volba separace pro následnou MS kvantifikaci proteinů Jan Havliš Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta, Brno Ústav experimentální biologie : Oddělení funkční genomiky a proteomiky :: Centrální laboratoř :::

obsah přednášky : kvalitní MS data kvantifikace proteinů/peptidů pomocí MS separace proteinů/peptidů idů : jaká separace? :: úroveň :: technika 2

hmotnostně spektrometrické stanovení proteinů/peptidů nepřímé stanovení pomocí izotopového značení :potřebujeme ř stanovitpoměr ě intenzit/ploch i signáluobou verzí peptidu (lehká/těžká značka) :: AQUA syntetické značené peptidy :: 18 O jednoduchá vnitřní značka :: itraq multibarická i vnější značka přímé stanovení íb bez izotopovéhoznačení značení č :potřebujeme stanovit poměrintenzit/ploch signálu dvou stavů téhož peptidu : potřebujeme spočítat identifikované peptidy pp yp příslušející jednomu proteinu 3

nejčastější kvantifikace proteinů :tryptické peptidy pro pars pro toto kvantifikaci proteinu :: izotopolog jako vnitřní standard důležité vlastnosti kvantifikačních peptidů :C koncový arginin : žádné reaktivní AK : žádná neúplná štěpení : intenzivní a reprodukovatelný signál v MS stafylokokální enterotoxin H (cca 29 kda), RPLC ESI ESI IT IT MS přehled ř kandidátských ký tryptických ikýh peptidů pro vnitřní ř standard d :většina nepoužitelných neúplné štěpení, slabý MS signál 4

hledáme jehlu v kupce sena :složitá směspeptidů :: hledání dvou peptidů lišících í se v m/z :: hledání jednoho peptidu (přímá kvantifikace) prekvantitativní separace :citlivost ili de facto prekoncentrace : selektivita izolace ze složité směsi proteinů směs proteinů :dělíme nejprve proteiny :: potom trypticky štěpíme apak dělíme tryptické peptidy :dělíme až směstryptických peptidů 5

separace proteinů/peptidů pro MS stanovení peptidů/proteinů nepřímé stanovení :potřebujeme stanovit poměrsignálů dvou izotopologů téhož peptidu přímé stanovení :potřebujeme stanovit poměrsignálů dvou stavů téhož peptidu :potřebujeme spočítat identifikované peptidy příslušející jednomu proteinu nutnost oddělení informace o ploše či intenzitě signálu peptidu od ostatních :izotopový vzor! separace :oddělení individuí optimální, ale náročné frakcionace :oddělení skupin individuí vhodné a relativné snadné 6

separační vlastnosti aminokyselin/peptidů multifunkční struktura aminokyselin/peptidů : C konec konec; kyselý kladný náboj/polární :N konec konec; zásaditý záporný náboj/polární :boční řetězec široký rozsah vlastností alifatické velmi malé malé faktory ovlivňující separaci :ph :polarita prostředí :iontová síla : kompatibilita s MS kapalinová chromatografie elektromigrační metody hmotnostní spektrometrie aromatické nepolární kladně nabité nabité polární 7

kapacita separace (peak capacity) schopnost separovat :počet dobře rozlišených (R 1.5)píků (n)po dobu separace (t R0 až t Rmax ) : význam pro následné MS efektivnější měření spekter (střída analyzátoru) :: optimálně má každý peptid své okno (odhledě od efektů při ionizaci) 78 píků w šířka píku přizákladně j počet píku v separaci (za čas t Rmax Rmax ) 64 píků maximalizace kapacity separace :delší čas separace (v jednom rozměru) : spojováním více rozměrůči technik (hyphenation hyphenation) 8

hmotnostní spektrometrie separace vanalyzátoru hmotnostního spektrometru :speciální způsob separace : vyžaduje konkrétní typy analyzátorů :: iontový selektor (SIM, SRM, MRM) ::: kvadrupól (Q, QqQ), past (IT, FTICR, OT) zásadní nedostatky : nehomogenní účinnost ionizace (potlačování ionizace) : kapacita pasti (nedostačuje komplexitě vzorku) : ko ko eluce eluce selekce iontů s podobným m/z 9

iontově výměnná výměnná chromatografie kapalinová chromatografie malý specifický náboj molekuly :na rozdíl od anorganických iontů :CaN konce a pětnabitých AK :: třikladně, kladně,dvě dvě záporně využití první rozměr2d LC LC MS : odsolení vdruhém rozměru SCX připh ph 3 chromatografie na obrácené fázi peptidy :převážně slabě polární až nepolární iontově párovací mód (TFA, FA, AFA) využití druhý rozměr 2D LC LC MS : vysoké rozlišení, na monolitu rychlé :kompatibilní rozpouštědlově sms IP RPLC připh ph 3nebo ph 10 10

chromatografie s hydrofilními interakcemi využití první rozměr 2D LC LC MS :polární separace s vysokým obsahem organiky molekulová vylučovací chromatografie využití první rozměr2d LC LC MS :nepříliš vhodná pro LC MS složení MF organická MF analyt voda SF částice nosiče SF afinitní chromatografie :chirální separace cyklodextriny cyklodextriny, makrocyklická kli ká antibiotika tik : IMAC/MOAC fosfopeptidy 11

vícerozměrná kapalinová chromatografie kompatibilita : rozpouštědlová :průtoková : přímá (in in line line) přímý vstup do 2D z 1D :: smyčky (průtočné, vypařovací), záchytové kolony :nepřímá (off off line line) ) dávkování sesbíraných frakcí komplementarita rozměrů (orthogonality orthogonality) [s] [] SCX příklady praktického využití :IP IP RP RP(b) (b) IP IP RP RP(a (a) MS :SCX SCX RP RP MS : HILIC IP IP RP RP MS RPLC [min] 12

tryptická směsfosforylázy B IP RPLC C18 ph = 2.6 IP RPLC PFP ph = 3.25 retenční čas [min] IP RPLC C18 ph = 10.0 retenční čas [min] SEC retenční čas [min] retenční čas [min] HILIC SCX retenční čas [min] retenční čas [min] 13

elektromigrace gelová elektroforéza kvalitní, ale omezená separace (M W, pi) :extrémy pi am W využití :nepřímé spojení GE MS :přímé spojení :: kolonová kl áge (CEGE) problémy se zpracováním gelu kapilární zónová elektroforéza adsorpce na stěny separačního kanálu : řešení CGE (fyz fyz.ichem chem.gely) malá kapacita, nástřik cca 20 nl využití první rozměr spojených technik : nutný kapalinový spoj před MS : nebo záchytová kolona 14

izoelektrická fokusace mimo gel (LP IEF IEF; liquid id phase IEF) separační cely napětí elektroda : peptidově/proteinově specifické :spíše frakcionace než separace :artefakty vms (amfolyty?) y gelový proužek s amfolyty ph gradient cely prostorově pokrývají různá pi využití :nepřímé spojení sms proteiny s různým pi skončí v různých celách kapilární elektrochromatografie : vysoká kapacita separace a vyšší rozlišení (oproti RP) :větší nástřik átřik (oproti ticze) : technicky náročné (kolony) 15

spojené separační techniky techniky (hyphenated techniques) kompatibilita :principiální i iál : zvláštní rozhraní : rozpouštědlová :: např. kapalinový spoj komplementarita rozměrů (orthogonality orthogonality) SEC CZE LP IEF IEF SCX SCX RPLC RPLC MS :: frakcionace (20 frakcí) :: frakcionace (7 frakcí z každé LP IEF frakce) :: separace (každé SCX frakce) 16

predikce separačních vlastností na základě sekvence komplexnost vzorku, nízká íká množství proteinu, ionizace i najdeme náš peptid? retenční/migrační čas (t R /t m ) :závisí na chemickém složení;ak sekvenci známe li sekvenci, odhadneme retenční čas :větší pravděpodobnost nalezení kvantifikačního peptidu jak t R /t m odhadneme? : numerické modelování (hard modelling) : poloaproximační modelování (semi semi hard modelling) :: SSRCalc, LCMSWARP, ScoreRidge, SVR :aproximační modelování (soft modelling) :: umělé neuronové sítě (ANN) 17

molekulové deskriptory : délka peptidu, počet AK :molekulová hmotnost (M W ) :hydrofobicita (HydroMCalc HydroMCalc) :hydrofobní moment (µh; HyperChem) :logaritmus teoreticky vypočítaného rozdělovacího koeficientu n oktanol oktanol/voda (logp logp; Molinspiration) :van der Waalsůvobjem (VvdW VvdW) : objem molekuly dostupný rozpouštědlu (VSA) optimální deskriptory a ANN (chyba předpovědi p 12 %) : struktura sítě 27 3 1 : aminokyselinové složení :délka peptidu :logp : hydrofobicita : zadání 1.AK zn ac konce (rozdělení do 7 skupin) 18

nějaký jednoznačný závěr? spíše ne : unikátnost jednotlivých směsí proteinů/peptidů :: unikátnost separačních řešení nic obecného : rady, kterými neprohloupíme :: jednodušší směsi (desítky proteinů) ::: separujme až tryptické peptidy :: složité směsi (desítky až tisíce proteinů) ::: proteinová frakcionace původní směsi (IP RPLC RPLC, SEC, HILIC) apak separace tryptických peptidů frakce (IP RPLC) ::: 1Dtryptických peptidů původní směsi (HILIC, IP RPLC RPLC(b) (b), SCX) apak komplementární 2D(IP (IP RPLC RPLC(a) (a)) :: přednost mezi MS mají analyzátory QqQ, FTICR aot sesi 19

20

děkuji za pozornost finanční podpora GA ČR MŠMT GA203 203/09 09/0148 0148 MSM0021622413 0021622413, MSM0021622415 21