Biochemie 23.10.2017 Aminokyseliny, peptidy, bílkoviny Luboš Paznocht
Osnova Aminokyseliny: chemická podstata, proteinogenní AMK, rozdělení, esencialita Peptidy: vznik peptidické vazby Bílkoviny: funkce, struktura, rozdělení, denaturace, hydrolýza, trávení využití a metabolické přeměny získaných AMK amfoterní charakter, pufrační schopnosti, izoelektrický bod Detoxikace amoniaku
Substituční deriváty karboxylových kyselin (nahrazení vodíku (-H) aminoskupinou (- NH 2 ) AMK zákl. stavební jednotky peptidů, bílkovin 20 základních L-α-AMK Velíšek a Hajšlová 22 proteinogenních AMK -> selenocystein ->pyrrolysin
α uhlík 1. uhlík od karboxylového konce AMK (-COOH) dále také β, γ, δ, ε α β α-alanin β-alanin
D x L (zrcadlový obraz) izomery (antipody) α uhlík AMK -> chirální uhlík *-> optická aktivita (polarizované světlo, otáčení, viz sacharidy) výjimka Gly glycin
obecný vzorec α-amk α R CH COOH NH 2
Dělení AMK dle R- nepolární (hydrofobní) Val, Met, Phe, Tyr, Pro, Ile, Leu (dlouhý C řetězec) amfifilní (obojetné) Gly, Ala, Trp polární (hydrofilní) Thr, Ser, Cys (Scy), Glu, Gln, Asp, Asn (polární funkční sk. na R-)
dělení hydrofilních (polárních) dle iontové formy neutrální (většina AMK) kyselé (negativní) Asp, Glu zásadité (pozitivní) Lys (Pyl), His, Arg
Esencialita Esenciální (nepostradatelné) Met, Leu, Lys, Phe, Thr, Trp, Ile, Val Semiesenciální Arg, His -> Velíšek, Hajšlová - Arg, Cys, Tyr -> Havlík, Marounek Neesenciální (postradatelné) všechny zbylé
Vznik peptidů, peptidická vazba replikace DNA, transkripce, oligo-(2-10 AMK j.), poly-(<100 AMK j.) peptidická vazba amidická vazba (amid AMK, která poskytuje COOH) vždy pouze -NH 2 a -COOH sk. z obecného vzorce H H N H H N H 2 O H 2 O glutamová glutamyl k. methionyl methionin asparagin
Názvosloví peptidů název AMK poskytující do peptidické vazby COOH + -yl (tj. tzv. N-terminální AMK) + celý název tzv. C-terminální AMK (-COOH zůstává zachován) H leucyl leucin serin
Významné oligopeptidy: Glutathion - GSH tripeptid γ-glu-cys-gly kofaktor ox-red. reakcí (přenos H + ) prostředek detoxikace Glutamová k. Cystein Glycin α β γ
Významné oligopeptidy: Oxytocin, vasopresin oxytocin: stahy hladké svaloviny dělohy, spouští laktaci vasopresin = antidiuretický hormon, snižuje diurézu (produkce moči) vasopresin oxytocin
Významné oligopeptidy: Amanitin, faloidin obsahují i D-AMK cyklické, toxicky působící amanitin faloidin
Bílkoviny (>100 AMK j.) Funkce bílkovin Stavební, strukturní -> kolagen, elastin, keratin Mechanicko-chemické (pohybové)-> aktin, myosin Katalytické, regulační -> enzymy, hormony Obranné -> imunoglobuliny, fibrin Transportní --krví -> hemoglobin, transferin - přes buněčné membrány Zásobní -> ferritin Výživové -> esenciální aminokyseliny Pufrační schopnost
Struktura bílkovin Primární (pevná kovalentní vazba, hydrolyticky štěpitelná) Sekundární (vodíkové můstky) Terciární (vodíkové můstky, van der Waalsovy síly, disulfidické můstky) Kvarterní (van der Waalsovy síly, hydrofobní interakce)
Primární struktura sekvence aminokyselin v řetězci (kódováno DNA)
Sekundární struktura V důsledku vzniku intra- (resp. intermolekulárních) vodíkových můstků (otáčivost na α uhlíku) α-helix β-struktura (skládaný list) 1 vlákno N C 2 vlákna N C PARALELNÍ C N ANTIPARALELNÍ
Terciární struktura prostorové uspořádání peptidického řetězce tvořena interakcemi mezi postranními zbytky AMK (-R) typ a umístění vazeb je v podstatě záležitostí primární struktury
Typy interakcí v rámci terciární struktury vodíkové můstky: Ser, Gln, His, Tyr nepolární (hydrofobní) interakce: Phe iontové vazby: kyselé a bazické fční. sk. postranních řetězců -COOH - NH 2 disulfidický můstek pouze v přítomnosti 2 molekul cysteinu (dehydrogenace)
Terciární struktura Fibrilární nerozpustné ve vodě pružné chemicky odolné př.: kolagen, keratin, elastin, fibrin (podpůrné tkáně) Globulární dobrá rozpustnost ve vodě, kys., zás. snadno podléhají denaturaci (ph, t) regulační fce (hormony, enzymy) př.: hemoglobin
Střídání spirálovitě stočených a rovných úseků Rovný úsek přítomnost prolinu či hydroxyprolinu v řetězci (sekundární aminová sk.) není možná otáčivost rigidita
Kvarterní struktura Uspořádání podjednotek terciární struktury Fe? Mg? Co? myoglobin hemoglobin Fe 2+ nebo Fe 3+? chlorofyl kobalamin = B 12
Rozdělení bílkovin JEDNODUCHÉ (proteiny, holoproteiny) pouze proteinový řetězec GLOBULÁRNÍ FIBRILÁRNÍ histony keratiny albuminy kolagen globuliny elastiny fibrinogen prolaminy gluteliny SLOŽENÉ (heteroproteiny) bílkovina + prostetická sk. FOSFOproteiny GLYKOproteiny NUKLEOproteiny CHROMOproteiny METALOproteiny LIPOproteiny
Jednoduché globulární bílkoviny charakteristika: oblý tvar molekul velmi dobrá rozpustnost ve vodě labilní vůči vnějším vlivům (ph, teplota,..) oproti fibrilárním jsou flexibilnější různé konformační změny DENATURACE aktivní transport b. membránami allosteriká modifikace enzymů
Jednoduché globulární: Histony nevyskytují se volně ve formě komplexů s nukleovými kyselinami různé složení bílkovin, různé NK dále viz nukleoproteiny
Jednoduché globulární: Albuminy Sérový Svalový Mléčný (laktalbumin) Vaječný (ovalbumin) Globin (součást myoglobinu, hemoglobinu)
Jednoduché globulární: Globuliny Sérový Mléčný (laktoglobulin) Svalové (myoglobulin)
Jednoduché globulární: Fibrinogen Fibrin (fibrilární) Srážení krve Přeměna fibrinogenu na fibrin
Jednoduché globulární: Prolaminy a gluteliny PROLAMINY př.: zein (kukuřice) gliadin (pšenice) GLUTELINY př.: oryzenin (rýže) glutein (pšenice) Gluten (lepek)
Jednoduché fibrilární bílkoviny Charakteristika: vláknitý charakter (rigidní) ve vodě nerozpustné pružné relativně vysoce chemicky odolné podpůrné tkáně
Jednoduché fibrilární: Keratin vysoký obsah cystinu vysoká odolnost vůči proteolytickým enzymům vlasy nehty chlupy rohy kopyta šupiny peří +
Jednoduché fibrilární: Kolagen cca ⅓ bílkovin těla vysoký obsah glycinu (přes 30 %) neobvyklé AMK prolinu (cca 25 %) nutričně neplnohodnotná bílk. trojitá šroubovice hydroxyprolin hydroxylysin kůže chrupavky kosti šlachy vazy
Jednoduché fibrilární: Elastin chemicky velmi odolná bílkovina obsažen v tkáních s vysokým mechanickým zatížením složení: převaha nepolárních AMK Gly + Ala + Val + Leu + Ile = 80 % vazy šlachy stěny cév stěny bronchů
Složené: Fosfoproteiny k. fosforečná vázaná esterickou vazbou na -OH (serinu, threoninu) KASEIN mléčná bílkovina srážení chymosinem (rennin) v žaludku sladké srážení chymosin kyselé srážení ph (izoelektrický bod) vs.
Složené: Glykoproteiny vazba cukerného zbytku (1 i více) na bílkovinný skelet dle AMK na kterou je sacharid vázán funkce antigeny stavební složky hormonů muciny krevní skupiny (A, B, 0) bakteriální murein thyreotropní h. (TSH) folikulostimulační h. (FSH) luteinisační h. (LH) sacharidová část: k. hyaluronová, chondroitinsírová tvoří vazké roztoky, součást sekretů
Složené: Nukleoproteiny Histony nukleové kyseliny ve tkáních ve formě komplexů s proteiny výstavba a tvarové změny chromatinu
Složené: Chromoproteiny jednoduchá bílkovina + chromofor (obsahující kov) Fe 2+ : hemoglobin, myoglobin Cu 2+ : hemocyanin, hemokuprein
Složené: Metaloproteiny transport a uskladnění kovů (Fe, Cu, Zn) transferin, ferritin, ceruloplasmin některé enzymy: urikasa (Zn), ardinasa (Mn), enolasa (Mg) transferrin Fe z TT ferritin uložení v játrech
Složené: Lipoproteiny komplexy lipidů s proteiny rozpustnost lipidů ve vodě (krevní plasmě) chylomikrony transport lipidů krevním řečištěm LDL low density lipoprotein HDL high density lipoprotein dle poměru lipid : protein
Denaturace = různý stupeň rozrušení kvartérní, terciární a sekundární struktury ztráta biologické funkce porušení meziřetězcových vazeb (vodíkové a disulfidické můstky, iontové a hydrofobní vazby) vlivem vysoké teploty, působení chemických látek
najdi rozdíl Dusitan sodný aneb (NaNO 2, E250) kouzla potravinářského průmyslu oxidace Fe 2+ na Fe 3+ methmyoglobin (hnědá, šedá barva) myoglobin hemoglobin myoglobin + NO 2 - nitroxymyoglobin nitroxyhemochrom 1+1 4+4
oxidace vs. oxygenace Oxidace změna oxidačního čísla (centrálního) iontu Oxygenace navázání kyslíku bez změny ox. č.
Hydrolýza rozrušení všech úrovní struktury bílkoviny štěpení peptidických vazeb kyselá, zásaditá, enzymatická Hydrolyzáty aneb kouzlíme dál sojový hydrolyzát bílkovinný hydrolyzát kvasničný extrakt atp. - H 2 O + H 2 O
Trávení bílkovin jediná savci a ptáky přijímaná forma N počátek v žaludku částečná denaturace vlivem HCl polypeptidové štěpy pepsin (ph 1-2) natrávení tzv. peptony obtížně elastin, keratin se pepsinem neštěpí pokračuje v duodenu pankreatické peptidasy slabě alkalické ph (využitelná) endo- (př.: trypsin, chymotrypsin) exo- (př.: karboxypeptidasa) od C-terminálního konce bílkovinného štěpu
rozštěpení až na jednotlivé aminokyseliny vstřebávání L-AMK aktivním transportem (spotřeba ATP) bílkovinné přenašeče buněčných membrán buněk střevního epithelu D-AMK (mléko a ml. výrobky vstřebávání prostou difusí mikrobiální aktivita v bachoru)
Využití a metabolické přeměny aminokyselin získané AMK (resorbované) syntéza nových bílkovin syntéza specifických látek (hormony, apod.) přeměny transaminace ox. deaminace, red. aminace dekarboxylace přeměna postranního řetězce
Transaminace Přenos aminoskupiny (-NH 2 ) z AMK na oxokyselinu transaminasy (aminotransferasy) nová ketokyselina nová aminokyselina L-alanin α-ketoglutarová k. pyrohroznová k. L-glutamová k.
Aerobní (oxidační) deaminace oxidasy L-aminokyselin, glutamát dehydrogenasa + NAD + vznik oxokyselin detoxikace NH 3 v ornitinovém cyklu, vznik močoviny R CH COOH - 2H R C COOH H 2 O OH R CH COOH O R CH COOH NH 2 aminokyselina NH NH 2 NH 3 dehydrogenace hydratace deaminace oxokyselina
Redukční aminace glutamát dehydrogenasa + NAD + O oxokyselina HOOC C (CH 2 ) 2 COOH + NH 3 využití NH 3 jako zdroje dusíku pro syntézu aminokyselin glutamát = zdroj -NH 2 pro syntézu dalších AMK aminace OH H 2 O NADH + H + NAD + aminokyselina HOOC C (CH 2 ) 2 COOH HOOC C (CH 2 ) 2 COOH HOOC CH (CH 2 ) 2 COOH NH 2 dehydratace NH hydrogenace NH 2
Dekarboxylace odštěpení CO 2, vznik primárních aminů CO 2 serin 2-aminoethanol kolamin CO 2 lysin kadaverin
Přeměna uhlíkaté kostry aminokyselin Po oddělení -NH 2 skupiny vzniká následným odbouráváním: meziprodukt Krebsova cyklu acetoacetyl-coa meziprodukt Krebsova cyklu, acetyl-coa další štěpení, popřípadě vznik glukosy (glykogenu) Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Glu, Asp, Asn vznik ketolátek v organismu Leu, Ile, Lys, Trp z jedné části řetězce meziprodukt KC z druhé části acetyl-coa
Pufry pufry, tlumivý roztok, ústoj roztok slabá kyselina + její sůl se silnou zásadou roztok silná kyselina + její sůl se slabou zásadou slabá k. nepatrná disociace (pk A ) sůl (téměř) úplná disociace CH 3 COOH CH 3 COO - + H + CH 3 COONa CH 3 COO - + Na +
Jak to funguje? přídavek silné kyseliny CH + H + + Cl - 3 COOH + CH 3 COO - + Na + 2 CH 3 COOH + Na + + Cl - přidané H + + acetátový aniont -> kyselina; Na + + Cl - -> neutrální sůl; nepatrná změna ph přídavek silné zásady CH 3 COOH + CH 3 COO - + Na + + Na + + OH - 2 CH 3 COOH + 2 Na + + H 2 O ph pufru: pk A kyseliny, poměr koncentrace kyseliny [HA] a soli [OH - ]
Pufrační systémy organismu Hydrogenuhličitanový: NaHCO 3 + H 2 CO 3 Fosforečnanový: NaH 2 PO 4 + Na 2 HPO 4 Hemoglobinový: hemoglobin, oxyhemoglobin Bílkovinný
Hemoglobinový HHb Hb - + H + HHbO 2 HbO - 2 + H + při ph krve 7,4 hemoglobin a oxyhemoglobin kyseliny princip: disociace a asociace H + zprostředkovaná imidazolovými sk. histidinu
Bílkovinný (amfoterní charakter bílkovin) Bílk - + H + H-Bílk = obojetná povaha disociovatelné kyselé a zásadité sk. -COOH -NH 2 ph prostředí <7 (rel. přebytek H + ): disociace -NH 2 -NH + 3 slabá zásada (v el. poli ke katodě ) >7 (rel. nedostatek H + ): disociace -COOH -COO - slabá kyselina (v el. poli k anodě )
Izoelektrický bod aminokyselin Izoelektrický bod = ph kdy je daná AMK v roztoku přítomna ve formě amfiontu, tedy má nulový sumární náboj Relativně nejnižší rozpustnost ve vodě vysrážení Přidání kyseliny nebo zásady (posunem ph), zvýšení rozpustnosti AMK
Rozpustnost bílkovin ve vodě Faktory: velikost a tvar molekuly (globulární lépe než fibrilární) množství a charakter polárních (a tedy ionisovatelných) a nepolárních skupin ph roztoku (izoelektrický bod) koncentrace a povaha elektrolytů (rozpuštěných solí) v roztoku (vsolování a vysolování, solvatační obal)
Solvatační obal bílkovin obalení molekuly bílkoviny molekulami vody, δ + a δ - vysolení: odnětí solvatačního obalu bílkoviny přídavkem soli vyšší afinita solí k vodě ve srovnání s bílkovinou, př. (NH 4 ) 2 SO 4 vsolení: zvýšení rozpustnosti bílkoviny přídavkem soli Zlepšení vysolovacího účinu přídavkem méně polárního rozpouštědla: methanol, ethanol,
Koloidní vlastnosti bílkovinných roztoků
Stanovení isoelektrického bodu kaseinu
Detoxikace amoniaku NH 3 nemoc králů dna
Detoxikace amoniaku Krebsův-Henseleitův cyklus ( malý Krebsův cyklus ), ornitinový cyklus endergonní proces ( 1 cyklus ~ 3 ATP) v játrech přítomnost všech potřebných enzymů ost. orgány vazba amoniaku a glutamovou k. NH 3 ATP ADP + P H 2 O glutaminsyntetasa Glu NH 3 glutaminasa H 2 O Gln
Glu játra periferní oblast Gln + NH 3 Glu ornitinový cyklus (močovina) ledviny + NH 3 + H + + Cl - NH 4 Cl
NH 3 + CO 2 KARBAMOYLFOSFÁT + ORNITIN CITRULIN + ASPARTÁT ASPARTÁT ORNITIN ARGININ ARGININSUKCINÁT MOČOVINA OXALACETÁT MALÁT FUMARÁT
NH 3 + CO 2 + 2 ATP karbamoylfosfát O P O C NH 2 + 2 ADP + P + O + CH 2 (CH 2 ) 2 CH COOH NH 2 ornitin NH 2 H 2 N C NH 2 citrulin NH (CH 2 ) 3 CH COOH CH COOH aspartát NH 2 CH 2 COOH ASPARTÁT ORNITIN O močovina C H 2 N NH 2 H 2 N C NH arginin NH (CH 2 ) 3 CH COOH NH 2 H 2 N NH (CH 2 ) 3 CH COOH C NH 2 N argininsukcinát CH COOH + 2 P O = C COOH HO CH COOH CH COOH CH 2 COOH CH 2 COOH CH 2 COOH CH COOH oxalacetát malát fumarát
biotin NH 3 + CO 2 + 2 ATP MATRIX MITOCHONDRIE NH 3 aminace ASPARTÁT O = C COOH CH 2 COOH oxalacetát ORNITIN močovina H 2 N O karbamoylfosfát C O NH 2 P + 2 ADP + P + O + δ CH 2 (CH 2 ) 2 CH COOH NH 2 ornitin NH 2 O C dehydrogenace NADH + H + NAD + NH 2 H 2 N C NH HO CH COOH CH 2 COOH malát arginin NH (CH 2 ) 3 CH COOH hydratace H 2 O NH 2 CH COOH CH COOH fumarát H 2 N H 2 N H 3 PO 4 C NH 2 NH (CH 2 ) 3 CH COOH CH COOH aspartát CH 2 COOH C N citrulin NH 2 NH (CH 2 ) 3 CH COOH argininsukcinát CH COOH CH 2 COOH CYTOSOL ATP AMP + P P + NH 2 2 P
Děkuji za pozornost!
Napojení ornitinového cyklu na citrátový cyklus
NH 3 + CO 2 KARBAMOYLFOSFÁT + ORNITIN CITRULIN + ASPARTÁT ASPARTÁT ORNITIN ARGININ ARGININSUKCINÁT aminace MOČOVINA OXALACETÁT dehydrogenace MALÁT hydratace + H 2 O FUMARÁT NADH + H + NAD +
Laboratorní cvičení Stanovení izoelektrického bodu kaseinu koagulační metodou
Funkce bílkovin Stavební, strukturní -> kolagen, elastin, keratin Mechanicko-chemické (pohybové)-> aktin, myosin Katalytické, regulační -> enzymy, hormony Obranné -> imunoglobuliny, fibrin Transportní --krví -> hemoglobin, transferin - přes buněčné membrány Zásobní -> ferritin Výživové -> esenciální aminokyseliny Pufrační schopnost
Amfoterní charakter bílkovin = obojetná povaha disociovatelné kyselé a zásadité sk. -COOH -NH 2 ph prostředí <7 (rel. přebytek H + ):disociace -NH 2 -NH 3 + slabá zásada (v el. poli ke katodě ) >7 (rel. nedostatek H + ):disociace -COOH -COO - slabá kyselina (v el. poli k anodě )
Pufrační schopnost bílkovin pufry, tlumivý roztok, ústoj roztok slabá kyselina + její sůl se silnou zásadou roztok silná kyselina + její sůl se slabou zásadou slabá k. nepatrná disociace (pk A ) sůl (téměř) úplná disociace CH 3 COOH CH 3 COO - + H + CH 3 COONa CH 3 COO - + Na +
Jak to funguje? přídavek silné kyseliny v organismu NaHCO 3 + H 2 CO 3 NaH 2 PO 4 + Na 2 HPO 4 CH + H + + Cl - 3 COOH + CH 3 COO - + Na + 2 CH 3 COOH + Na + + Cl - přidané H + + acetátový aniont -> kyselina; Na + + Cl - -> neutrální sůl; nepatrná změna ph přídavek silné zásady CH 3 COOH + CH 3 COO - + Na + + Na + + OH - 2 CH 3 COOH + 2 Na + + H 2 O ph pufru: pk A kyseliny, poměr koncentrace kyseliny [HA] a soli [OH - ]
Izoelektrický bod aminokyselin Izoelektrický bod = ph kdy je daná AMK v roztoku přítomna ve formě amfiontu, tedy má nulový sumární náboj Relativně nejnižší rozpustnost ve vodě vysrážení Přidání kyseliny nebo zásady (posunem ph), zvýšení rozpustnosti AMK
Rozpustnost bílkovin ve vodě Faktory: velikost a tvar molekuly (globulární lépe než fibrilární) množství a charakter polárních (a tedy ionisovatelných) a nepolárních skupin ph roztoku (izoelektrický bod) koncentrace a povaha elektrolytů (rozpuštěných solí) v roztoku (vsolování a vysolování, solvatační obal)
Solvatační obal bílkovin obalení molekuly bílkoviny molekulami vody, δ + a δ - vysolení: odnětí solvatačního obalu bílkoviny přídavkem soli vyšší afinita solí k vodě ve srovnání s bílkovinou, př. (NH 4 ) 2 SO 4 vsolení: zvýšení rozpustnosti bílkoviny přídavkem soli Zlepšení vysolovacího účinu přídavkem méně polárního rozpouštědla: methanol, ethanol,
Koloidní vlastnosti bílkovinných roztoků
Stanovení isoelektrického bodu kaseinu
Kasein je minimálně rozpustný v oblasti svého izoelektrického bodu, proto je možné ho vysrážet přídavkem kyseliny. Při ph o něco nižším, než je izoelektrický bod se kasein vyloučí z roztoku. Naopak v silně kyselém prostředí se opět rozpouští díky přítomnosti bazické skupiny. Řada mléčných výrobků je založena na srážení kaseinu. Srážení kaseinu lze rozdělit na dvě základní skupiny kyselé a sladké srážení. Ke kyselému srážení kaseinu dochází vlivem působení kyselin. V potravinářství se využívá produkce kyselin pomocí bakterií mléčného kvašení, které produkují převážně kyselinu mléčnou. Snižováním hodnoty ph dochází k porušování povrchových struktur kaseinových micel, což způsobuje uvolnění kaseinu a jeho denaturace. Takto uvolněný kasein není již rozpustný, a proto tvoří sraženinu. Sladké srážení mléka je uskutečněno pomocí enzymů, tzv. syřidel, které se získávají z žaludků mladých telat (chymosin). Tyto enzymy jsou schopny štěpit kasein na specifickém místě, čímž dojde k rozdělení molekuly kaseinu na dvě části. První část se nazývá para κ s1 kasein, který vytváří sraženinu. Druhá část se nazývá glykomakropeptid, který je rozpustný a přechází do syrovátky.
Homogenní směsi Koloidní směsi Heterogenní směsi roztok (pravý) aerosol koloidní roztok plynný kapalný pevný molekuly jednoho plynu rozptýlené mezi molekulami jiného plynu, např. vzduch molekuly nebo ionty nízkomolekulárních látek rozptýlené v kapalině např. roztok NaCl ve vodě jednotlivé atomy (ionty) jedné pevné látky rozptýlené mezi částicemi jiné pevné látky, např. slitiny kovů mlha kapičky kapaliny rozptýlené v plynu dým kouř částečky pevné látky rozptýlené v plynu kapičky kapaliny a částečky pevné látky rozptýlené v plynu molekuly organických látek nebo shluky anorganických molekul rozptýlené v kapalině, např. bílkoviny ve vodě emulze kapičky jedné kapaliny rozptýlené v jiné kapalině, např. olej ve vodě gel bubliny plynu rozptýlené v pevné látce pěna bubliny plynu rozptýlené v kapalině částečky pevné látky rozptýlené v kapalině, např. jemný písek rozptýlený ve suspenze vodě
Kódovaní v RNA II. III. I.