FYZIOLOGIE BUNĚČ ĚČNÝCH SYSTÉMŮ

FYZIOLOGIE BUNĚČ ĚČNÝCH SYSTÉMŮ Doc. RNDr. Kozubík Alois, CSc. - Doc. RNDr. Hofmanová Jiřina, ina, CSc.

SYLABUS pro studenty 4. ročníku fyziologie živočichů a obecné zoologie,, mol. biologie, chemie životního prostřed edí a ekotoxikologie, výběrov rová přednáška pro doktorandy - Stručný úvod do teorie systémů - Negativní a pozitivní zpětná vazba - Základní pojmy, parametry cytokinetiky (proliferace, diferenciace, apoptóza) - Typy buněčných populací - Kmenové a diferencované kompartmenty. Totipotentní, pluripotentní, progenitorové, komitované diferencované buněčné populace - Autokrinní, parakrinní a endokrinní regulace - Buněčný cyklus a jeho regulace - Faktory ovlivňující buněčné dělení, cytokiny, růstové faktory a inhibitory, jejich specifita a rovnováha jejich působení - Struktura plasmatické membrány a její funkce v regulaci buněčné proliferace a diferenciace - Vysoce nenasycené mastné kyseliny a eikosanoidy - Transdukce signálů a exprese genetické informace - Úloha fosfolipidových komponet v transdukci signálů růst modulujících látek - Mechanismus účinku hormonů a tkáňových mediátorů ( cytokiny a "chalony"). - Regulace proliferace, diferenciace, apoptózy

Krvetvorný systém m a jeho funkce Hemopoéza ( lymfopoéza za, myelopoéza za, erytropoéza za, megakaryocytopoéza ) Funkce diferencovaných krevních elementů - monocyty, makrofágy - fagocytóza; T B lymfocyty - imunita Membránov nové rozpoznávac vací systémy buněk k imunitní soustava Tvorba protilátek tek ( mechanismus a dynamika vzniku, příprava p prava monoklonáln lních protilátek tek ) Sekreční a regulační funkce buněk k imunitního systému Vztah imunitního systému k další ším m fyziologickým funkcím m ( zánětu z apod.) Homeostáza za, zdraví a nemoc Organismus jako hierarchický systém, spolupůsoben sobení nervové,, endokrinní a humoráln lní soustavy Příklady systémových reakcí jako jsou stres, zánět z t apod. a jejich význam z hlediska zdraví a nemoci Škodlivé faktory vnější šího prostřed edí a jejich vliv na zdraví lidské populace

Doporučen ená literatura Cell Physiology Source Book, ed.. N. Sperelakis Academic Press Inc., 1995 B. Alberts et al.: Molecular Biology of the Cell,, 3 rd edition, Garland Publish. Inc., New York 1994 Biochemie, B., Voet,, J.G. Voetová: Victoria Publishing,, Praha, 1990 Molecular Cell biology,, J.E. Darnell: Eds. Darnell, Lodish,, Baltimore, 2 nd edition, Scientific American Books Inc., New York 1990 J. Neuwirt,, E. Nečas: Kmenové buňky a krevní choroby, Avicenum Praha 1981 Základy buněč ěčné biologie úvod do molekulárn rní biologie buňky ky,, B. Alberts,, D. Bray,, A, Johnson,, J. Lewis,, M. Raff,, K. Roberts,, P. Walter, Espero Publishing,, (orig( orig.. 1998) Klinická imunologie,, J. Krejsek,, O. Kopecký, Nucleus HK, 2004 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ J. Vácha: V Problém m normálnosti v biologii a lékal kařství, Avicenum,, Praha 1980 J. Šterzl: Imunitní systém m a jeho fyziologické funkce, Čs. Imunol.. Společnost, Praha 1993

množstv ství informace (kvantita) využitelnost informace (kvalita) čas Moudrost člověka lze měřit podle starostlivosti, s níž myslí na věci budoucí nebo na konec. G. Ch. Lichtenberg

organismální, tkáňová buněčná molekulová studium na jednotlivých úrovních organizace systému

VÝZKUMNÉ CÍLE A OBLASTI PRAKTICKÉHO VYUŽITÍ INICIAČNÍ (INITIATION) POPULACE NORMÁLNÍCH (NETRANSFORMOVANÝCH) BUNĚK ONKOGENEZE fáze: PODPŮRNÁ (PROMOTION) cell signalling (cytokiny vs. eikosanoidy) klinická data, matematické analýzy, experimentální ověření POPULACE TRANSFORMOVANÝCH BUNĚK PROGRESIVNÍ FÁZE (PROGRESSION) ONKOTERAPIE

Typy regulací růstu a buněčných funkcí) 1) Hormonáln lní (endokrinní) ) regulace Regulátor hormon je produkován buňkami žláz s vnit řní sekrecí do krevního řečiště. Ovliv ňuje funkce buněk, které mohou být značně vzdálenyod míst syntézy hormonu. Hormon je tedy produkován za účelem kontroly činnosti buněk než těch, které jej produkují 2) Parakrinní regulace Mechanismus působení spočívá v tom, že růstový faktor (regulátor) tkáňový mediátor (regulátor místního působení) je syntetizován jedním typem buněk, poté je transportován do extracelulárního prostoru a ovlivňuje f-ce buněk v nejbližším okolí. (často jediná možnost vzhledem k velmi krátkému poločasu rozpadu) 3) Autokrinní regulace je možná tehdy, jestliže jsou buňky schopny jak syntetizovat tak i reagovat na určitý (růstový) regulátor. Pozn.: autokrinní model je součástí konceptu vysvětlujícího abnormální regulaci nádorového růstu. Předpokládá, že nádorově změněné buňky produkují stimulační růstové faktory v nadměrném množství, na které samy odpovídají. Tak se autostimulují ve smyslu aktivace proliferace.

Apoptóza za: programovaná buněč ěčná smrt, nevede k zánětuz Nekróza: Proliferace: je ekvivalentem buněč ěčného dělení ( tzn. zvýšen ení počtu kvalitativně totožných buněk) Diferenciace: rozrůzňování buněk (vznik kvalitativně odlišných buněk) Růst neprogramovaná buněč ěčná smrt, je příčinou p zánětuz (odlišný průběh h biochemických reakcí,, rozdíln lná morfologie) zvětšen ení objemu buňky, buněč ěčné populace (tkáně nebo organismu). Je důsledkemd sledkem: a) zvětšen ení velikosti buněk k při p i zachování konstantní velikosti populace b) zvětšen ení počtu buněk k (proliferace) bez změn n v objemu buněk c) zvýšen ení počtu buněk k i jejich objemu d) odumírání apoptózou nebo nekrózou

TYPY PROLIFERUJÍCÍ expandující, neopouštějí populaci, množí se populace coby zdroj buněk pro jiné populace c. konstantní tranzitní populace ve které se buňky pomnoží c. konstantní TYPY BUNĚČ ĚČNÝCH POPULACÍ NÁDOR K. B. BLASTY KRVE podle Gilberta a Lajthy (1965) TYPY NEPROLIFERUJÍCÍ B. C.N.S. OOCYTY metamyelocyty k. d. ery. gran. stacionárn rní c. konstantní stále ubývá typ průchozí (tranzitní) c. konstantní

T a b u lka 1 D ě le n í b u n ě čn ý ch p o p u la cí p o d le in ten zity o b n o vy u d o sp ě lé m yši 1. S ta tick é p o p u la ce b ez zn á m ek o b n o v y b ěh em ž iv o ta : n eu ro n y v še ch typ ů srd ečn í sv alo v é b u ň k y o d o n to b lasty S erto lih o b u ň k y 2. V elm i p o m a lu se o b n o v u jíc í b u n ěčn é p o p u la ce: B ěh em ž iv o ta se o b n o v í jen č ást p o p u lace: h lad k é sv alo v é b u ň k y g lio v é b u ň k y o steo c yty b u ň k y led v in n ých tu b u lů b u ň k y d řen ě n a d led v in ek h lav n í b u ň k y ž alu d ečn í sliz n ice in tersticiáln í b u ň k y L e yd ig o v y b u ň k y h n ěd é tu k o v é tk á n ě 3. R y ch le se o b n o v u jící b u n ěčn é p o p u la ce: A. N e p říliš rych le s e o b n o v u jící p o p u lace. P o p u la ce, k te rá se b ěh e m ž iv o ta z cela o b n o v í, ale z a d o b u d elší n ež 3 0 d n í: h ep ato c yty a lito ráln í b u ň k y e p itelo v á v ýstelk a d ých acíh o trak tu b u ň k y slin n ých ž láz b u ň k y p an k reatu b u ň k y v k ů ře n ad led v in ek p arietáln í b u ň k y ž alu d ečn í sliz n ice p o jiv o v é b u ň k y v k ů ž i B. V elm i rych le se o b n o v u jící b u n ěčn é p o p u lac e. V še ch n y se o b n o v í z a d o b u k ra tší n ež 3 0 d n í: stře v n í ep itel k rv etv o rn é b u ň k y, p re k u rso ry k rev n ích b u n ěk e p id erm is k o rn ea ep itelo v á v ýstelk a ú stn í d u tin y a eso fa g u p o v rch o v ý ep ite l ž alu d ečn í sliz n ice sem in ifern í ep ite lo v á tk áň C. B u ň k y n ád o ro v é

MODELY: Buňky tzv. intenzívn vně proliferujících ch populací (zejména b. krvetvorné a b. střevn evních epitelů). a buňky nádorovn dorové

Polyklonální charakter kostních buněk Přirovnání kmenové buňky ke stromu: a kmenová buňka v embryonální době b kmenová buňka v dospělosti b a

Seznam používaných zkratek kmenových buněk: BFU-E - CFU-BL - CFU-C - (GM-CFC) CFU-E - CFU-Meg Meg- CFU-S - (CFU - GEMM) DCPC burst forming unit - erythroid (jednotka vytvářej ející explozivně vznikající kolonie erytroidní řady). Velmi nezralá kmenová buňka erytroidní řady. colony forming cell - B - lymfocyte (buňka vytvářej ející kolonie lymfocytů B). colony forming unit - culture (jednotky vytvářej ející kolonie v kultuře). Kmenová buňka bílé řady, v poslední době stále častěji používan vaná zkratka GM-CFC granulocyty macrophage-colony colony forming cell (buňka vutvářej ející kolonie pro granulocyty a makrofágy gy). colony forming unit - erythroid (jednotka vutvářej ející kolonie erytroidní řady.). Kmenová buňka erytroidní řady colonyolony forming unit - megakaryocyte (jednotka vytvářej ející kolonie megakaryocytů). Kmenová buňka erytroidní řady. colony forming unit - spleen (jednotka vytvářej ející kolonie ve lsezině). Nejběžnější používan vaná zkratka pro hemopoetickou pluripotentní kmenovou buňku. diffusion chamber progenitor cell (kemnová progenitorová buňka proliferující v difúzn zních komůrk rkách.)

T.M.Dexter and M.Moore STEM CELL COMPARTMENT PROGENITOR CELL COMPARTMENT MATURE ( END( END ) CELL COMPARTMENT Pre-T cells Eos-CSF T-cells Pluripotent Self- renewing Stem Cells CFU-S IL-3 (HCGF) CFC-Mix Eos-CFC BPA BFU-E GM-CSF s GM-CFC Meg-CSF s Epo CFU-E Eosinophils RBC Neutrophils Macrophages IL-3 (HCGF) Meg-CFC MCGF Megakaryocy tes/ Platelets Bas-CFC Basophils/Mast cells SELF-RENEWAL CAPACITY Pre-B cells B-cells DIFFERENTIATION AND DEVELOPMENT Fig. 1. The structure of the hemopoietic system

Kompartmenty funkčně nebo prostorově oddělené soubory prvků (složek). Důsledek kompartmentace: (existence jednotlivých kompartmentů) prvky (např. látky nebo buňky) jsou nerovnoměrně rozděleny. Příklady: všechny membránami ohraničené struktury mají (z hlediska rozdělení látek) své vnitřní prostředí a selektivně akumulují nebo zadržují určité látky proti koncentračnímu spádu. Už tímto prostým faktem jsou některé reakce umožněny, jiným může být zabráněno. Tato protientropická distribuce molekul v bu ňce směřující proti neuspořádanosti má velký význam pro buněčný metabolismus a regulace. Umožňuje ji právě existence buněčných membrán jeden ze základů biologických systémů Bude rozvedeno později

Pluripotentní buňka již neschopná vytvořit slezinnou kolonii 1 Hematopoetické buňky kostní dřen eně 100 % 50 % 0 % CFU-S - BFU-E - CFU-E - CFU-C - CFU-eozinofilů - CFU-Meg - CFU-makrofágů 2 - CFU-BL 3 - CFU-TL 3 erytroblasty - myelocyty - megakaryocyty Přestup do krve Pluripotentní buňky Morfologicky rozpoznatelné buňky Proliferující buňky Neproliferující buňky Obr. 8. Schéma kvantitativního zastoupení různých prekurzorů krevních buněk v krvetvorné tkáni. 1 Podle Gregorové a Henkelmana (1977); 2 podle MacVittieho a Porvaznika (1978); 3 nejsou odvozeny od CFU-S.

POČET BUNĚK V POPULACI optimální rozsah regulace diferenciace zánik buněk (smrt apoptózou) produkce buněk (intenzita dělení - proliferace) zvýšené riziko vzniku nádorových onemocnění tolerovaná hranice regulovaného rozmezí homeostázy na tkáňové úrovni

úbytek buněk (nekróza, apoptóza) přírůstek buněk (intenzita dělení) základní stav ( normalita )) před ovlivněním m buněčné populace nová úroveň rovnováhy (vysoký obrat buň.. populace) cytotoxické působení regenerativní zvýšení úrovně buněčného dělení mitogenní stimulace hyperplazie (vznik nádorového onemocnění) + - rovnovážný ný stav nerovnovážný ný stav hranice (limity): zvýšen ení rizika optimáln lního rozmezí optimum optimáln lního rozmezí nevratného poškozen kození

treatment: proliferace regulační podněty,atd.... 0 diferenciace apoptóza modelové s ys témy in vitro, buňky liš ící s e růs tovou s trategií, pacient VÝSTUPY

+ - t0 tx% differentiation? apoptosis proliferation (necrosis) time (t)

Rovnováha (homeostáza) výsledek působení mnohočetných zpětných vazeb

FAKTORY SPECIFICKÉ - růst + FAKTORY NESPECIFICKÉ jádro (DNA) membrána cytosol

REGULACE NORMÁLNÍHO RŮSTU INHIBICE Startovací stimulátorová síla (odpověď vše nebo nic) Nesspecifické faktory kumulace katabolitů vyčerp erpání živin transmem.pot. E m -70 aža -90 mv limitní konc.. Na + /K +, Ca 2+, Mg 2+ snížen ení cgmp~10-8 -10-12 mol.l -1 intracel. zvýšen ení camp 10-2 -10-5 mol.l -1 extr. katabolické steroidy interferon katecholaminy,, adrenalin některé mitostat.. hormony ACTH některé prostaglandiny inh.. myeloidní leukémie inh. epid.. karcinomu, ascitu inh. lymfomu, melanomu epidermáln lní,, intestináln lní inh. FGRF, MCIF inh.. Atd. BSC-1, BHK-1 inh spec. inhibitory-chalony spec. endogenní inhibitory Startovací inhibitorová síla (odpověď vše nebo nic) R Ů S T STIMULACE spec. intracel. stim.. proteiny spec. růstovr stové faktory růstové proteiny, kondic.m.média poietiny, CSF lektiny (A, conc.. A) somatomediny některé prostaglandiny EGF, FGF, NGF, MSA atd. některé hormony - mitogenní inzulín, serotonín hydrokortizon, noradrenalin anbolické steroidy zvýšen ení cgmp 10-3 -10-6 mol.l -1 extr. snížen ení camp pod 10-8 mol.l -1 i.c. dodání Ca 2+ nad 1,8 mv transmem. pot. E m -10 aža -70 mv proteázy zy, trypsinizace dodání živin odstránění katabolitů Poly- Oligo- Mono- Mono- Oligo- Poly- Nesspecifické faktory 1A Schematické znázornění stimulace a inhibice růstu specifickými a nespecifickými faktory. Převaha pozitivního nebo negativního signálu rozhoduje o výsledné stimulaci nebo inhibiciů závisí na metaboluické a růstové aktivitě buněk, typu buněk a dalších podmínkách - viz text. Specifické růstové účinky vnějšího prostředí buněk zahajují specifické růstové faktory (specifick0 stimul8tory) a specifické endogenní inhibitory (chalony). CSF-kolonie stimulující faktor, EGF-epiderm epidermální růstový faktor, FGF-fibroblastový růstový faktor, NGF-nervový růstový r faktor, MSA-multiplikaci sti- mulující aktivita, camp-cyklický 3 5 -guanosinmonofosfát, BSC-1, BHK-1, MCIF, FGRF-specifick specifické inhibitory daných buněč ěčných linií.

úbytek buněk (nekróza, apoptóza) přírůstek buněk (intenzita dělení) základní stav ( normalita )) před ovlivněním m buněčné populace nová úroveň rovnováhy (vysoký obrat buň.. populace) cytotoxické působení regenerativní zvýšení úrovně buněčného dělení mitogenní stimulace hyperplazie (vznik nádorového onemocnění) + - rovnovážný ný stav nerovnovážný ný stav hranice (limity): zvýšen ení rizika optimáln lního rozmezí optimum optimáln lního rozmezí nevratného poškozen kození

POČET BUNĚK V POPULACI optimální rozsah regulace diferenciace zánik buněk (smrt apoptózou) produkce buněk (intenzita dělení - proliferace) zvýšené riziko vzniku nádorových onemocnění tolerovaná hranice regulovaného rozmezí homeostázy na tkáňové úrovni

růstové signály receptory cykliny CDKs regulátory transkripce molekuly signálové transdukce p27 p21 p16 p15 molekuly zesilovací kaskády

CSF-1 c-fms? nucleus mrna tyr e.g.u-pa, JE, KC β actin, fibronectin R (β) hck, frg fos, jun, myc G1 cyclins DNAsynthesis tyr-p receptor substrates e.g. PI-3 kinase phospholipids other effectors e.g. RAF-1 kinase?? G proteins (ras/gap?) DAG PKC phospholipases PKC? Fluid-phase pinocytosis? Na+ H+ Glucose Na+ K+

Oncogenes Tyrosine kinase abl met erb ret B2/neu sea fes/fps src fgr trk fyn yes kit lck Nuclear fos jun myb myc ski Growth factor fgf-5 sis hst int-2 Receptor bek erb B fkg fms mas ros G protein rab ras ral Serine kinase mil/raf pks mos raf pim-1 rel Growth factor Receptor Transducer Effector 2nd messenger Target Regulatory proteins RNA/protein synthesis DNA synthesis Receptor Receptor Receptor Receptor Receptor tyrosine kinase G protein PLCγ DG IP 3 G protein PLA 2 Na + /H - antiport Arachidonate [Ca 2+ ] i PKC PK (?) PG TX Calmodulin [ph] i? G protein Adenylylcyclase camp PKA MEMBRANE CYTOSOL NUCLEUS According to: G.Powis: TiPS; 12: 188-194, 1991

Epigeneticky působp sobící faktory, které mohou modulovat rychlost dělend lení, diferenciaci anebo zánik z buněk Faktory, které mohou ovlivnit cytokinetiku změnami ------------------------------------------------------------------------------ 1) exprese anebo funkce molekul zapojených v přenosu p signálů přímo regulujících ch proliferaci, diferenciaci a buněč ěčnou smrt (apopt( apoptózou), včetně exprese protoonkogenů a nádorovn dorově-supresorových genů ---------------------------------------------------------------------------------------------- 2) signálů,, které tyto funkce ovlivňuj ují do určit ité míry nepřímo mo, jako jsou inhibice mezibuněč ěčných spojení,, ovlivnění funkce enzymů reparujících ch DNA, metylace DNA apod.

Modulace cytokinetiky látkami tukové povahy Lipidy a zejména jejich složky vysoce nenasycené kyseliny (PUFA), včetnv etně jejich metabolitů eikosanoidů, patří mezi významné epigeneticky působp sobící faktory schopné ovlivnit jak dělend lení a zánik z normáln lních, ale i transformovaných buněč ěčných populací,, tak proces maligní transformace.

Hlavní mechanismy působenp sobení PUFAs 1) přímé ovlivnění aktivity transkripčních faktorů regulujících ch expresi genů významných z hlediska cytokinetiky 2) produkce eikosanoidů působících ch na přenos p signálů cytokinů a imunitní systém 3) produkce reaktivních kyslíkových kových metabolitů vznikajících ch peroxidací lipidů.

Význam rovnováhy v přísunu p prekursorových PUFAs a v produkci jednotlivých jejich metabolitů

PROLIFERACE n - 6 n - 3 n - 9 KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984

PROLIFERACE PEROXIDACE LIPIDŮ n - 6 n - 3 n - 9 KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984

PROLIFERACE PROSTAGLANDINY n - 6 KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984

MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS PLA 2 COOH CYCLOOXYGENASES EPOXYGENASES (P450) LIPOXYGENASES PGG 2 LTA 4 PGH 2 EPOXYACIDS, DIOLS, etc. OH LTB 4 LTC 4 TXA 2 PGI 2 PGD 2 PGE 2 TXB 2 O PGE 2 : COOH C 5 H 11 LTC 4 : S COOH CH 2 CH CO NH CH 2 COOH NH COCH 2 CH 2 CHCOOH NH 2 LTD 4 LTE 4 LTF 4 OH OH

Arachidonic acid: metabolic pathways and its possible modulations INDOMETHACIN DICLOPHENAC MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS ARACHIDONIC ACID ETYA abbreviations: ETYA = 5,8,11,14 -eicosatetraynoic acid ESC = esculetin NDGA = nordihydroguaiaretic acid FLAP = 5-lipoxygenase activating protein 9-HE = 9-hydroxyellipticin HETEs = hydroxyeicosatetraenoic acids HPETEs = hydroperoxyeicosatetraenoic acids EETs = epoxyeicosatrienoic acids SKF525A = proadifen CYCLOOXYGENASES 12-LIPOXYGENASE 12-HETEs 12-HPETEs SKF525A, 9-HE NDGA ESC PROSTAGLANDINS THROMBOXANES PROSTACYCLINS P450-MONOOXYGENASES FLAP 5-LIPOXYGENASE LEUKOTRIENES EETs HETEs DIOLS MK - 886 (15-LIPOXYGENASE)

growth factors hormones receptor PLA 2 + PLA 2 P AA According to: A. Sellmayer et al.: Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids ; 57: 353-357, 1997. cyclooxygenases lipoxygenases CP450 monooxygenases eicosanoids -ion channel activity - guanylate cyclase - adenylate cyclase - protein kinase C - protein kinase A - tyrosine kinase - MAP kinase - G-proteins transcription factors gene expression cell growth

Opakování matka moudrosti

Schémata - fólie