SELEKCE
Typy selekce Positive Balancing Background
Positive selection neutral positive Výhodná varianta Rychlé šíření Společný předek nedávno selective sweep
Selective sweep, hitchhiking
Detekce selekce Korelace s prostředím, kliny, problematické, hlavně extrémní případy Proporce funkčních změn (HKA, Ka/Ks - McDonald-Kreitman test) Srovnání rozdílů populací, F ST, srovnání s neutrálními markery Snížená diverzita (Tajima s D a jiné testy) Haplotypové bloky a vazebná nerovnováha
Kandidátní geny korelace prostředí x fenotyp x genotyp
pytlouš Chaetodipus intermedius Hoekstra, Nachman et al. Tmavé a světlé zbarvení Odpovídá barvě prostředí (tmavé zbarvení na lávě)
Arizona Korelace zbarvení s prostředím i na malé škále mtdna nekoreluje se zbarvením Sekvenování kandidátních genů (známých z inbredních myší) melanocortin-1 receptor MC1R Záměna 4 aminokyselin Jednoduchá dědičnost alel a zbarvení Nové Mexiko Jiné mutace Nekorelují se zbarvením jiné geny Rapidní konvergentní evoluce
Peromyscus polionotus Mc1r a Agouti Steiner et al. 2007, 2009 Agouti zásadní i změna exprese Jen u části světlých populací U pobřeží Atlantiku jiné mechanismy Interakce Mc1r a Agouti
MC1R u člověka, mamuta, jeskynních teter a dalších U člověka zrzavé vlasy a neschopnost se opálit Zbarvení krav, koňů a psů Výskyt dvou odlišných variant u mamutů
Storz et al. 2007 Peromyscus maniculatus α-globin a nadmořská výška
Koljušky Eda lokus and lateral plates U sladkovodních opakované vytažení jedné alely a rozšíření pomocí selective sweep
Koljušky Chan et al. 2010 Redukce pánve a exprese PitX1 asi nezávislé delece v regulační oblasti
Tetra Astyanax mexicanus Oca2 Albinismus Různé delece i regulace exprese konvergence
Srovnání ortologních genů myši a potkana Ka/Ks Poměr nesynonymních (Ka) a synonymních (Ks) mutací Alignment sekvencí stejného genu u více druhů rozdíly (mutace) jen některé mutace změní aminokyselinu Korekce (rozdílné metody, MEGA, PAML) jen 25 % možných záměn nezmění aminokyselinu některé typy mutací častější zpětné a konvergentní mutace (hlavně u více odlišných sekvencí) Většinou Ka/Ks << 1, selekce eliminuje změny, purifying selection protein se nemění Ka/Ks >> 1 positive selection, MHC, reprodukční proteiny Různé části proteinu mohou být pod různou selekcí (ABS u MHC)
Reprodukční proteiny Skladování a využití gamet po kopulaci Kontakt gamet Fertilizace Často rapidní adaptivní evoluce (nejrychlejší hned po MHC)
SEMG2 u primátů Dorus et al. 2004 Semenogelin, kovalentní vazba koagulace, rozštípání proteasou kallikrein 3 uvolnění spermií ze sraženiny ω = d N /d S Koreluje s počtem sexuálních partnerů, velikostí testes, mírou koagulace
MHC = main histocompatibility complex Komplex genů (transmembránových receptorů) odpovědných za aktivaci adaptivní složky imunitního sytému. ENDOGENNÍ ANTIGENY Oblast rozeznávající antigen EXOGENNÍ ANTIGENY VŠECHNY JADERNÉ BUŇKY ANTIGEN PRESENTUJÍCÍ BUŇKY Třída I Třída II = dendritické buňky, makrofágy, B-lymfocyty..
Maintenance of allelic polymorphism natural selection? Disease based mechanisms (host-parasite interactions) overdominance hypothesis (=heterozygote advantage) heterozygotes resist a broader array of pathogens than homozygotes negative frequency dependent selection hypothesis (=rare allele advantage) cycling of fitness values of different genotypes in both hosts and pathogens Reproductive mechanisms (sexual selection) může být i jen jako vyvarování se inbreedingu
Identification of MHC alleles often duplicated and highly heterozygous direct sequencing of PCR products is not possible 1. PCR of a MHC fragment 2. cloning into the vector 3. sequencing of a number of clones 4. Screening - SSCP
SSCP: single stranded conformational polymorphism Allele 1 FAM... CGCTTCAGG...... GCGAAGTCC...HEX Allele 2 FAM... CGCTTAAGG...... GCGAATTCC...HEX
SSCP: single stranded conformational polymorphism
Alternativa NGS Přesná detekce Odhalení více (i vzácných) alel
Promerová et al. 2011
Gallinago media bekasina větší Ekblom et al. 2004 Druhý exon classiib genes nejpolymorfnější část proteinu odpovědného za vazbu antigenu Separace alel sekvenování 119 jedinců, 27 alel U jedince až tři různé alely recentní duplikace genu nepreferují s odlišným MHC ani počet alel nebo heterozygotnost nerozhoduje s určitými alelami MHC častěji spárovaní
Gasterosteus aculeatus Milinski et al. Recentně duplikované MHC (class IIB genes) Většina jedinců má průměrný počet alel Jedinci s průměrným počtem alel nejméně parazitování preferují tak, aby optimalizovali počet alel, spočítají vlastní alely a dle vlastního počtu volí optimálního
Limitace kandidátních genů Hit or miss Regulace exprese Epistáze Vliv více genů
Další přístupy QTL (vhodné spíše pro laboratorní chovy) Celogenomové analýzy Transkripce Proteiny
(Skoro) celé genomy SNPs Vybraná místa v genomu, kde je variabilita Záměny v jednom nukleotidu Ascertainment bias (zkreslení, výběr na základě variability omezeného vzorku) Člověk: milióny SNPs z různých populací ve veřejných databázích (HapMap 3 milióny, Perlegen 1.6 miliónu)
Kompletní sekvence genomů Zatím většinou jeden genom na druh mezidruhová srovnání pomocí dn/ds Člověk the 1000 genome project
Detekce selekce u (celo)genomových dat Sliding window Problém s průkazností Populačně genetický model a simulace (nutno znát demografickou historii!) Empirická distribuce Odchylky od genomového půměru druhy s vysokým Ne větší prostor pro selekci Drosophila značná část genomu pod selekcí
Detekce selekce (ze sekvencí) Různé metody různé výsledky Artefakty metod (různá kvalita dat) Ascertainment bias (platí u SNPs, vybrány markery polymorfní v jedné populaci jinde může být jiná situace) Různá škála (dávná či nedávná minulost)
Mezidruhová srovnání Phylogenetic shadowing srovnání divergence daného úseku s divergencí v průměru puryfying selection menší divergence dn/ds (Ka/Ks) specielní případ: mezidruhová divergence versus vnitrodruhový polymorfismus testy: MK (jeden gen) a HKA (více genů) Silná selekce v dávné minulosti, před miliónem let a více nesynonymní synonymní
FOXP2 Enard et al. 2002 Schopnost artikulovat Nesynonymní versus synonymní mutace
Srovnání 6ti savčích genomů Kosiol et al. 2008
Eusocialita u včel a příbuzných (Woodard et al. 2011) Pyrosekvenování transkriptomů Geny se zrychlenou evolucí
Populační data Změna spektra mutací frekvence vzácných alel, Tajima s D, positive versus balancing selection testů je spousta, např. Fu and Li s F, Fay and Wu s H před 200 tisíci lety a méně
Tajima s D Positive více vzácných alel Balancing více středně četných
1 segregující místo párová srovnání: 4x rozdíl, 2x shoda 1 segregující místo párová srovnání: 3x rozdíl, 3x shoda
Tajima s D Srovnání hodnot dvou odhadů genetické diverzity, θw a π π - nukleotidová diverzita, vychází z párových srovnání Θw - vychází z počtu segregujících míst Test založený na statistice D = (π - θw)/var(d) Pro neutrální sekvence: θw = π. D = 0. Při nadbytku vzácných alel θw > π. D < 0. (pozitivní selekce či populační expanze) Při nadbytku středně četných alel π > θw. D > 0. (balancing selekce či bottleneck)
Chápani a malpy Geny pro barevné vidění L-M opsiny Balancing selection
CLSPN
Populační data Selective sweep Lokální redukce variability
Lokus 3 prodělal selective sweep
Díky vazbě (LD) lze sledovat selekci i pomocí markerů (např. mikrosatelitové lokusy) v blízkosti selektovaného genu Lokálně selektované varianty (stopy lokální adaptace) vykazují větší rozdíly mezi populacemi Využití F ST
Srovnání s neutrálními markery F ST outliers Salmo salar (Landry & Bernatchez 2001) Mikrosatelity a MHC (class IIB gene) Vyšší párové F ST pro MHC
(Celo)genomová data Diferenciace populací, F ST selekce vyšší F ST outliers (empirický odhad) před 80 tisíci lety a méně
LD (bloky) Populační data Vazebná nerovnováha (haplotypové bloky) méně než 30 000 let
Admixture mapping Populační data Admixture mapping výhodné oblasti překonávají snadněji hranice populací Portoričané často africké HLA (MHC) méně než 500 let Africký, evropský, americký původ
Příklady positivní selekce (Vitti et al. 2012)
C21orf34 Pickrell et al. 2009 Putative uncharacterized protein
Exprese Sledování jednotlivých genů Celogenomové metody (celý transkriptom) Microarrays 454 a jiné next generation techniky Nutnost izolace RNA často problém Přepis na stabilnější cdna
Real-time PCR Kvantifikace DNA při amplifikaci Většinou srovnání s jiným genem I pro parazitémie či koncentrace templátů
Sledování exprese genů microarrays Sledování exprese mnoha (tisíce) genů najednou Založeno na hybridizaci Sleduje se rozdíl vůči kontrole
oligo x cdna microarrays Oligo microarrays Syntetizované proby, lepší výsledky, jen u organismů se známým genomem cdna microarrays využití ESTs (mrna je přepsána zpět na DNA) EST = expressed sequence tags osekvenovaná část cdna, jasně označí o jaký gen se jedná (review Bouck & Vision 2007, Mol. Ecol.)
Populus trichocarpa x deltoides a Malacosoma disstria bourovec Ralph et al. 2006 cdna microarray 15496 genů > ¾ genomu Po 24 hodinách 1191 genů up-regulated 537 down-regulated Obrana: endochitinázy, inhibitory proteáz Signální funkce Transport, metabolismus, regulace transkripce
svaly Kontrakce svalů Syntéza proteinů játra Energetický metobolismus Coregonus
Nástup sekvenačních technik Next generation sequencing Sekvenování celých transkriptomů Zjištění exprese i mutací najednou Lze dobře i u nemodelových organismů
Transkriptom štěnice Bai et al. 2011 Rezistence k insekticidům potvrzení přes Real Time PCR Wolbachia
Studium proteinů
Proteiny Chromatografie Elektroforézy Hmotnostní spektrometrie Protilátky MALDI
Coregonus lavaretus a salinita Papakostas et al. 2012 Ryby z různých salinit množeny za různých podmínek Identifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie