Vyšetření glykemie ÚVOD. Glykemie a její udržování

Transkript

1 Vyšetření glykemie ÚVOD Glykemie a její udržování Glukóza je významným zdrojem energie v organismu savců. Z tohoto důvodu se glukóza (Glc) používá ve formě vodných roztoků (infúzí) při léčbě různých patologických stavů. Definice: glykemie je hladina (koncentrace) glukózy v krvi. Normální hladina glykemie se pohybuje v rozmezí hodnot: 3,9 5,6 mmol/l nalačno (údaje se v literatuře a v jednotlivých laboratoří liší). Hladina glukózy v krvi je citlivě regulována řadou mechanismů. Porucha v těchto mechanismech se může projevit jako trvalé zvýšení hladiny Glc hyperglykemie nebo snížení hypoglykemie. Hyperglykemie je nadměrná koncentrace Glc v krvi, která se objevuje např. u diabetes mellitus (DM). Hypoglykemie je snížená koncentrace Glc v krvi, která se objevuje např. při předávkování inzulínem. Hypoglykémie může vyvolat poruchy činnosti mozku, projevující se slabostí, třesem, zmateností až bezvědomím. Glykosurie znamená přítomnost glukózy v moči. Hladina glykemie je udržována hormonálně. Hormony podílející se na regulaci glykemie jsou: inzulín, glukagon, kortizol, katecholaminy a růstový hormon. Inzulín je peptidový hormon, který je syntetizován v beta-buňkách Langerhansových ostrůvků v pankreatu. Inzulín je z pankreatu sekretován do krve, jestliže stoupá glykemie a hormon se šíří do celého organismu a je vychytáván receptory na cílových buňkách. Inzulín má vliv na sacharidový i lipidový metabolismus v buňce. Inzulín a jeho vliv na sacharidový metabolismus: 1. Inzulín podporuje vstup Glc do buněk kosterní a srdeční svaloviny a tukové tkáně (GLUT-4) glykémie. 2. Inzulín aktivuje glykolýzu v buňce 3. Inzulín aktivuje syntézu glykogenu v buňce Obecně: Inzulín podporuje vstup Glc z krve do buněk a dále aktivuje využití Glc v buňce. Defekty v sekreci inzulínu nebo v receptorech pro inzulín vedou k onemocnění diabetes mellitus. Glukagon je peptidový hormon, který je syntetizován v alfa-buňkách Langerhansových ostrůvků v pankreatu. Glukagon je sekretován z těchto buněk, jestliže glykemie klesá. Glukagon působí hlavně na buňky jater (působí zde jako antagonista inzulínu) a aktivuje zde uvolňování Glc do krve, čímž stoupá hladina glykemie. Glukagon nepůsobí v periferních tkáních. Receptory pro glukagon jsou spřaženy s G- proteiny. Glukagon a jeho vliv na metabolismus: 1. Glukagon aktivuje glykogenolýzu v játrech Glc do krve glykemie 2. Glukagon aktivuje glukoneogenezi v játrech Glc do krve glykemie Kortizol je steroidní hormon, který je syntetizován v kůře nadledvin - jeho syntéza vychází z cholesterolu. Kortizol náleží mezi tzv. glukokortikoidy a aktivuje proteolýzu proteiny se hydrolyzují na jednotlivé aminokyseliny, které se přeměňují na Glc v procesu glukoneogeneze glykemie. Biochemické testy Základní biochemickou informací o sacharidovém metabolismu je stanovení koncentrace Glc v krvi (v plné krvi, plazmě nebo séru). Glykemii je možné měřit v krvi arteriální, venózní a kapilární. Stanovení hodnoty glykemie patří mezi naprosto rutinní vyšetření v klinické biochemii. Přehled hodnot glykemie je uveden v tab. 1. 1

2 Tab. 1: Přehled hodnot glykemie nalačno v průběhu života člověka. věk koncentrace Glc v séru (mmol/l) do 1 dne 2,22 3,33 do 4 týdnů 2,78 4,44 od 4 týdnů do 15 let 3,33 5,55 od 15 let do 60 let 3,88 5,59 od 60 let do 70 let 4,44 5,59 od 70 let do 99 let 4,61 5,59 (Údaje byly převzaty z Národního číselníku laboratorních položek - NČLP na CD-ROM MZČR). Stanovení glykemie nalačno Stanovení glykemie nalačno vychází z faktu, že glykemie po požití jídla stoupá, a pak se vrací do normálních hodnot. Tudíž před odběrem krve pro stanovení glykemie se doporučuje: 2 3 dny před odběrem mít minimální příjem sacharidů a 12 hodin před odběrem nejíst. Odběr je nejlépe provést mezi hodinou ranní. Stanovení glykemie po jídle (= postprandiální glykemie) Odběr krve se provádí 1 hodinu po jídle obsahujícím sacharidy. Glykemický profil U diabetiků se často stanovuje glykemie několikrát za den: nalačno, po jídle a případně i v noci (5x nebo 9x denně, např. v 6:00, 12:00, 17:00, 22:00 a ve 3:00 hod.). Toto vyšetření má význam pro určení terapie, např. jak dávkovat inzulín. ogtt (= oral glucose tolerance test) = orální glukózový zátěžový test U pacienta se změří ráno glykemie nalačno. Poté pacient vypije nápoj, ve kterém je rozpuštěno 75 g glukózy ve ml vody (během 5 15 minut) a po 30, 60, 90 minutách a 2 hodinách se opět odebere krev pro stanovení glykemie. Pokud po 2 hodinách po vypití nápoje je hodnota glykemie vyšší než 11,1 mmol/l, jedná se o prokázaný diabetes mellitus. Hodnoty mezi 8 11,1 mmol/l se označují jako porušená tolerance glukózy (impaired tolerance glucose). Pokud je hodnota glykemie již při prvním ranním měření vyšší než 8 mmol/l, tak se od ogtt opustí. Na základě naměřených hodnot z jednotlivých stanovení glykemie můžeme sestrojit glykemickou křivku viz. obr. 1. Obr. 1 byl převzat z - Textbook in Medical Physiology and pathophysiology Section VII: Endocrine Glands in Humans Chapter 27: Blood glucose and diabetes 2

3 Průběh vícebodové perorální glykemické křivky po zátěži glukosou (nebo sacharidy) lze rozdělit do tří úseků. a) Rychlost resorpce Glc ze střeva udává tvar vzestupné části křivky. Tato část může být strmá při hypertyroidismu (zvýšené prokrvení trávícího ústrojí - rychlejší resorpce Glc do krve) nebo naopak může být plochá při malabsorpci hypotyroidismus (myxoedema). b) Vrcholová část křivky je závislá na dobré funkci jater (tvorba jaterního glykogenu) a na účinku inzulínu v játrech. Za normálních okolností je 80% vstřebané glukózy přeměněno v játrech na glykogen. V krvi vena portae je koncentrace až 22,2 mmol/l, zatímco do periferního oběhu se dostane maximálně 11,1 mmol/l. Vzestup glykemie provokuje exkreci inzulínu do krevního oběhu. Vrcholu glykemie je dosaženo za minut. U začínajícího inzulíndependentního diabetu, kdy nastává snížení exkrece inzulínu, není glukóza přeměněna v játrech v dostatečné míře na glykogen a vrchol glykemie glykemické křivky přesahuje hodnotu 11,1 mmol/l a jeho maximum bývá i později než za 60 minut. Při onemocnění jater kapacita jaterních buněk nestačí vstřebanou glukózu metabolizovat nebo se do periferního oběhu přes portokavální zkraty dostane více glukózy. Vrchol rovněž převýší hraniční hodnotu; vrcholová hodnota přetrvává i déle než 60 minut, ale návrat ve 120 minutě je již normální (utilizace není porušena) (zvonový tvar křivky). U hypertyreózy rychlé vstřebání glukózy způsobí, že je rovněž převýšena hranice 11,1 mmol/l, ale návrat k výchozí hodnotě je rychlý (gotický tvar křivky). c) Sestupná část křivky je závislá na účinku inzulínu a je mírou utilizace glukózy. Její porušení (zpomalený a nedostatečný návrat k normě je klasickým projevem diabetu. Porucha je projevem absolutního nebo relativního nedostatku inzulínu. Literatura: Devlin, T.M.: Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, 4 th edition, Willey-Liss, Inc., USA, 1997 ISBN Masopust, J.: Klinická biochemie: Požadování a hodnocení biochemických vyšetření I a II. díl, Univerzita Karlova, Karolinum, Praha, 1998 ISBN POUŽITÁ ANALYTICKÁ METODA V praktickém cvičení je glykemie stanovována pomocí spektrofotometru. Princip fotometrického stanovení glykemie v séru: glukóza se oxiduje kyslíkem za katalýzy enzymem glukózaoxidázou za tvorby glukonátu a peroxidu vodíku. Vzniklý H 2 O 2 se stanovuje oxidační kopulací se substituovaným fenolem a 4- aminoantipyrinem za katalýzy enzymem peroxidázou. Vzniklý barevný produkt (chromogen tmavě červené barvy) absorbuje při 498 nm světelné záření a množství tohoto chromogenu je úměrné koncentraci glukózy ve vzorku. POŽADOVANÉ ZNALOSTI Struktura glukózy - její vlastnosti a funkce, vstup glukózy do buňky, využití glukózy v buňce, přehled základních metabolických drah sacharidů v buňce, vliv inzulínu a glukagonu na metabolismus glukózy, princip spektrofotometrie POSTUP ANALÝZY V praktiku bude glukóza stanovena současně v několika vzorcích: A) ve standardech (3 standardní roztoky glukózy o známé koncentraci) B) v kontrolním séru (Lyonormu) - slouží ke kontrole přesnosti práce studenta, jeho koncentraci zná vyučující C) ve vzorku pacienta před podáním léku D) ve vzorku pacienta po podání léku Vzorky pacienta jsou součástí projektu, který budete zpracovávat v rámci Klinického detektivního příběhu 7. 3

4 Vybavení: spektrofotometr, plastové kyvety, zkumavky, pipety, vodní lázeň, sáček na odpadky, střička s destilovanou vodou, buničina Chemikálie: standardní roztok glukózy o koncentraci 20 mmol/l kontrolní sérum Lyonorm (= zvířecí sérum obohacené o analyty běžně stanovované v lidském séru) 2 vzorky pacienta činidlo v dávkovači (složení: pufr, enzymy glukózaoxidáza a peroxidáza, 4-aminoantipyrin, 3-methylfenol) destilovaná voda Postup:! Při práci používejte gumové rukavice! Příprava standardních roztoků glukózy: Pro analýzu budete potřebovat tři standardní roztoky o různé koncentraci (20 mm, 10 mm a 5 mm). K dispozici máte pouze standardní roztok glukózy o koncentraci 20 mm, další dva standardy si připravte jeho naředěním: 1. připravte 1 ml roztoku glukózy o koncentraci 5 mm 2. připravte 1 ml roztoku glukózy o koncentraci 10 mm. K ředění použijte větší plastové zkumavky a automatické pipety. Příprava roztoků (slepý pokus, standardy, séra) pro fotometrické stanovení: Úkoly: 1. jednotlivé zkumavky (celkem 16 kusů) si předem označte lihovou fixou 2. standardy zpracujte dvojmo, vzorky sér trojmo dle následující tabulky: zkumavka číslo pipetovaný objem pipetovaný roztok 1 (= slepý pokus) 10 µl destilovaná voda 2,3 10 µl standard o koncentraci 5 mm 4,5 10 µl standard o koncentraci 10 mm 6,7 10 µl standard o koncentraci 20 mm 8,9,10 10 µl Lyonorm (= kontrolní sérum) 11,12,13 10 µl sérum pacienta před podáním léku 14,15,16 10 µl sérum pacienta po podání léku 3. do každé zkumavky přidejte dávkovačem 1 ml činidla 4. promíchejte obsah zkumavek a stojánek se zkumavkami vložte do vodní lázně; inkubujte zkumavky přesně 15 min při teplotě 37 o C 5. přelijte roztoky do plastových kyvet a změřte jejich absorbanci proti slepému pokusu při vlnové délce 498 nm; absorbance musí být změřena do 40 minut po skončení inkubace 6. zbytky roztoků vylijte do láhve s biologickým odpadem (vedle fotometru), kyvety propláchněte destilovanou vodou a nechte připravené k dalšímu použití; použité zkumavky vyhoďte do odpadního sáčku na stole Vytvořte přehlednou tabulku (Tab. 1), do které zaznamenejte absorbance standardních roztoků, jejich známé koncentrace a z těchto údajů vypočítané přepočítavací faktory (dle Lambertova-Beerova zákona: f = c st / A st ). Průměrnou hodnotu získanou ze všech přepočítávacích faktorů budete potřebovat pro výpočet koncentrace glukózy ve vzorcích pacienta a v séru Lyonorm. 4

5 Vypočítejte průměrnou hodnotu přepočítávacího faktoru f a pomocí této hodnoty vypočítejte koncentraci glukózy ve všech ostatních zkumavkách (3x Lyonorm, 3x sérum pacienta před podáním léku, 3x sérum pacienta po podání léku). Do protokolu uveďte přehledně veškeré vaše výsledky: do tabulky (Tab. 2) zapište absorbance naměřené ve všech vzorcích séra a jim odpovídající vypočtené koncentrace. U každého vzorku uveďte i průměrnou hodnotu koncentrace, tj. průměrnou koncentraci glukózy v Lyonormu, ve vzorcích pacienta před a po podání léku. Nezapomeňte si do protokolu poznamenat identifikační čísla vašich vzorků. Údaje z Tabulky 2 použijte ke zpracování Klinického detektivního příběhu 7 (seminář ve 14. týdnu). OKRUHY ZKUŠEBNÍCH OTÁZEK Praktikum navazuje na přednášky a semináře na téma: Chemie živin (kurz Energie) Přehled energetického metabolismu (kurz Energie) Glykolýza, glukoneogenze, glykogen (kurz Energie) Regulace metabolických drah na úrovni buňky (kurz Energie) Složky krevní plazmy a jejich funkce (kurz Tkáně) Laboratorní analytické metody (kurz Struktura) Předpokládané znalosti: struktura fyziologicky významných sacharidů (glukóza, fruktóza, galaktóza, sacharóza, laktóza, maltóza, škrob, glykogen, celulóza) - vzorce + typy chemických vazeb struktura kyseliny glukuronové a glukonové transport glukózy do buněk, uvolňování glukózy z buněk do krve metabolismus glukózy (glykolýza, glukoneogeneze, pentózový cyklus, syntéza a odbourávání glykogenu, přeměna glukózy na další monosacharidy a jiné významné látky např. na kys. glukuronovou, glucitol) - stručný přehled těchto drah: substráty, významné meziprodukty, produkty, regulační enzymy, lokalizace v buňce a v organismu vliv inzulínu a glukagonu na metabolismus glukózy fyziologická glykemie nalačno a po jídle princip spektrofotometrie Poslední aktualizace: