Elektrický proud a přenos hmoty v elektrolytech Metody chemického výzkumu Elektrolyty = roztoky, které vedou elektrický proud = roztoky solí, kyselin a zásad Elektrolytická disociace = v látkách dochází k rozštěpení vazeb a ke vzniku iontů Elektromigrační metody Stupeňdisociace α =udávámíru disociace, ležív intervalu 0< α< 1 počet disociovaných molekul α= celkový počet molekul v roztoku α>30% - silnéelektrolyty 2% < α < 30% - středně silné elektrolyty α<2% - slabéelektrolyty Elektrický proud v kovech = pohyb elektronů X Elektrický proud v roztoku = usměrněný pohyb iontů 2 Elektrický proud a přenos hmoty v elektrolytech Elektrický proud a přenos hmoty v elektrolytech V elektrolytech je přenos elektrického náboje zároveň přenosem hmoty. Změna vodivosti v důsledku ředění souvisí - se změnami v disociaci molekul - s interakcemi mezi ionty a molekulami rozpouštědla - dochází k migraci látek - mění se složení elektrolytu, v okolí elektrod chemické reakce Měrnávodivost κ -základnícharakteristika elektrolytů, závislána koncentraci všech iontův roztoku - [S.cm -1 ] - je závislá na použitém rozpouštědle κ = F * Σ c j z j µ j j=1 Molárnívodivost λ κ λ= c n F Faradayova konstanta zj náboj iontu j -měrnávodivost roztoku κ, v němžna jednotkový objem připadájeden mol částic n, zodpovědných za vodivost, tj. nejběžněji na molárníkoncentraci c - [S.m 2.mol -1 ] cj koncentrace iontu j µj elektroforetická pohyblivost iontu j s vyšší koncentrací roztoku klesá vodivost Silné elektrolyty - zcela disociovány, s vyšší koncentrací je menší schopnost pohybu iontů λ= λ -k* c -soli anorganických a organických kyselin, většina anorganických kyselin a zásad λ -měrnávodivost roztoku při nekonečném zředění, zanedbávávzájemnéinterakce k - empirická konstanta Slabé elektrolyty - koncentrace iontů je dána stupněm disociace, změna koncentrace mění stupeň disociace a λ= λ * α -některéorganické, anorganickékyseliny a zásady (kyselina mravenčí, octová, boritá, NH 3 ) λ -měrnávodivost roztoku při nekonečném zředění, zanedbávávzájemnéinterakce α- stupeň disociace Kohlrauschův zákon o nezávislé migraci iontů - vyjadřuje, že jednotlivé ionty se v nekonečně zředěném roztoku neovlivňují(100% disociace) - molární vodivost je v nekonečně zředěném roztoku dána součtem na sobě nezávislých členů Vodivost roztoku je dána koncentrací, nábojem, pohyblivostí iontů a teplotou. 3 λ = v k * λ k + v a * λ a λ -tabelované molárnívodivosti příslušných iontů v k, v a počet kationtůa aniontů, tvořících molekulu elektrolytu 4
Elektromigrace = pohyb iontů a / nebo nabitých částic v roztoku působením elektrického pole Elektroforetickárychlost a pohyblivost Na nabitou částici v roztoku majívliv 2 opačně orientované síly: Elektroforetická rychlost v = rychlost pohybu iontu, je přímo úměrná intenzitě elektrického pole E - směr pohybu je dán znaménkem jeho náboje a orientací elektrického pole v = E * µ= U/l * µ E intenzita elektrického pole [V/m] µ elektroforetickámobilita[m 2 V -1 s -1 ] U vloženénapětí [V] l velikost gradientu napětí[m] F e = -F f 1. sílaelektrického pole F e F e = Q * E Q celkový náboj, součet nábojů na povrchu částice[c] E intenzita konstantního elektrického pole [V/m] - z rovnosti působících sil vyplývá F e = -F f E * Q v = 6 * π* η* r Q celkový náboj η viskozita prostředí r poloměr kulové částice v rychlost pohybu iontu 2. frikční(třecí) síla prostředíf f F f = f * v A B C f frikčníkoeficient v rychlost pohybu iontu pro kulové částice je frakčnísíla dána Stokesovýmzákonem F f = 6 * π* η* r * v η viskozita prostředí r poloměr kulové částice v rychlost pohybu iontu 5 6 Elektroforetickárychlost a pohyblivost Elektrolyty v elektromigračních metodách Elektroforetická pohyblivost (mobilita) µ = kvalitativní veličina ionogenních látek, charakteristická pro dané prostředí a teplotu Efektivnípohyblivost (mobilita) µ eff = součet pohyblivostíjednotlivých iontových forem, vynásobených příslušným molárním zlomkem µ eff = Σµ i * x i µ eff,cit = µ * x +µ * x + µ * x +µ * x Cit3- Cit3- H 3 Cit H 3 Cit H 2 Cit - H 2Cit- HCit 2- HCit2- Pufr = tlumivý roztok = roztok, který přidáním kyseliny nebo zásady výrazně nezmění své ph - většinou roztoky konjugovaných acidobazických párů, slabých kyselin a bází - např. kyselina octová/octan, kyselina boritá/boritan, amoniak/amonná sůl apod. Hlavní úlohou pufrů je:- umožnit průchod elektrického proudu - udržovat vhodné ph prostředí pro separaci ovlivňování rovnováh cílené změny v efektivních elektroforetických mobilitách S rostoucí koncentrací elektrolytu klesá elektroforetická pohyblivost iontu. -z Debye-Hückelovyteorie kolem každého iontu v roztoku se vytváří iontová sféra pokles volných iontů Iontová síla I charakterizuje celkovou koncentraci náboje suma přes všechny ionty v roztoku pro zředěné roztoky platí: I = 0,5 Σ c i * z i 2 z relativnínáboj iontu c koncentrace jednotlivých iontů Pufračníkapacita = množstvísilnékyseliny nebo báze, jejížpřídavek Kritéria výběru vhodného pufru: do 1 litru pufru vyvolá jednotkovou změnu ph -největšípufračníkapacita při ph= pka -měníse s ředěním, přídavkem soli a teplotou výběr podle pracovní oblasti ph čistota a inertnost iontová síla a rozpustnost UV absorpce rozsah pufru= pka ±1 Iontovápohyblivost µ 0 = elektroforetickápohyblivost extrapolovanána nulovou iontovou sílu - závislá pouze na teplotě a použitém rozpouštědle - s rostoucí teplotou se iontová pohyblivost zvyšuje toxicita, cena Lakmusový papírek = orientační kontrola ph µ T = µ T0 [1 + 0,02 (T T 0 )] T teplota pracovní[ C] T 0 teplota standardní25 C 7 8
Elektrolyty v elektromigračních metodách Elektrolyty v elektromigračních metodách K nejběžnějším patří acetátový, citrátový, borátový a fosfátový pufr. Biologické pufry = zwitteriontové pufry, označované jako Good buffers (N. E. Goodet al1966) -základem je N-substituovaný taurinnebo glycin -rozsah použitíph5-9 - inertní vůči enzymatickému působení - netoxické vůči buňkám, neprostupují membránou - neabsorbují v UV-Vis oblasti Vybrané biologické pufry Příprava, skladování a zacházení s pufrem: - výběr pufru, příprava roztoku o zvolené koncentraci a ph Směsné pufry = kombinují více složek - kontrola, případně úprava ph na kalibrovaném ph-metru - použití čerstvých roztoků- hrozba mikrobiální kontaminace! - možnost zmražení méně doporučovaná -dodržovat sterilnípodmínky -kontaminace odběrem např. špičky ph 4.01 ftalátový ph 7.01 fosfátový ph9.01 borátový 9 TBE ph8.3 Tris, kyselina boritá, EDTA TAE ph8.3 Tris, kyselina octová, EDTA Britton-Robinsonův pufr - univerzální 2-12 kyselina boritá, octová, fosforečná + NaOH 10 Elektromigrační metody Trocha historie 1937 Arne Wilhelm Kaurin Tiselius první elektroforetická separace proteinů krevního séra - Nobelova cena za chemii (1948) TiseliusA., Electrophoresisofserumglobulin. I, Biochem. J. (1937) 31(313 317). 1967 Stellan Hjertén sestrojil první plně automatizovaný systém pro A. Tiselius kapilární elektroforézu (kapilára s průměrem 1-3 mm) 1981 James W. Jorgenson a Krynn S. Lukacs první elektroforetická separace různých iontů(aminokyselin, dipeptidů, aminů) zónovou elektroforézou ve velmi tenké v kapiláře o průměru 75 µm Jorgenson J. W., LukacsK. D., Free-ZoneElectrophoresisinGlassCapillaries, CLlin. Chem. 27/9, 1551-1553 (1981) S. Hjertén J. Jorgenson 11 Elektromigračnímetody = založenéna rozdílnépohyblivosti nabitých částic v roztoku vlivem působenístejnosměrného elektrického pole - separace probíhá na základě rozdílné elektroforetické pohyblivosti částic směrem k opačně nabitým elektrodám - jednotlivé techniky se liší jak principem, tak instrumentálním provedením, použitím pracovního elektrolytu apod. Plošné techniky - papírová nízká citlivost a reprodukovatelnost v závislosti na kvalitě papíru - gelová na polyakryamidovém gelu (PAGE), na agarózovém gelu analýza bílkovin, DNA Kapilární techniky Zónová elektroforéza (CZE) Izotachoforéza(ITP) Gelová elektroforéza (CGE) Izoelektrickáfokusace(CIEF) Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) Elektrochromatografie(CEC) Afinitní elektroforéza (ACE) CZE - 14074 publikací CGE - 4805 publikací ITP - 2017 publikací * * -listopad 2012 12
Kapilární zónová elektroforéza = moving boundary electrophoresis technika pohyblivého rozhraní - separace analytů v prostředí homogenního jednoho základního elektrolytu (BGE) o konstantním složení - separace probíhá za konstantního napětí Elektroosmotický tok Křemenná separační kapilára - vyrobena z taveného křemene (fused-silica capillary) -vnitřníprůměr 10 200 µm, vnějšíprůměr 350 400 µm -délka dle požadavků-10 100 cm - vnější vrstva polyimidu(15 µm) chrání před mechanickým poškozením - odstranění části polyimidu = detekční okénko pro UV-Vis detekci Elektroosmotický tok (EOF) - je důsledkem náboje vnitřního povrchu křemenných kapilár - disociace silanolových skupin na stěně kapiláry jí uděluje záporný náboj -po sepnutíelektrického pole docházík pohybu nabitých částic a tím i k pohybu celékapaliny Instrumentace: separačníkapilára zdroj separačního napětí vialky s pufrem, v nichž jsou elektrody a konce kapilár detektor vyhodnocovanísystém absorbance (mau) 12 da M P 10 dcm P 8 dtm P dg M P 6 4 U M P dm C M P 2 0 6 8 10 12 14 tim e (m in) 13 14 Elektroosmotický tok Silanolové skupiny přitahují kationty elektrolytu a vzniká elektrická dvojvrstva, kterou tvoří vrstva Sternova(Helmholtzova) částečně fixovaná ke stěně kapiláry Gouy Chapmanova difúzní, volná výměna s ostatními ionty roztoku - na rozhraní vrstev je vytvořen elektrický potenciál ζ Rychlostní profil EOF = téměř pravoúhlý -ve srovnánís laminárním prouděním hydrodynamického toku je zanedbatelný příspěvek k celkové disperzi zóny Elektroforetickárychlost EOF µ EOF ζ*ε µ EOF = η ζ elektrokinetický potenciál ε permitivita roztoku η - viskozita roztoku v EOF = E * µ EOF Experimentální zjištění EOF pomocí neutrálního markeru- migrační čas ovlivňuje pouze elektroosmóza -neutrálnímarker mesityloxid, aceton, dimethylformamid, voda profil laminárního toku (A) a elektroosmotickéhotoku (B) A B 15 Elektroosmotický tok -díky EOF lze stanovit kationtyi aniontyv jednéanalýze - slouží k mobilizaci zón zakoncentrovaných izoelektrickou fokusací - vysoká rychlost EOF může zapříčinit nedostatečnou separaci kationtů - nízká rychlost EOF umožní interakce kationtů se stěnou kapiláry absorpce, nesymetrie píků - opačně orientovaný EOF může znemožnit detekci analytů Změna elektroosmotického toku µ EOF změnou ph nízký EOF při kyselém ph změnou iontové síly pufru rostoucíiontovásíla snižuje potenciál a tím i EOF Xgenerace tepla modifikací vnitřního povrchu kapiláry - potlačení nebo obrácení náboje pokrytím stěny kapiláry, tzv. coating - permanentní modifikace kovalentní vazba např. s polymerem - dynamická modifikace - přídavek polymeru do pufru ph změnou elektrického pole nízké napětí, nízká selektivita X vysoké napětí, vyšší generace tepla změnou teploty vyšší teplota, změna viskozity, vyšší EOF 16
Účinnost elektroforetické separace Počet teoretických pater N = měřítko účinnosti elektroforetické separace N = 5,54 * (t R /w ½ ) 2 = 16 * (t R /w) 2 t r migračníčas píku w 1/2 šířka píku v polovinějeho výšky w šířka píku při jeho základně - při elektroforéze dochází k migraci iontů a současně k rozmývání zón difúzí píky tvaru Gaussovy křivky σ= vzdálenost, kterou prodifunduje průměrný ion za dobu t -vztah mezi difúzním koeficientem D a tzv. rozptylem σ 2 udává Einstein-Smoluchowskéhorovnice σ 2 = 2 * D * t - účinnost separace je v omezeném rozsahu přímo úměrná vloženému napětí N = µ* U / 2 * D µ elektroforetická mobilita iontu U vložené separačnínapětí výška h w i w = 4σ w 1/ 2 inflexní body w i= 2σ w 1/2= 2,354σ Účinnost elektroforetické separace V reálném experimentu však rozptyl σ 2 ovlivňuje řada vlivů: difúze elektromigračnídisperze sorpce Jouleovoteplo nástřik, detekce atd. Difúze Sorpce - nelze odstranit, pouze ovlivnit např. snížením teploty, zvýšením viskozity apod. - nízký difúzní koeficient úzké píky -interakce analytůs nábojem na stěněkapiláry - vede k asymetrii píků, v horším případě ke ztrátě analytu coating Jouleovo teplo - způsobené průchodem elektrického proudu kapilárou chlazení Elektrodisperze - Ohmova závislost proudu na napětí volba vhodného separačního napětí - rozdílná pohyblivost analytu a spoluiontu stejného náboje z elektrolytu - minimalizace vlivu správnou volbou elektrolytu s co nejpodobnější pohyblivostí vyšší napětí větší generované teplot pokles separace Ekvivalent počtu teoretického patra H = počet teoretických pater vztažený na délku kapiláry l H = l / N = σ 2 / l 17 A -frontování B -symetrie C -chvostování 18 Instrumentace Dávkování v CZE - dávkovaný objem v jednotkách nanolitrů otázka reprodukovatelnosti - nepraktičnost při využití dávkovacích kohoutů či jiných injektorů Instrumentace Elektrokinetické dávkování - v některých případech jediný možný postup kapilární gelová elektroforéza - dávkovací napětí bývá obvykle nižší než separační Hydrodynamické dávkování - nejjednodušší, využití sifonového efektu - rozdíl hladin (ruční dávkování) - využití přetlaku či podtlaku (komerční přístroje) - pro výpočet dávkovaného objemu slouží Hagen-Poiseuilleova rovnice P * d 4 * π* t d V d = 128 * η* l t P tlakový spád na kapiláře d vnitřníprůměr kapiláry t d doba nástřiku η viskozita elektrolytu l t celková délka kapiláry koncentrační poměr ve vzorku nemusí odpovídat poměru v nadávkované zóně - výpočet nadávkovaného objemu t d * U d V d = π* r 2 *l s t 0 * U s r vnitřnípoloměr kapiláry l s efektivnídélka kapiláry t d doba, po kterou bylo aplikováno napětí t 0 migračníčas EOF U d napětípři dávkování U s napětíseparační rozdíl hladin přetlak podtlak 19 20
Instrumentace Detekce v CZE -online detekce přímo v kapiláře X sběr frakcía offline detekce - různá citlivost jednotlivých detektorů - možnost derivatizace analytů pro lepší detekovatelnost Nejběžnější detektory: absorpční fotometrický, s diodovým polem fluorescenční konduktometrický ampérometrický hmotnostně-spektrometrický Elektroferogram a jeho vyhodnocení Elektroferogram = grafický záznam separace po zpracování signálu detektoru - další uváděná označení elektroforegram, elektroforetogram, elektroforeogram Výpočet elektroforetické pohyblivosti z migračního času analytu l t * l s 1 1 µ= U t m t 0 l t celková délka kapiláry l s efektivnídélka kapiláry U separačnínapětí t m migračníčas analytu t 0 migračníčas EOF RozlišenípíkůL a C paprsek paprsek paprsek EOF 2 *(t C t L ) R L,C = w L + w C t C, t L migračníčasy píků w C, w L šířka píkůu základny detekční okénko bublinková cela Z -cela 21 22 Separace organických a anorganických iontů ve víně Informace z publikace: -uncoatedfusedsilicacapillary50 µm ID, 50/60 cm -separationvoltage+15 /-15kV, injection0,5 psi/5 sec, detectionat270 nm -newcapillarytreatment 0,1 M NaOH20 min, Milli-Q water5 min, electrolytesolution5 min -BGE = 9mM pyridine, 12 mmglycolicacid, 5 mm18-crown-6-ether, ph3.6 Separace polysacharidů v mořské vodě -capillary75 µm, 115 cm, 105 cm to thedetector -voltage 18 kv, injectionpressure(50 mbar) for1 s -detectionat224 nm -BGE: 8 mmdmp, 1.5 mmctab, ph12.00 Nepřímá UV-Vis detekce: = pracovníelektrolyt absorbuje v danéoblasti a průchod analytu detektorem se zaznamená poklesem absorbance negativní pík R. Stella et. al. Foodchemistry, 124 (2011) 1194. 23 G. Qiujuet. al., Analytica Chimica Acta, 662 (2010) 193. (1) xylose; (2) mannose; (3) rhamnose; (4) glucose; (5) galactose; (6) fucose; (7) 24
Separace iontů těžkých kovů v odpadních vodách Separace proteinů -capillary50 µm id, 40/48 cm length -runningbuffer10 mmhis/ 4 mmtartrate, ph5.5 -injection3 kv/5 sec, - separation voltage- positive 15 kv, conductivity detection - cross-linked PVA coated capillary - 40/48.5 cm effective/total length, 50 m ID -BGE 40 mmsodiumphosphateph3 -+ 15kV, injection3 kv/5 sec Zesíťovaný polyvinylalkohol potlačený EOF 1, cytochrome c; 2, lysozyme; 3, trypsinogen; 4, -chymotrypsinogen H.F.Lauet. al., Electrophoresis, 32 (2011) 1190. 25 D.Belderet. al., Electrophoresis, 22 (2001) 3813. 26 Prenatální diagnostika vrozených vad Downův syndrom - odběr plodové vody v 15.týdnu těhotenství - separace markerů Downova syndromu STR oblasti na chromozómu 21-1 pík nebo 2 píky v poměru 1:1 normálnígenotyp -3 píky v poměru 1:1:1 (trisomie21.chromozomu), 2 píky v poměru 2:1 genotyp s vrozenou vadou - poly(n-acroyloyl amino ethoxy ethanol) coated capillary -BGE = TBE (89 mmtris, 89 mmboricacid, 2 mmedta) ph8.3, 2,5 µm ethidiumbromid, 8% PVA Separace mikroorganismů - buněčné stěny a membrány mají rozdílný obsah proteinů, lipidů a lipopolysacharidů různý náboj -fusedsilica(l eff = 25 cm, L tot = 33.5 cm) - buffer was 0.0125% PEO dissolved in MES (2[-(N-morpholino)ethanesulfonic acid]), ph = 6.1 -detectionat214 nm, U = 20 kv, injection200 mbar/s Helicobacter pylori Serratia marcescens C. Gelfiet. al., JournalofChromatography A, 718 (1995) 405. 27 B. Buszewski et. al., BiomedChromatogr, 21 (2007) 116. 28
Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní spektrometrií Elektroforeticky zprostředkovaná mikroanalýza (EMMA) = electrophoretically mediated microanalysis - analýza enzymových aktivit, zjištění koncentrace substrátů, inhibičních konstant apod. CE-MS analýza - spojení obou technik zvyšuje potenciál v separaci, identifikaci i kvantifikaci látek -látky se stejnou molekulovou hmotností nelze stanovit na MS, ale lze po předchozí separaci a obráceně koelujícílátky v jednom píku CE lze odlišit na MS spektrech - vhodné při analýze komplexních vzorků vysoká účinnost, rychlost - nízká spotřeba vzorků a médií, možnost využití online prekoncentrace - potřeba vytvořit uzavřený elektrický okruh s vysokým napětím přes separační kapiláru - vhodný výběr elektrolytu předejít zanášení zdroje a ucpání kapilár, interferencím apod. Z. Glatz et. al., JournalofChromatography B, 814 (2006) 23. 29 30 Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní spektrometrií Iontové zdroje pro CE-MS ESI pro polární látky, první použitý zdroj (Olivares a kol. Anal.Chem. 59 (1987) 1230) typické základní elektrolyty kys. octová, mravenčí, uhličitan amonný + přídavek org. rozpouštědel APPI/APCI pro málo polární a nepolární látky, lepší kompatibilita s netěkavými složkami elektrolytu tj. dokonce použití fosfátů MALDI offline spojení(sběr frakcíz CE, příménanášeníseparace z kapiláry na MALDI destičku apod.) vše záleží na konstrukci iontového zdroje, geometrii a způsobu spojení obou technik Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní spektrometrií Separace β-laktoglobulinů v mléce - sledování autenticity mléka pančování ovčího a kozího mléka mlékem kravským -srovnánívýskytu vybraných β-laktoglobulinůve vzorku -CE-ESI-MS analýza, BGE 1M kyselina mravenčíph=1.9, - sheath liquid: voda, methanol, k. mravenčí(78:20:2 v/v), 1 µl/min směs mléka kravské:kozí 50:50 kravský β-lg A kravský β-lg B kozíβ-lg kozíα-la kozíβ-lg ovčíβ-lg A + β-lg C Aplikace CE-MS kravský β-lg A + β-lg B - klinická biochemie a diagnostika - analýza tělních tekutin (komplexní vzorky) potřeba automatizovaného vyhodnocení MS spekter - analýza životního prostředí a potravin - hodnocení kvality a kontrola bezpečnosti Výhody: vysokárychlost (high-throughput, příznivý poměr cena/výkon (vs. LC/MS), vysoká selektivita a citlivost aplikovatelnost jedné metody na více typů vzorků(= tolerance k interferentům) kravský α-la ovčíβ-la CE-MS analýza α-la a β-lg v a, kravském, b, ovčím a c, kozím mléce směs mléka kravské:kozí 10:90 kravskýβ-lg A kravskýβ-lg B kozíβ-lg 31 L. Mülleret. al., Electrophoresis, 29 (2008) 2088. 32
Elektroforetická analýza na čipech Kapilární izotachoforéza µ-tas micrototalanalysissystem - miniaturizace všechny kroky analýzy v jednom -maláspotřeba vzorku (pl nl) - předúprava vzorku přímo na čipu - přenosnost labon a chip -vyleptaná soustava kanálků plastické hmoty, křemen, sklo obsahují děliče toku kapaliny, ventily apod. - nejčastěji v oblasti analýzy biologicky významných látek nukleové kyseliny a proteiny Hlavní cíl u-tas: vyvinout jednotku, která by dokázala zachytit požadovanou buňku a analyzovat její genomický, proteomický, metabolomický, glykomický či jiný profil - dva základní elektrolyty - LEADING = vedoucí elektrolyt největší pohyblivost v systému - TERMINATING = koncový elektrolyt nejmenší pohyblivost v systému µ TE < µ analytů < µ LE - separace probíhá za konstantního proudu vytvoření potenciálového gradientu - po dosažení ustáleného stavu se zóny pohybují stejnou rychlostí - lze v jedné analýze separovat pouze anionty nebo kationty - problematická výroba technologie -cena P. Smejkal, F. Foret: Chem. Listy, 106 (2012) 104. 33 34 Kapilární izotachoforéza V každém místě separačního prostoru musí být platit: Kapilární izotachoforéza µ podmínka elektroneutrality- součet nábojů kationtů a aniontů musí být v každém makroskopickém objemu stejný Σc i * z i = 0 podmínka kontinuality popisující časové změny koncentrace jednotlivých iontů v daném místě Kohlrauschova regulační funkce ω - vystihující existenci diskontinuit, v průběhu separace se migrující zóny vzorku musí koncentračně přizpůsobit původní hodnotě ω c funkce v zóněvedoucího elektrolyt, dokud nenídosaženo i (x)* z ω(x) = Σ i rovnovážného stavu m i = koncentrace látek v zónách konstantní a daná neměnnou koncentrací vedoucího elektrolytu - koncentrace látek v původním vzorku nemá vliv na výslednou koncentraci látky v izotachoforetické zóně µ X µ L - µ C c X = c L * * µ X -µ C µ L Ohmůvzákon proudováhustota je konstantnípro daný separačníprostor o průřezu S a hnacím proudu I. E * κ= I/S c x koncentrace látky x v zóně c L koncetracevedoucího iontu ve vedoucízóně µ x efektivnípohyblivost látky x µ L efektivnípohyblivost vedoucího iontu L µ C efektivnípohyblivost protiiontuc κ měrnávodivost roztoku 35 E -každázóna obsahuje pouze 1 druh iontů - v každé zóně je přítomen také protiion vedoucího elektrolytu - koncentrace v zóně je konstantní, mimo ni nulová - pořadí zón podle klesající efektivní elektroforetické pohyblivosti Samozaostřovací efekt - vlastnosti se mezi zónami mění skokem -kation chce přejít do zóny před sebou zóna nižšího potenciálu snížení hnací síly návrat zpět -kation chce přejít do zóny za sebou zóna vyššího potenciálu zvýšení hnací síly návrat zpět 36
Izotachoforéza Závěrem - zakoncentrování stopových koncentrací analytů až o několik řádů -využitíprekoncentracepřed kapilárnízónovou elektroforézou Elektromigrační metody -separace od iontůpo celébiomolekulyažbuňky - spolu s chromatografickými metodami největší význam v separačních analýzách - široké uplatnění nejen v praxi, ale také v rozličných odvětvích vědy a aplikovaného výzkumu -díky miniaturizaci a vývoji nových detekčních technik obrovský budoucípotenciál 37 38 Literatura Foret, F., Křivánková, L., Boček, P.: CapillaryZoneElectrophoresis, VCH VerlagsgesellschaftmbH, Weinheim, Germany, 1993. Dolník, V., Úvod do kapilární elektroforézy, Brno, 1994. HighPerformance CapillaryElectrophoresis. A primer. Revisededitionby H.H. LauerandG. P. Rozing, Agilent Technologies, Germany 2009. Odborné časopisy: 39