Mendelova genetika v příkladech Využití DNA markerů ve studiu fylogeneze rostlin Ing. Petra VESELÁ Ústav lesnické botaniky, dendrologie a geobiocenologie LDF MENDELU Brno Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a Státním rozpočtem ČR InoBio CZ.1.07/2.2.00/28.0018
Genetické markery Genetický marker = druh variace způsobený mutací či pozměněním původní sekvence - znak vypovídající o genetické podobnosti/ příbuznosti taxonů Genetické markery: Fenotypové Biochemické Molekulární Molekulární markery informace o organismu získaná na základě analýzy molekul nukleových kyselin; založeny na polymorfizmu DNA (variabilita v sekvencích DNA nebo RNA)
Přehled základních molekulárních markerů 1. proteiny isozymy, zásobní proteiny atd. 2. DNA markery RFLP založené na PCR analýza fragmentů DNA údaje o pořadí nukleotidů sekvence analýza celého genomu délkový polymorfismus fragmentů RAPD AFLP informace z konkrétní části genomu mikrosatelity (SSRs)
Vlastnosti molekulárních markerů dostatečnágenetická variabilitou vysoká expresivita nezávislost na podmínkách prostředí
Výhody x nevýhody použití molekulárních markerů Fenotypové markery -zdarma -omezený počet -výskyt může být omezen na určité ontogenetické stádium -ovlivněné prostředím Molekulární markery -nákladné -prakticky neomezený počet -nezávisí na ontogenetickém stádu -nejsou ovlivněny prostředím
Restriction fragment length polymorphism (RFLP) štěpení restrikčními endonukleázami, ve specifickém restrikčním místě, a elektroforetická analýza produktů štěpení odlišení na základě polymorfizmu v délkách a počtech restrikčních fragmentů polymorfizmy v délkách restrikčních fragmentů způsobeny přestavbami (např. inzercemi, delecemi a substitucemi bazí) ve studované sekvenci (působí změnu počtu restrikčních míst)
Metody založené na PCR - sekvenování kódující úseky- exony- konzervativnější nekódující úseky- introny, spaceryvariabilnější
Jaderný genom přítomnost minimálně dvou kopií téhož úseku/genu u heterozygotů nutné oba haplotypy analyzovat jako individuální jednotky ještě větší potíže způsobuje rekombinace v rámci genomu dochází (např. genovými duplikacemi) ke vzniku nezávisle se vyvíjejících paralelních sekvencí téhož úseku (genu)
Jaderný genom rdna nejčastěji používaná pro studium genetické diverzity a variability u rostlin rdna lokalizována v oblasti NOR ITS: nekódující oblast mezi konzervovanými kódujícími oblastmi 18S a 28S rrna vyvíjí se rychleji než většina jiných genů, může se velmi lišit i mezi blízce příbuznými druhy
Chloroplastový genom cirkulární dsdna má délku 120-220 kb chloroplasty obsahují více kopií molekuly DNA snadné použití PCR plastidový genom kóduje rrna, trna a zhruba 80 proteinů chloroplastový genom je haploidní, běžně nedochází k rekombinacím, přenos uniparentální relativně konzervativní a stabilní (mutační rychlost nízká)
Chloroplastový genom Kódující oblasti rbcl kóduje velkou podjenotku RuBisCo konzervativní oblast používaná v systematice na úrovni čeledí a rodů (ev. druhů) matk kóduje gen pro maturázu; jedna z nejrychleji se rozvíjejících kódujících oblastí chloroplastové DNA používá se v systematice na mezirodové a mezidruhové úrovni
Chloroplastový genom Nekódující oblasti mnohem variabilnější než kódující oblasti (častější výskyt mutací) ve fylogenetických studiích použití na nižší taxonomické úrovni (mezirodová, vnitrodruhová) trnh-psba (intergenový spacer) - vykazuje vysokou variabilitu trnl trnf (trna geny) - vhodné pro systematiku na úrovni blízce příbuzných druhů
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) využívá krátkých primerů libovolné sekvence s neznámou homologií k cílové sekvenci DNA a málo přísné podmínky pro nasednutí primeru primery nasedají na různých místech genomu (amplifikace mnoha fragmentů s různou délkou) není potřeba žádná předchozí znalost sekvencí zkoumaného taxonu produkováno mnoho polymorfních fragmentů, které jsou (teoreticky) náhodně rozmístěny po celém genomu citlivost k mnoha parametrům nemožnost srovnání mezi různými studiemi problémy při vyhodnocování dominantní marker nevíme co je lokus homologie fragmentů polymorfismus je dán mutací v místě nasedání primerů insercí/delecí v amplifikované části DNA
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) kratší primery (obvykle 8 NT) konstantní teplota annealingu (34-37 C) AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) delší primery (20 NT) nízká iniciační teplota annealingu (40 C nižší specifita nasedání) následuje vyšší teplota (60 C a vyšší nasedání specifické) DAF (DNA Amplification Fingerprints) velmi krátké primery (5NT) pro bakterie menší genom
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) metoda vhodná pro populační studie a zjišťování vztahů na úrovni blízce příbuzných taxonů metoda založena na selektivní PCR amplifikaci podmnožiny genomických restrikčních fragmentů výhody: možnost analyzovat jakýkoliv organismu bez předchozí znalosti jeho genomu, schopnost analyzovat velké množství markerů současně a napříč celým genomem, reprodukovatelnost nevýhody: dominantní marker, nejistá homologie fragmentů, relativně drahá
Analýza mikrosatelitů tandemové repetice - 1 až 5-ti nukleotidové opakování, 10 60x (př. (A) n, (CA) n, (GGC) n atd.) GTTCTGTCATATATATATATAT CGTACTT GTTCTGTCATATATATATATATATATCGTACTT alely dány různým počtem opakování motivu (délkový polymorfismus) častý výskyt v genomu (nejčastěji v nekódujících oblastech) vysoký stupeň polymorfismu kodominantní marker mutace mikrosatelitů: rychlost se odhaduje 10-3 - 10-5 nejčastěji ztráta nebo získání jednotky
Rozmístění v genomu jaderné mikrosatelity hodnocení variability na populační úrovni potřeba druhově specifické primery chloroplastové mikrosatelity téměř výhradně opakování jediné báze např. (T) 12 vhodné pro hodnocení variability na úrovni příbuzných druhů k dispozici univerzání primery