OPVK CZ.1.07/2.2.00/28.0184
Základní principy vývoje nových léčiv OCH/ZPVNL Mgr. Radim Nencka, Ph.D. ZS 2012/2013
První kroky k objevu léčiva
Nobelova cena za chemii 2013 Martin Karplus Michael Levitt Arieh Warshel "or the development of multiscale models for complex chemical systems"
Přístupy k objevování nových léčiv Chemistry&Biology, 2012, 72 84
Přístupy k objevování nových léčiv Nature Reviews Drug Discovery 2011, 10, 507-519.
Target-based drug discovery
Identifikace cíle
Vlastnosti optimálního biologického cíle 1. Biologický cíl má významnou roli v patofyziologii onemocnění a/nebo významně ovlivňuje cílené onemocnění 2. Vliv modulace daného biologického cíle je méně významná za fyziologických podmínek než za nemoci 3. Výhodou může být známá krystalová struktura potenciálního cíle případně jiná strukturní informace
Vlastnosti optimálního biologického cíle
Vlastnosti optimálního biologického cíle 4. Zásadní je možnost připravit esej pro testování malých molekul HTS 5. Selektivita cíle: Mezidruhová selektivita - jiné enzymy u mikroorganismů než u člověka Neuniformní exprese v jednotlivých tkáních Multitargeting 6. Možná predikce vedlejších účinků 7. Příznivá IP situace
Identifikace biologického cíle Určení onemocnění Určení biologického cíle Dříve Léčivo neznámý target žádoucí odpověď (morfin analgetický účinek) Od cca 1970 objevování massangerů (endorfiny a enkefaliny)
Identifikace biologického cíle Dnes Bioinformatika Pokrok v genomice, transkriptomice a proteomice Poprvé objevování nových targetů bez ligandů
Molekulárně biologické intermezzo DNA mrna aktivní protein
Molekulárně biologické intermezzo DNA DNA Pre-mRNA Posttranskripční modifikace mrna mrna mrna aktivní protein
Molekulárně biologické intermezzo DNA DNA Pre-mRNA Posttranskripční modifikace mrna mrna mrna aktivní protein protein aktivní protein Posttranslační modifikace proteinu
Molekulárně biologické intermezzo DNA DNA Genom Pre-mRNA Posttranskripční modifikace mrna mrna mrna Transkriptom aktivní protein protein aktivní protein Posttranslační modifikace proteinu Proteom
Proteinové kinázy a regulace proteinu fosforylace tento proces je zprostředkován enzymy, které nazýváme proteinové kinasy přenašejí fosfátový zbytek z ATP na vybrané aminokyseliny jako např. serin/treonin nebo tyrosin konformační změna proteinu v závislosti na jeho fosforylaci regulace funkce jedné z proteinových kináz cyklindependentní kinázy 2 (CDK2), která musí být pro svou funkčnost sama fosforylována fosforylace umožňuje vazbu proteinu,který je dále fosforylován CDK2
Proteinové kinázy a regulace proteinu
Identifikace biologického cíle Nature Reviews Drud Discovery 2004, 965-972.
Bioinformatika Identifikace rodiny genů pomocí vyhledávání sekvencí založeno na vyhledávání shody nebo podobnosti sekvencí Vyhledávání nových členů rodin, které jsou již známé jako vhodné biologické cíle Relativně snadné je to u sekvencí se shodou nad 30% - metody vyhledávaní shody jako BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) nebo FASTA Příklad GPCR dvě třetiny členů má pouze jeden exon = snadnější vyhledávání pro některé byly následně nalezeny ligandy x jiné stále orphan receptory
Moderní metodiky pro identifikaci cílů DNA microarrays slouží např. pro profilovaní RNA mikročipy s vysokou hustotou DNA na skle Až 500,000 krátkých DNA sekvencí (25-60- mery) Determinace až 10,000 genu v jednom hybridizačním kroku i z tak mala jako 10ng RNA Přestože hledáme vlastně proteiny a není plná korelace s RNA profilování RNA má několik výhod
Moderní metodiky pro identifikaci cílů DNA microarrays http://www.affymetrix.com http://www.bio.davidson.educ
Moderní metodiky pro identifikaci cílů DNA microarrays http://www.columbia.edu Wikipedia
Profilování RNA Výhody: High-throughput Široké pokrytí genomu Malé množství vzorku Nevýhody: Ne vždy koreluje s množstvím proteinu Nezohledňuje modifikace a interakce proteinu
High-Throughput Next Gen Sequencing
Moderní metodiky pro identifikaci cílů Proteomika 2D Gelová elektroforéza Hmotnostní spektrometrie v kombinaci s HPLC Proteinové mikročipy (microarrays)
Moderní metodiky pro identifikaci cílů Proteomics in antitumor research, Drug Discovery Today: Technologies Volume 3, Issue 4, 2006, 441 449
2D gelová elektroforéza (2D-PAGE) Isoelectric focusing (IEF) rozdělení podle isoelektrického bodu (pi) IEF IPG strips
2D gelová elektroforéza (2D-PAGE) sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS- PAGE) denaturace pomocí dodecylsulfátu sodného navázaní SDS negativní náboj rozdělení dle MW SDS
2D gelová elektroforéza (2D-PAGE) různé možnosti detekce - Coomassie, stříbro, Flamingo, SYPRO Rozštěpení trypsinem na peptidy Identifikace proteinu Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF, ESI-MS/MS + Sekvenční analýzy peptidů
Shotgun přístupy LC-MS/MS RP-kapalinová chromatografie spojená s MS/MS MudPIT Multidimensional protein identification technology Dvoudimenzionální kapalinová chromatografie Silný katex + RP-LC spojeno s Ms/MS analýzou ICAT Isotope-coded affinity tags Kvantitativní analýza porovnání dvou vzorků každý značený jiným izotopem
Proteinové mikročipy Protein analysis on a proteomic scale Nature 422, 208-215 http://www.stat.purdue.edu/sbc /protein_array_analysis.html
Další metodiky identifikace a validace Analýza funkce genů pomocí cdna knihoven a RNAi Exprese gene-by-gene v miniaturizovaných buněčných esejích Rozsáhlé knockdown eseje na savčích buněčných liniích Two yeast-hybrid system
Validace Další metodiky identifikace a validace zahrnuje prověření že Daný biologický cíl se vyskytuje buňkách nebo tkáních,které mají relevanci k danému onemocnění. Může být ovlivněn molekulou, která má chrakter léčiva. Může být připravena screeningová esej pro tento cíl. Musí vykazovat požadovaný fenotyp na buněčných nebo zvířecích modelech.
Validace Další metodiky identifikace a validace Oligonukleotidy knockdown cílových genů Antisense RNA interference (RNAi)
Validace biologických cílů In vitro na buněčných liniích In vivo na zvířatech knockout Drosophila melanogaster zajímavé modely pro Alzheimerovu a Parkinsonovu chorobu Danio rerio - zebřička Transgenní myši
Fenotypový screening target deconvolution Postup z opačné strany známe ligand, který se váže na náš biologický cíl, ale nevíme jaký je ten cíl Pojem deconvolution použivaný proto, že velmi často se nejedná pouze o jeden cíl Léčivá látka v průměru interguje s 6 molekularními cíli
Fenotypový screening target deconvolution
Fenotypový screening target deconvolution