Jaterní homogenát, preparativní nanáška 2 mg, barvení koloidní Coomassie Blue 1025 spotů. ph 4 ph 7

Transkript

1 2018

2 PROTEOMIKA 2018 Proteomika, proteiny, co a proč. Metody práce s bílkovinami (Petrák 15/10) Značení bílkovin, separační metody, 2-DE (Petrák 22/10) 2-DE záludnosti, digesce a identifikace bílkovin pomocí MS-úvod (Petrák 29/10) Principy hmotnostní spektrometrie (Man 5/11) Identifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie (Man 12/11) Limity 2-DE, Shot-gun strategie, kvantitativní metody (Petrák 19/11) Proteomika membránových proteinů, proteinové komplexy (Petrák 26/11) Klinická proteomika, speciální metody, top-down (Petrák 3/12).??? (Petrák 10/12)

3 Jaterní homogenát, preparativní nanáška 2 mg, barvení koloidní Coomassie Blue 1025 spotů ph 4 ph 7

4 OMEZENÍ 2D TECHNOLOGIE Bílkoviny s extrémním pi! Bíloviny nad kda! Membránové (hydrofobní) bílkoviny

5 LIMITY 2-DE Kolik kopií proteinu musí být v buňce, abychom ho viděli na 2-DE? Gygi et al, PNAS 97,17 (2000)

6 Rozpětí koncentrace/počtu kopií jednotlivých proteinů na buňku ( ) Proteiny, jejichž koncentrace V buňce jsou slučitelné s 2-DE Schwanhäusser B, et al. Nature. 2011;473(7347): corrigendum in Nature, March 2013

7 Abundance/koncentrace buněčných bílkovin Typy proteinů, jejichž koncentrace v buňce jsou slučitelné s 2-DE + cytoskelet, některé další metabolické enzymy a proteiny redoxního stresu Beck et al., Mol Syst Biol Nov 8;7:549.

8 Záludnosti 2-DE PŘEKRYV SPOTŮ A B B A A B

9 Jak spolehlivá je kvantifikace při 2-DE? Thiede et al. Protein species high resolution quantitative proteomics of HeLa cells using SILAC-2-DE-nanoLC/LTQ-Orbitrap mass spectrometry. Mol Cell Proteomics Feb;12(2): spotů 2711 protein species (+kvant) 860 genů/proteinů

10 84 % spotů na 2-DE obsahuje více než 1 protein téměř polovina spotů obsahuje více než 3 proteiny V polovině spotů bylo zastoupení hlavního proteinu menší než 90%! Kvantifikace založená na intenzitě spotu je v 50 % nepřesná! Nemusí znamenat změnu exprese identifkovaného hlavního proteinu!

11 Zhruba polovina identifikovaných proteinů je zastoupena více než jednou proteoformou (je ve více než jednom spotu)

12 HSP27 proteoformy HSP27 nejméně 30 forem Enolase 1 38 forem Heat shock cognate 71 kda protein 31 forem Vimentin 29 forem atd Jungblut, PR. et al. Thiede. et al. Mol Cell Proteomics in print

13 CTRL Záludnosti 2-DE PTM TREATED Protein A ph 7,8 ph 7,5 Protein A-P kyselý shift ph7,8

14 2-DE or not 2-DE? Nepokrývá více jak 10% eukaryotního buněčného proteomu Nefunguje na TMP, extrémy pi, extrémní MW Umožňuje studium proteinů s nejméně desítkami tisíc kopií na buňku Většina bílkovin je zastoupena více proteoformami Ve většině spotů je více až mnoho proteinů Kvantifikace založená na barvení skvrn je nespolehlivá 2-DE umožňuje analýzu jednotlivých proteoforem Náročná experimentálně, nenáročná statisticky a z hlediska MS

15 PROTEOMIKA 2018 Proteomika, proteiny, co a proč. Metody práce s bílkovinami (Petrák 15/10) Značení bílkovin, separační metody, 2-DE (Petrák 22/10) 2-DE záludnosti, digesce a identifikace bílkovin pomocí MS-úvod (Petrák 29/10) Principy hmotnostní spektrometrie (Man 5/11) Identifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie (Man 12/11) Limity 2-DE, Shot-gun strategie, kvantitativní metody (Petrák 19/11) Proteomika membránových proteinů, proteinové komplexy (Petrák 26/11) Klinická proteomika, speciální metody, top-down (Petrák 3/12).??? (Petrák 10/12)

16 Identifikace bílkovin pomocí hmotnostní spektrometrie (MS) Peptidové mapování (Peptidový fingerprinting) na základě změření přesných hmotností peptidů vzniklých štěpením specifickou endoproteázou Fragmentace peptidů/sekvenování (MS/MS) na základě změření přesných hmotností fragmentů peptidu. Peptid nejsnáze fragmentuje v peptidické vazbě. Je tak získána (částečná) aminokyselinová sekvence v daném peptidu.

17

18 Identifikace diferenciálně exprimovaného proteinu In gel naštěpení trypsinem (za Arg, Lys) SSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREG YERLLKMQNQRGGRALFQD IKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHAL GSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKL IKKMGDHLTNLHRLGGPEAG LGEYLFERLT LKHD Extrakce směsi peptidů z gelu

19 Peptidové mapování (Peptidový fingerprinting) MALDI-TOF MS Přesné Accurate hmotnosti mass of the peptidů peptides Porovnání Databases databázemi search Ferritin (L-subunit) SSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREG YERLLKMQNQRGGRALFQD IKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHAL GSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKL IKKMGDHLTNLHRLGGPEAG LGEYLFER LTLKHD

20 Peptidové mapování (Peptidový fingerprinting) LLK I GGR SSQIR L IKK LT LK EGYER MQNQR TPDAMK ELAEEKR ALFQD IK AAMALEKK KPAEDEWGK MGDHLTNLHR DDVALEGVSHFFR LNQALLDLHALGSAR LGGPEAG LGEYLFER TDPHLCDFLETHFLDEEVK QNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDR m/z

21 I m/z

22 Identification of protein in databases from MS data GENES, ORFs In silico translation Gene/Protein identification PROTEINS In silico digestion with trypsin (-R/-K) PEPTIDES theoretical MWs of peptides MS data Masses/MWs of peptides

23

24

25 Protein View: GRP75_MOUSE Stress-70 protein, mitochondrial OS=Mus musculus GN=Hspa9 PE=1 SV=3

26 Identifikace bílkovin pomocí hmotnostní spektrometrie Peptidové mapování (Peptidový fingerprinting) na základě změření přesných hmotností peptidů vzniklých štěpením specifickou endoproteázou Fragmentace peptidů/sekvenování (MS/MS) na základě změření přesných hmotností fragmentů peptidu. Peptid nejsnáze fragmentuje v peptidické vazbě. Je tak získána (částečná) aminokyselinová sekvence v daném peptidu.

27 Fragmentace peptidu (mikrosekvenování, MS/MS) S-P-A-F-D-S-I-M-A-E-T-L-K MH + = P. Mann a P. Novák, AVČR

28 Fragmentace peptidu (mikrosekvenování, MS/MS) MALDI TOF-TOF MW peptidu Kolizní cela LGGPEAGLGEYLFER LGGPEAGLGEYLFE R LGGPEAGLGEYLF ER LGGPEAGLGEYL FER LGGPEAGLGEY LFER LGGPEAGLGE YLFER m/z jeho fragmentů Identifikace peptidu LGGPEAGLGEYLFER a proteinu L-FERRITIN

29 Identification of protein in databases from MS data GENES, ORFs PROTEINS In silico translation Gene/Protein identification In silico digestion with trypsin (-R/-K) PEPTIDES theoretical MWs of peptides FRAGMENTS MS data MWs of peptides and their fragments theoretical MWs of peptide fragments

30 MS peptidový fingerprint m/z 1865

31 Kdy použít PMF a kdy musím fragmentovat peptid? Jediný protein ( z 2-DE) Směs peptidů z jednoho proteinu (5-50 peptidů) MS (PMF) Směs proteinů Směs peptidů z mnoha proteinu ( peptidů) MS/MS (fragmentace) FRAKCIONACE!

32 proteiny LC-MS shotgun peptidy

33 RP-LC

34 RP-LC ESI

35 RP-LC ESI

36 RP-LC ESI

37 RP-LC ESI

38 RP-LC MS ESI

39 RP-LC MS ESI

40 RP-LC MS MS/MS ESI

41 RP-LC MS ESI

42 RP-LC MS ESI

44 Protein identification in shot-gun experiments Unique (proteotypic) peptides X peptides present in different proteins Protein 1 Protein 2 Protein 3

45 Present in more proteins Unique

46 PROTEOMIKA 2018 SHOT-GUN METODY LC, IEF peptidů Kvantitativní přístupy SILAC,iTRAQ, dimetylace, 18 O, AQUA Label free MRM/SRM

47 proteiny proteiny 2-DE LC-MS shotgun peptidy peptidy

48 SPECIFICKÉ ŠTĚPENÍ BÍLKOVIN Cíl fragmentace: Definovaně fragmentovat protein, aby jednotlivé peptidy byly dostatečně malé na optimální MS analýzu, ale zároveň poskytly dostatečnou sekvenční informaci Optimum 6-20 AA, cca Da Proteáza Místo štěpení Poznámka Trypsin za Lys, Arg nenásleduje Pro Glu-C (Proteáza V8) za Glu a Asp nenásleduje Pro Chymotrypsin za Phe,Trp,Tyr, Leu, Ileu, Val, Met nenásleduje Pro Lys-C za Lys nenásleduje Pro Arg-C za Arg nenásleduje Pro Asp-N před Asp, Cys Chemická digesce CNBr Met organika, hydrofobní P.

49 Shot-gun strategies proteins TRYPSIN ~ peptides (2D)LC-MS IEF-LC-MS SDS-PAGE-LC-MS (gel-lc)

50 Separační strategie v shotgun experimentech 1D SDS-PAGE DIGESCE Extrémně komplexní směs peptidů různých In gel digesce řízků dle MW a extrakce (2D) LC (SCX)-RP, RP-bRP IEF- RP LC Komplexní směsi peptidů různých ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS RP-LC

51 Metody chromatografické separace peptidů VELIKOST AKTUÁLNÍ NÁBOJ Gelová filtrace (Size-exclusion chromatography) Iontoměničová chromatografie (Ion exchange chromatography) SPECIFICKÉ INTERAKCE Afinitní chromatografie (Affinity chromatography) HYDROFOBICITA HYDROFILNOST Chromatografie v reverzní fázi (Reverse phase chromatography) Chromatografie hydrofilních interakcí (Hydrophilic interaction LC, HILIC)

52 Identifikace proteinů v shot-gun experimentech Až stovky tisíc různých peptidů kontinuálně eluovaných z (RP) LC On-line MS přímé spojení LC kolony s ESI-MS. V reálném čase ( minut) jsou eluované peptidy ionizovány. Změřeno MS, izolován prekurzor a provedena fragmentace. Cyklus přepnutí MS-MS/MS až několikrát za sekundu. Off-line MS např. LC-MALDI. Frakce eluujících peptidů jsou sbírány a MS probíhá až po sběru. Typicky sběr mikrofrakcí (nl) na MALDI destičku s následným měřením MS a MS/MS.

53 RP-LC

54 RP-LC ESI

55 RP-LC ESI

56 RP-LC ESI

57 RP-LC ESI

58 RP-LC MS ESI

59 RP-LC MS ESI

61 RP-LC MS ESI

62 RP-LC MS ESI

64 LC-MALDI MS Nano LC s robotickým mikrosběračem frakcí. Frakce jsou on-line míchány s matricí a spotovány na MALDI destičku

65 Separační strategie v shotgun experimentech DIGESCE (2D) LC (SCX)-RP, RP-bRP Extrémně komplexní směs peptidů různých ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS

66 Shotgun postupy v proteomice DIGESCE (2D) LC (SCX)-RP, RP-RP Extrémně komplexní směs peptidů různých ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS

67 MudPIT (2002) Multidimensional protein identification technology 1484 proteinů identifikováno (kvasinka - cca 5000 ORF)

68 Peptidová online 2D HPLC-MS Nejčastěji ion-exchange/rp

69 Peptidová online 2D HPLC-MS Nejčastěji ion-exchange/rp

70 Separační strategie v shotgun experimentech DIGESCE Extrémně komplexní směs peptidů různých (2D) LC (SCX)-RP, RP-bRP IEF- RP LC ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS

71 IEF-IPG peptidů Distribuce lidských peptidů dle pi Výhody IPG-IEF peptidů vysoká separační účinnost možnost vyšší nanášky informace o pi může sloužit k verifikaci ID snížení komplexity vzorku při zachování pokrytí proteomu Informace o pi může pomocí při ID stejné vybavení jako pro IEF proteinů 1/3 lidských peptidů má pi v rozmezí 3,5-4,5 Je zde zastoupeno 96% známých proteinů jednotlivé frakce jsou ze stripu extrahovány

72 Separační strategie v shotgun experimentech 1D SDS-PAGE DIGESCE Extrémně komplexní směs peptidů různých In gel digesce řízků dle MW a extrakce (2D) LC (SCX)-RP, RP-bRP IEF- RP LC Komplexní směsi peptidů různých ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS RP-LC

73 Digesce trypsinem v gel a extrakce peptidů Kombinace SDS-PAGE a LC-MS/MS v shot-gun strategii 200kDa 100 kda 75 kda 60 kda 20 kda LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS Identifikace/ kvantifikace