ASA) PLAVIX, PLAVIX, 28

Číslo pac. JMENO DEN MESIC ROK DIAG AGSP A10 A5 AA ADPI ADPH AAI PLAVIX ANTIAGREGAČ NÍ LÉČBA POZNÁMKA 37 K. K. 12 10 2009 I258 4 79 61 1 603,0 266,0 116,0 PLAVIX PLAVIX, 38 39 J. K. 13 4 2011 D689 9 62 43 10 104,0 J. K. 3 3 2011 D689 21 100 85 19 51,0 60,0 2,0 MOŢNÁ PLAVIX (SPORNÉ VÝSLEDKY) PLAVIX, 40 L. K. 5 9 2008 I10 2 22 19 7 139,0 139,0 126,0 PLAVIX, 41 J. K. 30 3 2010 I258 2 26 22 5 297,0 303,0 PLAVIX, 42 M. M. 11 5 2010 Q613 7 16 12 60 16,0 52,0 PLAVIX, 43 M. M. 29 4 2010 Q613 4 29 21 17 84,0 72,0 PLAVIX, 44 45 J. M. 13 5 2011 D686 9 84 68 14 788,0 677,0 186,0 J. M. 27 4 2010 N31 3 90 83 84 751,0 PLAVIX 46 J. M. 16 11 2009 N31 8 75 76 9 554,0 419,0 113,0 47 J. M. 16 10 2009 N31 1 92 102 101 749,0 464,0 903,0 48 B. M. 15 12 2008 I10 3 23 17 406,0 178,0 1170,0 PLAVIX J. M. 21 1 2009 I258 22 95 95 15 809,0 735,0 109,0 49 PLAVIX PLAVIX, J. M. 26 5 2009 I258 4 57 52 9 (POUZE 50 Z. M. 9 4 2009 I10 3 72 57 13 760,0 252,0 (POUZE TICLOPIDIN APO-TIC, 51 VE FARMAKOTERAPII UDÁVÁNA LÉČBA HELICIDEM (OMEPRAZOL) VE FARMAKOTERAPII UDÁVÁNA LÉČBA HELICIDEM (OMEPRAZOL) VE FARMAKOTERAPII UDÁVÁNA LÉČBA HELICIDEM (OMEPRAZOL) 29

Číslo pac. JMENO DEN MESIC ROK DIAG AGSP A10 A5 AA ADPI ADPH AAI PLAVIX ANTIAGREGAČ NÍ LÉČBA POZNÁMKA 52 53 54 55 Z. M. 6 4 2009 I10 6 70 49 11 676,0 320,0 Z. M. 30 3 2009 I10 10 65 67 19 904,0 457,0 373,0 Z. M. 26 3 2009 I10 2 65 61 59 365,0 199,0 672,0 P. N. 20 11 2009 I258 6 73 67 9 PLAVIX PLAVIX MOŢNÁ PLAVIX (SPORNÉ VÝSLEDKY) PLAVIX (POUZE (POUZE (POUZE PLAVIX, PLAVIX, PLAVIX, PLAVIX, 56 C. P. 16 4 2009 Z940 5 89 70 13 385,0 256,0 212,0 57 T. P. 3 7 2008 E107 12 120 62 25 702,0 268,0 131,0 58 L. P. 30 7 2010 I240 4 30 14 10 256,0 252,0 231,0 59 F. P. 20 2 2008 G459 3 14 6,0 60 J. P. 29 1 2008 I259 4 28 25 3 148,0 49,0 175,0 PLAVIX, 61 O. P. 15 12 2008 I258 2 62 54 7 151,0 102,0 65,0 PLAVIX MOŢNÁ O. P. 14 10 2008 I258 50 120 107 51 268,0 145,0 149,0 PLAVIX (SPORNÉ PLAVIX, 62 VÝSLEDKY) MOŢNÁ O. P. 18 8 2008 I10 25 76 55 19 33,0 28,0 50,0 PLAVIX (SPORNÉ PLAVIX, 63 VÝSLEDKY) 64 Z. P. 4 8 2008 I10 6 57 36 31 252,0 171,0 508,0 PLAVIX, VE FARMAKOTERAPII UDÁVÁNA LÉČBA HELICIDEM (OMEPRAZOL) VE FARMAKOTERAPII UDÁVÁNA LÉČBA HELICIDEM (OMEPRAZOL) VE FARMAKOTERAPII UDÁVÁNA LÉČBA HELICIDEM (OMEPRAZOL) VE FARMAKOTERAPII UDÁVÁNA LÉČBA HELICIDEM (OMEPRAZOL) VE FARMAKOTERAPII UDÁVÁNA LÉČBA HELICIDEM (OMEPRAZOL) 30

Číslo pac. JMENO DEN MESIC ROK DIAG AGSP A10 A5 AA ADPI ADPH AAI PLAVIX ANTIAGREGAČ NÍ LÉČBA POZNÁMKA 65 66 67 K. P. 15 1 2009 I251 5 77 55 6 122,0 0,0 2,0 MOŢNÁ PLAVIX (SPORNÉ VÝSLEDKY) K. P. 15 12 2008 I10 4 59 37 62,0 79,0 4,0 R. P. 10 7 2008 I10 6 76 10 6 284,0 252,0 297,0 MOŢNÁ PLAVIX (SPORNÉ VÝSLEDKY) (POUZE IMPEDANČNÍ PLAVIX, PLAVIX, PLAVIX, 68 V. P. 28 7 2008 I10 8 45 34 23 36,0 36,0 73,0 P. P. 29 6 2010 I10 8 80 34 38 139,0 141,0 106,0 MOŢNÁ PLAVIX (SPORNÉ PLAVIX, 69 VÝSLEDKY) MOŢNÁ V. R. 23 3 2010 I258 8 58 54 75,0 74,0 PLAVIX (hraniční PLAVIX 70 hodnota ADP) 71 J. S. 30 11 2010 I10 10 61 45 18 48,0 80,0 8,0 PLAVIX, 72 73 74 J. S. 7 5 2010 I10 7 47 42 5 J. S. 5 1 2010 D698 4 71 64 10 J. S. 14 12 2009 I10 6 89 74 9 (POUZE PLAVIX (POUZE (POUZE (POUZE (POUZE PLAVIX, PLAVIX, 75 J. S. 7 12 2009 I213 6 68 83 8 333,0 182,0 161,0 VE FARMAKOTERAPII UDÁVÁNA LÉČBA HELICIDEM (OMEPRAZOL) VE FARMAKOTERAPII ORTANOL (OMEPRAZOL) HELICID 20mg 1xd FARMAKOTERAPIE GASEC (OMEPRAZOL) 31

Číslo pac. JMENO DEN MESIC ROK DIAG AGSP A10 A5 AA ADPI ADPH AAI PLAVIX ANTIAGREGAČ NÍ LÉČBA POZNÁMKA 76 77 78 79 80 81 J. S. 5 1 2010 I258 3 87 76 82 L. S. 8 2 2008 Q211 232,0 24,0 42,0 K. S. 29 9 2009 E780 11 41 29 72 K. S. 21 9 2009 E780 4 51 35 65 A. S. 14 2 2011 E780 9 60 41 8 M. S. 22 7 2008 I258 11 93 87 15 PLAVIX (POUZE (POUZE IMPEDANČNÍ (POUZE (POUZE (POUZE IMPEDANČNÍ (POUZE (POUZE (POUZE (POUZE PLAVIX, PLAVIX, PLAVIX, 82 83 B. S. 26 2 2009 I10 874,0 622,0 54,0 B. S. 26 2 2009 I10 4 44 36 PLAVIX (POUZE IMPEDANČNÍ (POUZE (POUZE IMPEDANČNÍ PLAVIX, PLAVIX, VE FARMAKOTERAPII UDÁVÁNA LÉČBA HELICIDEM (OMEPRAZOL) HELICID 20mg 1xd 84 B. S. 20 2 2009 I213 6 68 52 7 598,0 345,0 408,0 SNÍŢENÁ ÚČINNOST PLAVIX LÉČBA ÚČINÁ PLAVIX, VE FARMAKOTERAPII UDÁVÁNA LÉČBA HELICIDEM (OMEPRAZOL) 32

Číslo pac. JMENO DEN MESIC ROK DIAG AGSP A10 A5 AA ADPI ADPH AAI PLAVIX ANTIAGREGAČ NÍ LÉČBA POZNÁMKA 85 86 B. S. 19 2 2009 I10 12 57 51 8 729,0 576,0 266,0 J. Š. 16 2 2010 I258 89 91 69 MOŢNÁ PLAVIX (SPORNÉ VÝSLEDKY) PLAVIX (POUZE LÉČBA ÚČINÁ (POUZE PLAVIX, PLAVIX, GODASAL (ASA) 87 A. T. 4 12 2008 I10 3 20 15 4 85,0 91,0 91,0 PLAVIX, 88 J. V. 17 3 2008 I213 3 52 41 12 199,0 112,0 42,0 PLAVIX, 89 90 J. V. 15 6 2009 I10 10 44 34 37 (POUZE R. V. 18 2 2010 I213 6 6 4 112,0 71,0 PLAVIX, PLAVIX, INTEGRILIN 91 H. V. 21 6 2011 D70 3 68 56 8 643,0 456,0 74,0 92 A. V. 21 4 2010 E780 4 60 41 63 283,0 116,0 791,0 PLAVIX 93 94 P. Z. 18 3 2010 I10 7 63 68 20 753,0 341,0 PLAVIX (POUZE PLAVIX, V. Z. 14 10 2008 C911 16 47 40 11 110,0 130,0 149,0 PLAVIX, VE FARMAKOTERAPII UDÁVÁNA LÉČBA HELICIDEM (OMEPRAZOL) FARMAKOTERAPIE LANZUL (LANZOPRAZOL) BLOKUJE PŘEMĚNU CLOPIDOGRELU V JÁTRECH plně zablokovány i ostatní optické agregace: EPI 10, kolagen, extrémně sníţené impedanční agregace TROi, COL, VE FARMAKOTERAPII UDÁVÁNA LÉČBA HELICIDEM (OMEPRAZOL) 33

3.4 DISKUZE VÝSLEDKŮ Od začátku roku 2008 bylo sledováno celkem 94 pacientů, u nichţ bylo provedeno agregační vyšetření účinnosti antiagregační léčby. 28 z nich mělo zavedenou léčbu pouze ASA v dávce 75 200 mg (1-2x denně), přičemţ maximální dávka za 24 hodin byla 200 mg ASA. 6 sledovaných pacientů bylo léčeno thienopyridiny, nejčastěji PLAVIXEM 75 mg 1-2x denně. U zbývajících 60 pacientů byla udána kombinovaná léčba - u 59 - ASA + thienopyridiny, 1 pacient měl zavedeno léčbu ASA + inhibitor GPIIb/IIIa (Integrilin), (Integrilin byl podán formou infuze, dávka eptifibatidu v této práci nezjištěna). LÉČBA ASA (28 pacientů): Tento soubor je relativně malý, z důvodů toho, ţe protidestičková léčba ASA se běţně nekontroluje. Dle Patricie Gumové je za tzv. aspirinovou rezistenci povaţován stav, kdy po léčbě ASA nedojde při vyšetření agregometrem po přidání ADP (10umol/l) k poklesu agregace destiček pod 70%, nebo po přidání arachidonové kyseliny pod 20%.(Gum, 2002) V této práci byla v souvislosti s účinností léčby ASA sledována agregace po indukci AA. Ve článcích MUDr. Karetové nebo Hirmerové je tento fenomén upřesněn jako laboratorní průkaz selhání léčby kyselinou ASA. Za rezistenci lze dle autorek článků povaţovat pouze klinický stav, kdy léčba ASA nezabránila trombotické příhodě. Ke zpracování této práce jsem měla pouze omezené mnoţství klinických dat, a proto se mé poznatky a údaje o aspirinové rezistenci opírají pouze o laboratorní sledování v souvislosti s údaji o farmakoterapii. Z 28 pacientů léčených ASA měli 3 (10,7%) sníţenou účinnost pouze opticky (dle impedanční agregometrie byla léčba účinná). Není moţno jednoznačně určit, která z metodik lépe odpovídá tzv. klinické rezistenci. Optická agregometrie hodnotí samotné trombocyty, zpracování krve pro tuto metodiku je však velmi náročné a můţe konečný výsledek ovlivnit. Impedanční agregace jsou měřeny v plné krvi, za účinku ostatních sloţek krve, metabolitů, případně jiných léčiv. Vzhledem k moţnému riziku trombotické příhody bylo na pacienty s rozporuplnými výsledky mezi optickou a impedanční agregometrií nahlíţeno jako MOŢNÉ SELHÁNÍ ASA LÉČBY. Další 4 z 28 (14%) sledovaných pacientů byli rezistentní oběma metodikami - u 2 se účinnost upravila zvýšeným dávkováním ASA a u 1 kombinací s clopidogrelem. Pouze u 1 34

pacienta (K. S.) nebyla účinnost ASA zvýšena úpravou dávkování, či kombinací s clopidogrelem. U posledního pacienta se na ASA rezistenci bude podílet patrně některá z dalších příčin (viz teorie k rezistenci ASA). Z diskuze vyplývá, ţe 7 z 28 (25%) sledovaných pacientů mělo určitým způsobem sníţenou účinnost ASA léčby. V literatuře se uvádí, ţe aspirinovou rezistencí je ohroţeno asi 10% pacientů léčených ASA (Kvasnička, 2003). Vyšší procento (tzv. laboratorní) aspirinové rezistence ve sledovaném souboru, si vysvětluji tím, ţe všichni pacienti léčení ASA se běţně nevyšetřují a do laboratoře IKEM jsou zasílání jiţ pacienti s trombotickými komplikacemi, nebo jinými klinickými známkami ASA rezistence. Ve sledovaných datech se podařilo zjistit, ţe u 3 (43%) pacientů s nalezeným laboratorním selháním léčby se účinnost léčby upravila změnou dávkování ASA, či kombinací s clopidogrelem (Plavixem). LÉČBA THIENOPYRIDINY (6 pacientů): Tento soubor je velmi malý, u většiny pacientů sledovaných v IKEM, kteří měli klinické projevy zvýšené agregace trombocytů (stenózy, uzávěry stentů, ) měli zavedenou duální léčbu Clopidogrel + ASA. První pacientka (M. B.) měla zaveden Clopidogrel preventivně, z důvodů implantace koronárního stentu. Další pacient (P. O.) byl zaslán do laboratoře 3x. Při léčbě izolovaně Clopidogrelem, mu nebyl podán omeprazol léčba byla účinná. V ostatních dvou odběrech byl léčen současně ASA a bylo zjištěno podání omeprazolu léčba Clopidogrelem byla neúčinná. U třetího pacienta (R. V.) léčeného izolovaně Clopidogrelem byla zavedena léčba omeprazolem, léčba byla vyhodnocena jako účinná oběma přístroji. Je moţné, ţe omeprazol byl podán v odstupu několika hodin po Plavixu a ten se stihl přeměnit na účinnou formu. O dalších 3 pacientech jsme bohuţel nezjistili údaje o léčbě omeprazolem. Důvody podávání omeprazolu: většina kardiologických pacientů má další onemocnění, časté je vředové onemocnění ţaludku a dvanácterníku. KOMBINOVANÁ LÉČBA ASA+THIENOPYRIDINY(60 pacientů): Ve sledovaném souboru bylo celkem 25 (42%) pacientů vyhodnoceno s rizikem sníţené účinnosti na thienopyridiny. U více než poloviny rezistentních pacientů - 15 pacientů (60%) byla ve farmakoterapii uvedena léčba inhibitory protonové pumpy (převážně omeprazolem). Osm pacientů mělo neúčinnou současně léčbu thienopyridiny, ale i ASA. Polovina z nich, čtyři pacienti, byla současně léčena IPP 35

(omeprazol). Je to velmi alarmující zjištění. Podávání omeprazolu či lanzoprazolu, jako prevence krvácení do zaţívacího traktu při duální léčbě ASA a clopidogrelem můţe mít velmi nepříznivý dopad na prognózu nemocných. Další příčinou zřejmě bylo to, ţe kombinovaná léčba je uţívána u pacientů s větším či opakovaným ischemickým poškození myokardu, tedy u pacientů, kde rezistence na antiagregační terapii bývá častější. Dva pacienti měli interferenci omeprazolem, ale agregace byly u obou metod zablokované. Jeden (S. B.) z těchto pacientů byl zaslán do laboratoře opakovaně (4x) právě z důvodů rezistence na Clopidogrel. Účinnost léčby v tomto jednom případě si zdůvodňuji tím, ţe pacient omeprazol buď neuţil, nebo mu byl podán s časovým odstupem, 36

4 ZÁVĚR: LÉČBA ASA: V naměřených a vyhodnocených datech z laboratoře IKEM, bylo nalezeno vysoké procento pacientů s moţným či vysoce pravděpodobným selháním léčby. Tento fakt potvrdil podezření kliniků na aspirinovou rezistenci (přesněji selhání aspirinové léčby). Mezi neţádoucí účinky léčby ASA patří slizniční krvácení zejména do zaţívacího traktu, z tohoto důvodu není moţné u všech rizikových pacientů preventivně maximálně zvýšit dávky ASA. Doporučená dávka ASA je 100 mg/den. U části pacientů s aspirinovou rezistencí se dosáhne účinné terapie zvýšením dávky na 200mg/den, ale maximálně do 300mg/den. Laboratorní diagnostika můţe napomoci co nejlépe nastavit antiagregační léčbu s co nejmenšími neţádoucími účinky. LÉČBA THIENOPYRIDINY : Při vyhodnocování agregačních měření, je velmi důleţité upozornit lékaře na riziko současného podávání inhibitorů protonové pumpy (omeprazolu). Vysoké procento pacientů rezistentních z důvodů této interakce ukazuje, ţe je tato interakce hodně podceňovaná. VYHODNOCENÍ ZPŮSOBŮ MONITOROVÁNÍ ANTIAGREGAČNÍ LÉČBY: I kdyţ impedanční agregace jsou měřeny v plné krvi a zdálo by se, ţe odráţejí stav in - vivo lépe, bylo tedy překvapením, ţe u pacientů léčených thienopyridiny, jejichţ účinek byl inhibován inhibitory protonové pumpy (IPP), tuto blokádu na rozdíl od optických měření nezaznamenaly u 6 pacientů (24%) z 25 pacientů s rezistencí na thienopyridiny. V mé práci jsem zjistila, ţe optická agregometrie citlivěji předpovídala riziko selhání antiagregační léčby. Optický princip agregometrie z 60. let minulého století je stále povaţován za zlatý standard vyšetřování funkce trombocytů i přes snahy vyvinout moderní, přesnější a jednodušší princip měření funkce trombocytů. Nevýhodou optické agregometrie je pracnost metody s vysokými nároky na obsluhující personál a obtíţnou aţ nemoţnou interní a externí kontrolu kvality. 37

Seznam použité literatury Literatura Awtry, H. A., Loscalzo, J.: Aspirin. Circulation 2000; 101: 1206-1218 Born, G. V. R.: Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and it's reversal. Nature 1962; 194; 927 929 Bultas, J.: Léková interakce clopidogrelu s inhibitory protonové pumpy proč změnit omeprazol za pantoprazol; Sandoz příloha 3/2009; viz www.sukl.cz Bultas, J., Karetová, D.: Clopidogrel v ordinaci praktického lékaře. Kap kardiol 2011; 3(2): 46-54 Farmakoterapeutické informace 2/2004; viz www.sukl.cz Gum, P. A.,Kottke - Marchant, K., Poggio, E. D., et al.: Oxidant stres and aspirinsensitive rhinosinusitis. N. Engl. J. Med., 347, 2002, 1493-1499 Gurbel, P. A., Becker, R. C., Mann, K., G.,Steinhubl, S., R., Michelson, A., D.: Platelet function monitoring in patients with coronary artery disease. Journal of American College of Cardiology, volume 50, issue 19/2007; 1822 1834, viz www.sciencedirect.com Hirmerová, J., Filipovský, J.: Klinický význam aspirinové rezistence. Vnitřní lékařství, 50, 2004/6, 462 469 Hirmerová, J.: Aspirinová rezistence současné názory a doporučení pro praxi. Interní lékařství 2009; 11/9, 384 388 Karetová, D., Bultas, J.: Rezistence na aspirin laboratorní odchylka nebo klinický problém. Medicina pro praxi 2/2005, viz www.solen.cz Kvasnička, J.: Trombofilie a trombotické stavy v klinické praxi. Grada, Praha 2003 Malý, J. a spol.: Protidestičková léčba. Vnitřní lékařství 2005;51(7&8), 826-832 Matýšková, M. a spol.: Hematologie pro zdravotní laboranty II. díl, Krevní sráţení. Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, Brno 1999, ISBN 80 7013 278-7 Osmančík, P., Paulů, P., Toušek, P. a spol.: Měření aktivity trombocytů a účinnosti antiagregační léčby. Cor Vasa 2010; 52(Suppl 1) Pecka, M.: Laboratorní hematologie v přehledu, Fyziologie a patofyziologie hemostázy, Finidr, Český Těšín, 2004, ISBN 80 86682 03 X 38

Pecka, M., Malý, J.: Metabolické a aktivační děje v krevních destičkách a moţnosti jejich inhibice. Vnitřní lékařství 2009; 55(3) : 263 266 Pecka, M. a spol.: Praktická hematologie. Laboratorní metody, Finidr, Český Těšín, 2010, ISBN 978 80 903871 9 5 Penka, M., Gumulec, J.: Principy antitrombotické léčby. Kardiologická revue 4/2004 Ševčíková, H. a spol.: Rezistence na protidestičkovou terapii v kardiologické praxi. Interv Akut kardiol 2006; 5: 256 258 Špác, J., Hlinomaz, O.: Moţnosti dlouhodobé antiagregační léčby na počátku 21. století. Kardiologická revue 2006; 4(1) Špác, J.: Současná antiagregační terapie v praxi. Interní med. 2008; 10(2): 69 73 Zvarová, M.: Antiagregační terapie. Kardiologické fórum 1/2003 Internetové zdroje www.biodatacorp.com www.multiplate.net www.immunotech.cz http://www.medical.siemens.com http://www.accumetrics.com/products/ 39

Použité zkratky AA kyselina arachidonová AAI arachidonic acid impedance ADP adenosin difosfát ADP HS adenosin diphosphate high sensitivity ADPI adenosin diphosphate impedance AGSP agregace spontánní Anopyrin ARG aminokyselina arginin ASA kyselina acetylsalicylová ASP aminokyselina aspartát ASPI kyselina arachidonová pro impedanční agregaci ATP adenosin trifosfát camp cyklický adenosin monofosfát cgmp cyklický guanosin monofosfát CD povrchový znak buňky CD nomeklatura COX 1 cyklooxygenáza 1 COX 2 cyklooxygenáza 2 CYP cytochrom P450 DIC diseminovaná intravaskulární koagulace K3EDTA chelatonát trojdraselný ELISA enzymimunoanalýza FV faktor V FXa aktivovaný faktor X GP glykoproteiny GLY aminokyselina glycin IKEM Institut klinické a experimentální medicíny IPP inhibitory protonové pumpy MPV střední objem trombocytů PCT destičkový hematokrit PDW distribuční šíře trombocytů PGG 2 prostaglandin G 2 PGH 2 prostaglandin H 2 40

PGI 2 prostacyklin I 2 PPP plasma chudá na destičky PRP plasma bohatá na destičky RGD tripeptidová sekvence arginin glycin aspartát SOP standardní operační postup TRAP peptid aktivující trombinový receptor TXA 2 tromboxan A 2 VCS volume conductivity scatter vwf von Willebrandův faktor 41

Seznam obrázků, tabulek Obrázky Obrázek 1 : Acetylace serinového rezidua COX - 1 Obrázek 2 : Bioaktivace clopidogrelu izoenzymy CYP Obrázek 3 : Princip optické agregace Obrázek 4 : Příklad agregační křivky Obrázek 5 : Princip impedanční agregace Obrázek 6 : Hodnocení agregační křivky Tabulky Tabulka 1 : Výsledky měření 42