MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2011 Roman Waloszek

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie Sledování interakce kademnatých iontů s fytochelatiny Diplomová práce Vedoucí práce: René Kizek Brno 2011 Vypracoval: Roman Waloszek

3 Brno 2011 Mendelova univerzita v Brně Ústav chemie a biochemie Agronomická 2010/2011 fakulta ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE Autor práce: Studijní program: Obor: Konzultant: Bc. Roman Waloszek Fytotechnika Biotechnologie rostlin Ing. Dalibor Húska Název tématu: Sledování interakce kademnatých iontů s fytochelatiny Rozsah práce: stran Zásady pro vypracování: 1. Anotace práce: díky antropogennímu působení dochází v životním prostředí k nárůstu celé řady škodlivých sloučenin, jako jsou pesticidy, ale také těžké kovy. V mnoha zemích je koncentrace těžkých kovů v životním prostředí závažným problémem v ochraně zdraví a produkci potravin. Je známo, že pokud jsou rostliny vystaveny účinkům těžkých kovů, zahájí rostlinné buňky syntézu thiolových sloučenin, jako jsou glutathion a fytochelatiny (PC). 2. Metodický přístup: pro charakterizaci thiolových sloučenin lze využít elektrochemických metod (diferenční pulzní voltametrie, chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza), kde nachází své uplatnění kromě visící rtuťové kapkové elektrody také pevné elektrody. 3. Cíle práce: Vypracovat literární přehled zabývající se souvislostmi mezi rostlinnou buňkou, fytochelatiny a ionty těžkých kovů (především kademnatých iontů). Listopad 2010 prosinec Studium elektrochemického chování fytochelatinu s kademnatými ionty za využití elektrochemických technik. Leden 2011 únor Matematické a statistické vyhodnocení výsledků, sepsání diplomové práce. Únor 2011 březen Seznam odborné literatury: 1. KLEJDUS, B. -- HAVEL, L. Analýza cysteinu, glutathionu a fytochelatinů pomocí HPLC. 3

4 CHEMagazin sv. 13, č. leden, s ISSN PETŘEK, J. -- VÍTEČEK, J. -- HAVEL, L. -- PETRLOVÁ, J. -- ADAM, V. -- KÍZEK, R. Vliv těžkých kovů (Cd-EDTA, Pb-EDTA) na raná somatická embrya smrku (Picea spp.). In BLÁHA, L. Vliv abiotických a biotických stresorů na vlastnosti rostlin Praha: Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně, 2005, s ISBN ZEHNÁLEK, J. -- ADAM, V. -- KÍZEK, R. Vliv těžkých kovů na produkci obranných sloučenin u zemědělských kulturních rostlin. Listy cukrovarnické a řepařské : odborný časopis pro obor cukrovka-cukr-líh sv. 120, č. 7-8, s ISSN BALOUN, J. -- STEJSKAL, K. -- DIOPAN, V. -- SHESTIVSKA, V. -- ADAM, V. -- MIKELOVÁ, R. -- ZEHNÁLEK, J. -- HAVEL, L. -- TRNKOVÁ, L. -- BARTŮŠEK, K. -- KIZEK, R. Vyuziti analyzy obrazu, nuklearni magneticke rezonance a Brdickovy reakce pro studium vlivu tezkych kovu na embryonalni smrkove kultury. In Chemické zvesti. Slovenská republika: Institute of Chemistry Slovak Acedemy of Science, Bratislava, Slovak Chemical Society, Bratislava, 2007, s ISSN DIOPAN, V. -- SHESTIVSKA, V. -- BALOUN, J. -- STEJSKAL, K. -- VLAŠÍNOVÁ, H. -- ADAM, V. -- HAVEL, L. -- KIZEK, R. Změny hladiny fytochelatinů lnu setého vystaveného vlivu iontů těžkých kovů. In Vliv abiotických a biotických stresorů na vlastnosti rostlin. 1. vyd. Praha: Česká zemědělská univerzita v Praze, 2008, s ISBN ŠUPÁLKOVÁ, V. -- HÚSKA, D. -- DIOPAN, V. -- HANUŠTIAK, P. -- ZÍTKA, O. -- STEJSKAL, K. -- BALOUN, J. -- PIKULA, J. -- HAVEL, L. -- ZEHNÁLEK, J. -- ADAM, V. -- TRNKOVÁ, L. -- BEKLOVÁ, M. -- KIZEK, R. Electroanalysis of plant thiols. Sensors sv. 7, č. 6, s ISSN BALOUN, J. -- HÚSKA, D. -- DIOPAN, V. -- ADAM, V. -- BABULA, P. -- HAVEL, L. - - KIZEK, R. Analysis of phytochelatin and phytochelatin synthase using liquid chromatography with electrochemical detection. In 7th Workshop on Sulfur in Plants. 1. vyd. Warsaw, Poland: Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 2008, s. 67. ISBN KÍZEK, R. -- KLEJDUS, B. -- VACEK, J. -- VÍTEČEK, J. -- VOJTĚCH, A. -- TRNKOVÁ, L. -- HAVEL, L. -- KUBÁŇ, V. Elektrochemické stanovení metalothioneinu a fytochelatinu. In 3. metodické dny. 1. vyd. Praha: Česká společnost experimentální biologie rostlin a Ústav experimentální botaniky AV ČR, 2003, s. 74. Datum zadání diplomové práce: listopad 2010 Termín odevzdání diplomové práce: duben 2011 Bc. Roman Waloszek Autor práce doc. Ing. René Kizek, Ph.D. Vedoucí práce doc. RNDr. Petr Hrdlička, CSc. Vedoucí ústavu prof. Ing. Ladislav Zeman, CSc. Děkan AF MENDELU 4

5 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MENDELU v Brně. V Brně, dne 29. Dubna 2011 Roman Waloszek

6 Poděkování Děkuji vedoucímu diplomové práce doc. Ing. Renému Kizekovi, Ph.D. za účinnou metodickou a pedagogickou pomoc. Dále pak odbornému konzultantu Ing. Daliboru Húskovi a celému kolektivu v laboratořích na Ústavu chemie biochemie. 6

7 Abstract The issue of toxic heavy metals like cadmium and lead in the environment is still highly topical. The main sources of pollution include industrial production and as well agricultural activities. These metals get into the food chain through the plant organisms, especially agricultural crops. We constantly develop a new, fast, cheap and in situ methods of their detection. These requirements could meet electrochemical methods in combination with nanotechnology. Nowadays, the science focuses on the use of modified solid carbon paste electrodes by nanotubes. This thesis is focused on the detection of heavy metal ions using carbon paste electrode modified by nanotubes and chitosan and their interaction with phytochelatins. The phytochelatins play a key role in the detoxification of heavy metals in plant tissues. This ability of plants is also used in phytoremediation. For the comprehensive use of phytoremediation techniques are necessary to know and comprehend the principles and behavior of plants exposed to heavy metals in vitro. Keywords: heavy metals, electrochemistry, carbon paste electrode, nanowires Abstrakt Problematika toxicity těžkých kovů jako kadmium a olovo v životním prostředí je stále vysoce aktuální. Hlavními zdroji znečištění patří průmyslová výroba ale i zemědělská činnost. Tyto kovy se dostávají do potravního i přes rostlinné organismy, především zemědělskými plodinami. Stále se vyvíjejí nové, rychlé, levné a in situ metody jejich detekce. Tyto požadavky by mohly splňovat elektrochemické metody ve spojení s nanotechnologiemi. V současnosti se věda zaměřuje na využití modifikovaných pevných uhlíkových pastových elektrod nanotrubicemi. Tato práce je zaměřena na detekci iontů těžkých kovů pomocí uhlíkové pastové elektrody modifikované nanotrubicemi a chitosanem a jejich interakce s fytochelatiny. Právě fytochelatiny hrají klíčovou roli v detoxifikaci těžkých kovů v rostlinných pletivech. Této schopnosti rostlin se využívá i ve fytoremediacích. Pro komplexní využití fytoremediačních technik je zapotřebí znát principy a chování rostlin vystavených těžkým kovům in vitro. Klíčová slova: těžké kovy, elektrochemie, uhlíková pastová elektroda, nanotrubice 7

8 SEZNAM ZKRATEK CPE uhlíková pastová elektroda (carbon paste electrode) ROS reaktivní kyslíkové látky (reactive oxygen species) Cys cystein Glu kyselina glutamová Gly glycin GSH redukovaný glutathion SH sulfhydrylová skupina ATP adenosintrifosfát Cys cystein GRX glutathionredoxin DPV diferenční pulzní voltametrie GCS γ-glutamylcysteinylsyntetasa Glu kyselina glutamová PCs fytochelatiny GST glutathion-s-transferasa HMC vysokomolekulární komplex s těžkým kovem LMC nízkomolekulární komplex s těžkým kovem GSH redukovaný glutathion GR glutathion reduktasa Gly glycin GPX glutathion peroxidasa GS glutathionsyntetasa 8

9 Obsah SEZNAM ZKRATEK... 8 I. ÚVOD II. CÍLE PRÁCE III. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY TĚŽKÉ KOVY KADMIUM A OLOVO KADMIUM Mechanizmy příjmu kadmia rostlinou Mechanizmy působení kadmia na rostlinu Obrana rostlin proti působení volných radikálů OLOVO FYTOCHELATINY SYNTÉZA FYTOCHELATINŮ INETERAKCE FYTOCHELATINŮ S TĚŽKÝMI KOVY ELEKTROCHEMIE ELEKTROANALÝZA Voltametrie PRACOVNÍ ELEKTRODY Rtuťové elektrody Pevné elektrody Kovové elektrody Uhlíkové elektrody Uhlíkové nanotrubice Referentní elektrody Pomocné elektrody IV. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST MATERIÁL A METODY POUŽITÉ CHEMIKÁLIE PŘÍPRAVA UHLÍKOVÉ PASTOVÉ ELEKTRODY ELEKTROCHEMICKÁ ANALÝZA ROSTLINNÝ MATERIÁL VÝSLEDKY A DISKUSE

10 5.2. OPTIMALIZACE STANOVENÍ KADEMNATÝCH IONTŮ POMOCÍ ELEKTROCHEMICKÝCH METOD Vliv doby akumulace iontů Cd a Pb na odezvu signálu Vliv koncentrace Cd2+ a Pb2+ na odezvu signálu mikrocpe nanocpe nanocpe MODIFIKACE UHLÍKOVÝCH PASTOVÝCH ELEKTROD CHITOSANEM mikrocpe modifikovaná chytosanem nanocpe1 a nanocpe2 modifikovaná chytosanem SLEDOVÁNÍ VLIVU KADEMANTÝCH IONTŮ NA ZEA MAYS L Vliv kademnatých iontů na růst Zea mays L Růstové závislosti Vliv Cd 2+ na aktivitu γ-glutamyltransferázy GMT (µcat l -1 ) v Zea mays Vliv Cd 2+ na množství fytochelatinů v Zea mays VI. ZÁVĚR VII. LITERATURA VIII. SEZNAM OBRÁZKŮ

11 I. ÚVOD Těžké kovy se nacházejí v zemské kůře v stopových množstvích, ale i malých koncentracích ovlivňují živé organizmy a rostliny svými vlastnostmi do prostředí vod, půd a atmosféry se dostávají skrze přírodní aktivity, jako jsou sopečné výlevy nebo antropogenní činnosti spojeny s těžbou zpracováním surovin. Vyskytují se v nejrůznějších anorganických i organických formách vázané. Takto uvolněné těžké kovy se mohou dostávat do životního prostředí a akumulovat v rostlinách, které tvoří první stupeň potravinové pyramidy a dále pak mohou ohrožovat vyšší organizmy. Jedeny z environmentálně nejvíce sledovaných ne esenciálních těžkých kovů jsou kadmium a olovo. Tyto kovy se lidskou činností v některých lokalitách dostaly do prostředí do takové míry, že začínají negativně ovlivňovat lidskou populaci. Nejen že se akumulují do vyšších organizmů ve větší míře ale i snižují výnos kulturních rostlin, na kterých je rostoucí lidská populace závislá. Nemůžeme být lhostejní k regionální kontaminaci, někde daleko od domova a tvrdit, že se nás to netýká. Protože při současné globalizaci světového obchodu z potravinami nikdy nevíme přesně odkud pochází to co jíme a kolik to obsahuje nežádoucích látek. Pokud nemáte v kuchyni spektrofotometr nebo elektrochemický analyzátor či jiné měřící zařízení. Jako perspektivní se jeví metoda fytoremediace, která splňuje všechny tyto požadavky. Výběrem vhodného hyperakumulátora a dále jeho šlechtění nebo genetickou modifikací se dosáhne kvalitních sanačních výsledku. Jeden z nejdůležitějších biochemických procesů ovlivňujících vazbu kovu a toleranci rostlin vůči těžkým kovům je tvorba na cystein bohatých polypeptidů fytochelatinu. 11

12 II. CÍLE PRÁCE Diplomová práce byla zaměřena na vývoj zcela nových a originálních postupů detekce těžkých kovů a jejich interakce s fytochelatiny za využití pastové uhlíkové elektrody modifikované laboratorně připravenými uhlíkovými nanotrubicemi a chitosanem ve spojení s elektrochemickými technikami. Pro řešení byly vytýčeny následující dílčí cíle: Vypracovat literární přehled zabývající se souvislostmi mezi rostlinnou buňkou, fytochelatiny a ionty těžkých kovů a možnosti elektrochemické detekce Navrhnout a optimalizovat postup detekce iontů těžkých kovů (Cd 2+, Pb 2+ ) za využití elektrochemických technik a modifikovaných uhlíkových pastových elektrod Studium elektrochemického chování fytochelatinu s kademnatými ionty u rostlin Zea mays L. za využití elektrochemických technik. 12

13 III. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 1. TĚŽKÉ KOVY KADMIUM A OLOVO 1.1. Kadmium Kadmium je stříbřitý, měkký, kujný a tažný kov s teplotou tání (767 C). Svými vlastnostmi se podobá zinku. Vzhledem k podobnosti, se vyskytuje i v rudách společně se zinkem v poměru 1:100 až 1:1000. Je také získáváno jako vedlejší produkt při tavení zinku. Při zpracování 1 tuny zinkové rudy se uvolní kolem 3 kg kadmia a jiných kovů, zejména olova a mědi. Pro svoji vlastnost chránit železo před korozí je používáno při výrobě plechů, dále se především používá v automobilovém průmyslu k výrobě katalyzátorů. Do prostředí se dostává zejména jako atmosférická depozice. Dalším zdrojem je zemědělská činnost použitím minerálních superfosfátů. Ty obsahují především kadmium, ale i chróm a arsen. Rozhodující pro obsah těchto prvků je použitá surovina, např. apatity obsahují kolem 0,15 ppm Cd, zatímco fosfority zejména z afrických nalezišť kolem 50 ppm (Adriano D. C. Springer Verlag, (2001), Tlustoš, 2006). Dále se kadmium může do prostředí dostávat hnojením čistírenskými kaly, nebo popelem ze spaloven biomasy. Kadmium se efektivně akumuluje v rostlinných pletivech, čímž se dostává do potravního řetězce člověka. Vzhledem k jeho vysoké toxicitě a možnosti mobility v prostředí a akumulaci v organismech je jeho bio-obohacování oproti jiným těžkým kovům efektivnější. Mobilita kadmia v půdě závisí na rozpustnosti, která se zvedá se snižujícím se ph (způsobené např. kyselými dešti). Může tak dojít k uvolnění kadmia ze sedimentů a z vázaných forem čímž se následně může zvýšit koncentrace ve vodě a v půdě a tím se zvyšuje i jejich dostupnost pro rostliny (Bertin a Averbeck, 2006, Kafka a Puncocharova, 2002, Wolterbeek, 1987, Wolterbeek, a kol., 1987). 13

14 Mechanizmy příjmu kadmia rostlinou Kadmium je rostlinami přijímáno převážně kořeny ale i povrchem listů při suché depozici. Transport kadmia ke kořenům se děje difúzí a hromadným tokem. V blízkosti kořenů dochází k chelataci kovů organickými kyselinami vylučovanými rostlinou čímž se zvyšuje difuzní gradient a urychluje příjem prvku. Příjem kadmia kořeny se děje výměnnou absorpcí, při níž je kadmium zaměněno s jinými esenciálními kovy, jako je zinek a měď. Při výměnné absorpci kationty reagují se záporně nabitými částmi střední lamely buněčných stěn (Wolterbeek, 1987, Wolterbeek, a kol., 1987). Další způsob kterým přijímají rostliny kadmium je ireverzibilní ne metabolická fixace v buněčné stěně. Tento mechanizmus příjmu kadmia lze i chápat jako určitou obranu rostlinné buňky před vstupem kadmia do cytoplazmy buněk, čímž redukuje jeho toxické působení. Jak již bylo dříve řečeno, procesy příjmu kadmia závisí na jeho koncentraci v daném prostředí a jeho formě a době působení, obsahu organických a dalších komplexotvorných látek ale i na teplotě půdy, obsahu vody, oxido-redukčního potenciálu a samozřejmě nesmíme opomenout druh rostliny (Ahmad, a kol., 2008, Almendras, a kol., 2009, Florijn a Vanbeusichem, 1993, Florijn a Vanbeusichem, 1993) Mechanizmy působení kadmia na rostlinu Hlavní příčinou negativního vlivu kadmia je jeho možná záměna se zinkem (Zn). Poměrně snadno se zaměňují v proteinech a enzymech, čímž se inhibuje nebo značně narušuje jejich nativní funkce. Dalším důležitým vlivem kadmia v rostlině je tvorba volných kyslíkových radikálů, jako jsou hydroxylové radikály, peroxid vodíku, singletový kyslík, anion superoxidu s čímž souvisí i interakce s nukleovými kyselinami, následkem čehož vznikají mutace a narušení proteosyntetického aparátu. Dále kyslíkové radikály způsobují oxidativní stres, změny v proteinových řetězcích a oxidaci lipidů v membránách, čímž narušují celý membránový systém buňky (Jabeen, a kol., 2009, Kafka a Puncocharova, 2002, Piterkova, a kol., 2005, Tlustoš, 2006) Obrana rostlin proti působení volných radikálů 14

15 Ochranu před oxidačním poškozením organismu aktivními formami kyslíku zajišťuje řada antioxidačních obranných systémů lokalizovaných v různých buněčných strukturách. Antioxidační obranné mechanismy zahrnují neenzymové a enzymové systémy. Mezi velmi účinné antioxidanty řadíme askorbát, β-karoten, redukovaný glutathione a α-tokoferol. Specializované enzymy jako superoxiddismutasa (EC ), peroxidasa (EC ), katalasa (EC ) a enzymy askorbát-glutathionového cyklu zabezpečující univerzální obranu rostlin (Piterkova, a kol., 2005). Obr. 1 Obecné schéma biologických důsledku intoxikace kadmia v buňkách. Kadmium zasahuje do různých důležitých mechanismů v rostlině, jako jsou genové exprese, buněčný cyklus, diferenciace a proliferace buňky. Kadmium zvyšuje oxidační poškození DNA,proteinu a membránových lipidů. Indukce oxidačního poškození je spojeno s narušením mitochondrií. Oxidační stres vyvolává tvorbu HSPs (heat shock protein), spojené s přizpůsobením na stres, zahájení opravy bílkovin nebo degradaci pomocí Ubiqitin - proteasomu. Oxidační poškození DNA vede k mutacím a vyvolání rakoviny. Inhibice některých opravných mechanizmů DNA přispívá k nárůstu mutací a rakoviny (Bertin a Averbeck, 2006). 15

16 1.2. Olovo Olovo je lesklý měkký kov, který se používá již od starověku. Znečištění prostředí olovem je způsobeno lidskou činností a to úpravny rud, hutě, rafinerie, chemický průmysl, akumulátory, pigmenty do barev, olovnaté sklo, přídavky do glazur, zemědělství (hnojiva, insekticidy), spalování fosilních paliv a v neposladní řadě automobilový provoz. Nejvíce jsou postiženy rozvojové země, které nemají důslednou legislativu chránící životní prostředí a zdraví člověka (Batkova, a kol., 2008, Greene, 1993, Kafka a Puncocharova, 2002, Pazurkiewicz-Kocot a Pietruszka, 2000). Olovo je nebezpečné pro rostliny i živočichy díky své schopnosti akumulovat se v organizmu. Olovo se neustále dostává do ekosystému. Atmosférické olovo se ukládá do vegetace, půdy i vody. Chemické a fyzikální vlastnosti olova a biogeochemické procesy v ekosystémech mají neustále vliv na cirkulaci olova v životním prostředí a jeho akumulaci. Za určitých podmínek (např. olovo v sulfátových půdách), se zvyšuje jeho rozpustnost a přístupnost pro organismy a jeho působení je tím toxičtější (Greene, 1993). Mezi hlavní negativní účinky olova na rostlinu patří ovlivnění fotosyntetického aparátu což má za následek zakrslý růst, inhibici dýchání, chlorózu listů inhibice vývoje kořenového sytému. Stejně jak u kadmia i olovo výrazným způsobem přispívá k tvorbě ROS. Všechny tyto účinky byly pozorovány u izolovaných buněk nebo u hydroponicky pěstovaných rostlin v roztoku s koncentrací 1-2 ppm olova (Greene, 1993, Kim, a kol., 2009, Pazurkiewicz-Kocot a Pietruszka, 2000). 2. FYTOCHELATINY Pro zvýšení ochrany proti toxickým těžkým kovům musely rostlinné buňky vyvinout mechanismy, pomocí nichž jsou ionty kovů, které se dostanou do cytosolu buňky, ihned komplexovány a inaktivovány. Sloučeniny, které se účastní komplexace kovů, zahrnují organické kyseliny, volné aminokyseliny, glutathion, fytochelatiny, metalothioneiny, metalochaperony a heat shock proteiny. Metalothioneiny jsou polypeptidy bohaté na cystein, které jsou kódovány skupinou genů. Na druhou stranu fytochelatiny jsou skupinou enzymaticky syntetizovaných peptidů bohatých na cystein (Soudek, a kol., 2008). Fytochelatiny jsou všeobecně známy jako peptidy, jichž základní stavební jednotkou je tripeptid glutathion. Jejich funkce v rostlinách spočívá v schopnosti 16

17 izolovat těžký kov a následně jej transportovat do rostlinné vakuoly, kde je ukládán ve formě komplexu (Babula, a kol., 2010). Základní složkou fytochelatinů (PCs) je tripeptid glutathion. PCs pak mají základní strukturu (γ-glu-cys)n-gly, kde se dipeptidická repetice glutamové kyseliny a cysteinu (γ-glu-cys) může opakovat 2 až 11krát ale (nejčastěji 2 5krát) (Supalkova, a kol., 2007, Zehnalek, a kol., 2004, Zehnalek, a kol., 2004). 17

18 2.1. Syntéza fytochelatinů Fytochelatiny jsou syntetizovány v cytosolu z glutathionu a γ -glutamylcysteinu pomocí enzymu fytochelatinsyntetázy (PCS) Obrázek 2. Tento enzym podléhá pozitivní alosterické regulaci prostřednictvím iontů kovů. Syntéza fytochelatinu probíhá přímo z jednotlivých aminokyselin. Nejprve vzniká glutathion za účasti dvou sekvenčních ATP dependentních reakcích katalyzovaných enzymy gama-glutamylcys syntetázou (gama-ecs) a následně glutathion syntetázou (GS). Poslední krok reakce zahrnuje prodlužování řetězce (gama-glu-cys) připojováním jednotek gama- Glu-cys pomocí transpeptidačního enzymu fytochelatin syntázou (PCS). Vzorec uvedený na konci schématu představuje základní strukturní jednotku fytochelatinů opakujících se jednotek glutamyl-cysteinyl s C-terminální části cysteinem (Ahmad, a kol., 2008, Cobbett, 2000, Gill a Tuteja, 2010, Supalkova, a kol., 2007). Obr. 2 Schéma syntézy fytochelatinů Ineterakce fytochelatinů s těžkými kovy Kadmium stimuluje tvorbu fytochelatinů v cytosolu a vytváří s ním komplexy s vyšší polymerizační hladinou. Kadmium se váže do struktury fytochelatinu pomocí SH skupin. Molekuly kadmia se váží k doméně-c přičemž vzniká nízkomolekulární komplex (LMC). Tento komplex je transportován proti koncentračnímu spádu pomocí transportérů přes tonoplast do vakuoly. To bylo prokázáno na experimentu s Cd-senzitivními mutantanty htm1 u kvasnic. Ve vakuole nízkomolekulární komplex podléhá změnám za vzniku vysokomolekulárního komplexu (HMC), který znemožňuje opětovnou refundaci zpět do cytosolu. Fytochelatiny následně mohou být degradovány hydrolasami ve vakuole nebo se mohou vracet do cytosolu a 18

19 pokračovat ve své funkci. Schéma detoxifikace Cd iontů ukazuje obrázek 3 (Arthur, a kol., 2005, Cobbett, 2000, Gill a Tuteja, 2010, Supalkova, a kol., 2007). Obr. 3 Schéma detoxifikaci fytochelatinů. Schema detoxikace kadmia v rostlinné buňce. Kademnaté ionty jsou přepravovány přes protonové pumpy do vakuoly. Tady tyto ionty aktivují tvorbu fytochelatinu, která tvoří s ionty kovů M-PC komplex (LMW Cd). Tento komplex je následně přepravován přes tonoplast do vakuol, je to aktivní proces spotřebovává se při tom ATP. Zde je nízkomolekulární komplex transformován na komplex s vysokou molekulovou hmotností M-PC (HMW M-PC), přes-s-s-skupiny (Supalkova, a kol., 2007) 19

20 ELEKTROCHEMIE Elektrochemie vznikla na přelomu 18. a 19. století. Jedna z prvních definic byla zaznamenána v Ottově slovníku naučném. Elektrochemie je tedy odvětví fyzikální chemie, u níž dochází ke kombinaci chemie s elektřinou. Další významná definice pochází od Rudolfa Brdičky, který elektrochemii popisuje jako odvětví fyzikální chemie, zabývající se elektrickými a energetickými stránkami chemických dějů pozorovaných na stykové ploše mezi elektrodou a kapalným vodičem a to jak při průchodu proudu, tak za rovnovážného stavu. Elektrochemie má mnoho různých odvětví. Patří mezi ně elektroanalýza, elektrokapilarita, elektromigrace, elektroforéza, elektrochemická metalurgie (Palecek, 2002, Wikipedia, 2011) Elektroanalýza Elektroanalýza je skupina technik v analytické chemii, která studuje změny analytu na základě měření potenciálu nebo proudu v nádobě obsahující analyt. Elektroanalýza se rozděluje do tří základních skupin podle zkoumaných buněčných aspektů a typu jejich měření. Tyto hlavní kategorie jsou potenciometrie, coulometrie a voltametrie (Wikipedia, 2011) Voltametrie Voltametrie je skupina elektroanalytických metod. Informace o analytu se získávají měřením proudu při různém potenciálu. K správnému fungování jsou zapotřebí 2 elektrody pracovní (polarizovatelná) a referentní (nepolarizovatelná), tomuto zapojení se říká dvouelektrodové. V dnešní době se používá kromě pracovní a referentní elektrody i třetí pomocná elektroda (tzv. tříelektrodové zapojení), a to z důvodu eliminace rušivých vlivů, které plynou z dvouelektrodového zapojení. Při dvouelektrodovém zapojení je velmi obtížné udržovat konstantní potenciál na elektrodách, docházelo například k proudovému zatížení referentní elektrody. U tříelektrodového zapojení se zvyšuje i citlivost detekce v celém systému (Mikelova, a kol., 2007, Palecek, 2002) Pracovní elektrody Pracovní elektrody, tedy polarizovatelné elektrody, se obecně dělí do dvou základních skupin, a to na rtuťové a pevné elektrody. Další dělení elektrod může být podle jejich velikosti a to na makroelektrody (velikost jejich plochy se pohybuje 20

21 v cm 2 ), dále pak na minielektrody (DME a některé velké HMDE), semimikroelektrody (patří mezi ně některé HMDE), dalšími jsou mikroelektrody (těmi jsou meniskové elektrody) a posledními jsou ultramikroelektrody (UME). Se zmenšením elektrody dochází i ke zmenšení povrchu pracovní elektrody. Je tedy potřebné zajištění vyšší citlivosti na stanovování analytu (Adam, a kol., 2007, Hubalek, a kol., 2007, Huska, a kol., 2009, Huska, a kol., 2008), (Kizek, a kol., 2003) Rtuťové elektrody Kvůli dobrým elektrickým vlastnostem se nejčastěji využívají kovové elektrody, hlavní pozici mezi nimi má rtuťová elektroda, která má dokonale obnovitelný povrch kapky, díky tomu je její využití velice výhodné u elektroanalytického stanovení. Tento typ elektrody je díky vysokému přepětí vodíku na rtuti lépe polarizovatelný ve větším rozsahu negativních potenciálů (v porovnání s jinými kovovými elektrodami). Díky nasycené kalomelové elektrodě (saturated calomel electrode; SCE) také umožňuje pozorování dějů, které probíhají i ve značně negativních oblastech potenciálů. Rtuťové elektrody se dělí do dvou hlavních skupin a to na kapající rtuťovou elektrodu (dropping mercury electrode; DME) a visící rtuťovou kapkovou elektrodu (hanging mercury drop electrode; HMDE). DME je využívána především v polarografii, jejími výhodami je dobře definovatelný a snadno obnovitelný povrch kapky. Hlavní nevýhodou je velký nárok na objem analytu, který se pohybuje v mililitrech. HMDE se využívá především ve voltametrii. Hlavní předností této elektrody je, že celý průběh experimentu probíhá na jedné kapce, kde se studovaný analyt akumuluje a poté analyzuje (Huska, a kol., 2010, Vacek, a kol., 2004), (Almendras, a kol., 2009, Li, a kol., 2010) Pevné elektrody Kovové elektrody U kovových elektrod je možné dále modifikovat pracovní povrch, díky tomu se zvyšuje citlivost a selektivita dané elektrody. Povrch pevné kovové elektrody je možné pokrýt různými vrstvami. Nejznámější je pokrytí povrchu rtutí (vzniká filmová elektroda), dále pak může být pokryt lipidy apod. Dalším typem elektrody je elektroda, označována jako amalgámová, na níž vzniká amalgám po interakci kovu v elektrodě se rtutí. 21

22 22

23 Uhlíkové elektrody Uhlíkové elektrody se hojně využívají při studiu biologických látek jako doplnění rtuťových elektrod, protože je možné je polarizovat do oblasti kladných potenciálů, na rozdíl od rtuťových (HMDE), které lze polarizovat do nízkých oblastí kladných potenciálů (jen asi 0,2 V). Síťovaný sklovitý uhlík (reticulated vitreous carbon; RVC) se využívá v průtokové anlýze, kde uplatňuje své vlastnosti (vysoká pórovitost, která klade nízký odpor tekoucí kapalině). Hojně využívanou pevnou uhlíkovou pracovní elektrodou je elektroda, vyrobená ze skelného uhlíku (glassy carbon electrode; GCE), které je vyrobena z polymerních fenolformaldehydových živic, které se kontrolovaně zahřívají v inertní atmosféře. Další elektrodou je uhlíková elektroda z pyrolitického grafitu (pyrolitic graphite electrode; PGE), důležitou funkci má pastová uhlíková elektroda (carbon paste electrode; CPE), která se skládá ze směsi práškového uhlíku (85%) a oleje (15%). Přidáním příměsi do CPE nám vznikne modifikovaná pastová uhlíková elektroda. Příměsí může být nízko i vysoko molekulární látka. Pokud jako příměs do CPE bude místo oleje vosk, vznikne vosková uhlíková elektroda (WISGE) nebo parafínem impregnovaná grafitová elektroda (paraffin impregnated graphite electrode; PIGE) (Fojta, a kol., 2003, Masarik, a kol., 2003, Supalkova, a kol., 2006) Uhlíkové nanotrubice Uhlíkové nanotrubice jsou podlouhlé částice složené z atomů uhlíku. Jejich struktura je podobná fullerenům, na rozdíl od nich však mají válcovitý tvar (fullereny jsou kulovité). V přírodě se nanotrubice nevyskytují, v laboratoři byly poprvé připraveny v roce Průměr nanotrubic je 1 až 100 nm a jejich délka může být až 100 µm. Uhlíkové nanotrubice mohou být jednostěnné SWCNTs (Single Walled CNTs), které mají jednu stěnu o půměru 1-2nm či více stěnné MWCNTs (Multi Walled CNTs), které mají více stěn o souhrnné tloušťce 2-25 nm. Pole výzkumu uhlíkových nanotrubic je velmi aktivní a přitahuje velkou pozornost, protože nanotrubice mají zajímavé vlastnosti využitelné v elektrotechnice hlavně pro jejich velmi malý elektrický odpor a velký aktivní povrch. A dále pak termodynamice a mechanice (Hubalek, a kol., 2009, Huska, a kol., 2010, Ivanov, a kol., 2003). 23

24 Referentní elektrody Referentní elektroda je elektroda s časově stálým a přesně definovaným vlastním potenciálem. Tato elektroda funguje jako porovnávací bod pro nastavení potenciálu pracovní elektrody. Mezi nejvíce využívané referentní elektrody patří elektrody tzv. druhého druhu. Tyto elektrody jsou tvořeny kovem, na němž je tenká vrstva nerozpustné (případně málo rozpustné) soli a celá tato elektroda je následně ponořena do roztoku jejich anionů. Referentní elektrody se tedy uchovávají v roztocích a nesmí se nechat vysušit (Wikipedia, 2011) Pomocné elektrody Tyto elektrody jsou tvořeny z kvalitních, chemicky nereaktivních vodičů. Využívá se platina (plíšek či drátek) nebo uhlíková tyčinka. Referentní elektroda musí mít větší plochu než pracovní elektroda, aby se zajistilo, že na pracovní elektrodě bude vždy správný potenciál. Její hlavní funkcí je tedy zbavení se proudového zatížení, které je na referentní elektrodě, čímž se sníží její šum a možná chyba ve stanovení (Wikipedia, 2011). 24

25 IV. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3. MATERIÁL A METODY Všechny použité chemikálie byly A.C.S. čistoty. Pufry a roztoky byly vždy před započetím experimentu připravovány ze zásobních roztoků, které byly uchovávány při 4 C ve tmě Použité chemikálie Cd(NO 3 ) 2 a Pb(NO 3 ) 2 zakoupeny firmou Sigma Aldrich (St. Louis, USA) byly rozpuštěny v H 2 0 A.C.S. čistoty jako zásobní roztoky o koncentraci 1 M. Acetátový pufr o ph 5,6 se skládal z 0,2 M CH 3 COOH + 0,2 M CH 3 COONa. Fosfátový pufr se skládal z 0,1 M NaCl + 50 mm Na 2 HPO 4 + NaH 2 PO 4 a 0,2 M NaCl mm Na 2 HPO 4 + NaH 2 PO 4 Chitosan byl zakoupen od firmy Fluka. Minerální olej byl zakoupen od firmy Sigma Aldrich (St. Louis, USA) Příprava uhlíkové pastové elektrody mikrocpe: naváženo 0,02g Carbon, glassy, spherical powder 2-12um + 20 ul minerálního oleje, vše smícháno na achátové třecí misce nanocpe1: naváženo 0,02g Carbon, glassy, spherical powder 2-12µm + 0,006g NANOcarbon VUT, vnější průměr OD nm; vnitřní průměr ID = 5-15 nm; délka L = 0,5 200 µm + 30 µl minerálního oleje, vše smícháno na achátové třecí misce. nanocpe2: naváženo 0,02g Carbon, glassy, spherical powder 2 12 µm + 0,006 g NANOcarbon VUT, vnější průměr OD = 7-15nm; vnitřní průměr ID = 5-6nm; délka L = 0,5-200 µm; MWCNTS + 30 µl minerálního oleje, vše smícháno na achátové třecí misce Elektrochemická analýza Elektrochemická analýza byla prováděna na přístroji CHI 440A Electrochemical Workstation (CH Instruments, Inc., U.S.A.), řízený programem CHI Version ve tříelektrodové zapojení. Jako referenční elektroda byla použita 25

26 (Ag/AgCl, 3M KCl) a uhlíková tyčinka jako pomocná elektroda. Pracovní elektrodou byla CPE modifikovaná nanotrubicemi. Parametry metody: Int.E (V) = 0; FinalE (V) = -1,2; LncrE (V) = 0,004; Amplitude (V) = 0,005; Frequency (Hz) = 100; Quiet time (sec) = 0-500; Sensitivity (A/V) = 1.e -0, Rostlinný materiál V experimentech byla použita rostlina Kukuřice setá (Zea Mays L.) F1 hybrid Gila. Zrna kukuřice byly naklíčeny na vlhkém filtračním papíru ve speciálních nádobkách ve tmě při teplotě 23 ± 2 C. Po 7 dnech po naklíčení byly rostlinky umístěny do nádob obsahující vodovodní vodu a kultivovány v (MLR-350 H, Sanyo, Japan) po dobu 8 dnů se 14 hod světelnou periodou (maximální intenzita světla byla kolem 100 µe.m-2s-1) při teplotě 23,5 25 C a vlhkosti %. Rostliny rostoucí bez CdCl 2 byly použity jako kontroly. Další rostliny byly umístěny do nádob s vodovodní vodou, do které byl přidán CdCl 2 o koncentraci 0, 5, 10, 25, 50 a 100 µmol/l. 26

27 5. VÝSLEDKY A DISKUSE 5.2. Optimalizace stanovení kademnatých iontů pomocí elektrochemických metod Elektrochemie je pro svou vysokou citlivost, metodou velmi vhodnou pro stanovení těžkých kovů. Důvodem, proč uvažovat o stanovení Cd inotů pomocí elektrochemie, je i možnost zmenšení měřicí instrumentace do takových rozměrů, které by byly snadno přenosné a schopné mimo-laboratorních měření. V neposlední řadě nesmíme opomenout možnosti kombinovat fyzikálně-chemický převodník v podobě elektrody s biologickou složkou, kdy získáme biosenzor, který oproti výše zmíněným výhodám elektrochemie přináší do analytického systému prvek zvýšené selektivity (Krystofova, a kol., 2010, Majzlik, a kol., 2010). V současnosti roste stále větší zájem o uhlíkové pastové elektrody, které jsou modifikovány uhlíkovými nanotrubicemi. Předpokládá se, že přinesou výrazné zlepšení senzitivity ale i selektivity. V práci jsme použili uhlíkové nanotrubice vyrobené na VUT. Těmito nanotrubicemi byla modifikována uhlíková pastová elektroda, která byla dále použita pro stanovení kademnatých iontů. Jelikož se jedná zcela o originální nanotrubice, byla nejdříve nutná optimalizace stanovení iontů kadmia. Z důvodu posouzení funkčnosti modifikované CPE byla optimalizace provedena ne jen na Cd 2+ ale i Pb Vliv doby akumulace iontů Cd a Pb na odezvu signálu Prvním parametr, jenž byl studován, byla doba, po kterou je CPEn (uhlíková pastová elektroda modifikovaná nanotrubicemi) vystavena iontům Cd 2+ a Pb 2+. Zaznamenávala se proudová odezva v jednotkách na (nano ampéry), která byla následně vyjádřena v procentech. Na obrázku 4 můžeme vidět výsledný graf pro jednotlivé připravené mikro CPE, nano CPE1 a nano CPE2. Všechny elektrody byly vystaveny Cd 2+ a Pb 2+ iontům po dobu 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 a 200 sekund a následně bylo provedeno měření. Nejdříve byla studována mikrocpe jako kontrolní elektroda (Obrázek 4A). Vidíme, že s rostoucí dobou akumulace obou zkoumaných kovů se odezva signálu do doby 100 s výrazně neměnila. K mírnějšímu nárůstu signálu 12 % došlo u doby akumulace 120 a 160 s u iontů Cd 2+. Ionty Pb 2+ vykazovaly celkově nižší odezvu oproti iontů Cd 2+ Po té byl zaznamenán výrazný pokles obou signálů a to o %. I zde ale bylo detekováno mírné zvýšení signálu o 9 % u 120 s a u doby 27

28 Signal (%) Signal (%) Signal (%) akumulace 140 s bylo zvýšení o 13 %. Další měření bylo provedeno na nano CPE1 a nano CPE2 (Obrázek 4B a 4C). Obě nanouhlíkové elektrody se výrazně svým průběhem lišily od mikro CPE. Oba studované kovy poskytovali podobné signály u nano CPE2 dokonce olovnaté měli lepší odezvu než ionty kademnaté. U nano CPE1 jsme získali nejlepší odezvu signálu při době akumulace 100 s pro Cd 2+ a pro Pb s. Nano CPE2 poskytovala nejvyšší signály při 120 s pro Cd 2+ a 100 s pro Pb 2+. A) 120 mikro CPE 100 Cd Pb B) nano CPE1 Doba akumulace (s) 120 nano CPE2 C) 100 Cd Pb 100 Cd Pb Doba akumulace (s) Doba akumulace (s) Obr. 4 Závislosti doby akumulace kademnatých a olovnatých iontů na CPE elektrodách. A) mikrocpe, B) nanocpe, C) nanocpe2. 28

29 Signal (na) Signal (na) Vliv koncentrace Cd2+ a Pb2+ na odezvu signálu Optimalizací doby akumulace pro jednotlivé CPE jsme mohli přistoupit ke sledování vlivu koncentrace Cd 2+ a Pb 2+ na odezvu signálu mikrocpe Opět jsem nejdříve začali s mikrocpe (Obrázek 5). mikrocpe vykazovala symetrickédobře charakteristické signály. Z obrázku je patrné, že olovnaté ionty měly výrazně nižší odezvu o proti iontům kademnatým. Podíváme-li se ale na rozsah linearit dosáhli jsme u obou kouvů stejného limitu detekce 10 mm. Dále pro Cd inoty byl rozsah linearity od 100 0,1 mm s faktorem spolehlivosti R 2 = 0,97 naproti tomu pro Pb ionty byl rozsah linearity od 25 0,1 mm s faktorem splehlivosti R 2 = 0, Cd 2+ y = x R² = Mikro CPE Pb2+ y = x R² = Koncentrace Cd 2+ mm Koncentrace Pb 2+ mm Obr. 5 Závislosti koncentrací (mm) Cd 2+ a Pb 2+ na odezvu signálu pro mikrocpe nanocpe1 Závislosti koncentrace na odezvě signálu pro nanocpe1 ukazuje obrázek 6. nanocpe1 elektroda poskytovala charakterističtější signály. Pokud se ale podíváme na graf pro olovnaté ionty vidíme, že limitu detekce jsme dosáhli při 6 mm koncentraci, ale lineární rozsah byl od mm, R 2 = 0,99. U kademnatých iontů byl dosáhnut limit detekce 0,04 mm a linearita byla mezi 100 0,04 mm, R 2 = 0,97. 29

30 Signal (na) Signal (na) Signal (na) Signal (na) y = x R² = Nano CPE1 Cd 2+ Pb y = x R² = Koncentrace Cd 2+ mm Koncentrace Pb 2+ mm Obr. 6 Závislosti koncentrací (mm) Cd 2+ a Pb 2+ na odezvu signálu pro nanocpe nanocpe2 Poslední testovaná elektroda nanocpe2 poskytovala nejlepší elektrochemický signál. Limity detekce byly pro Cd ionty 0,02 mm a pro Pb ionty 0,08 mm (Obrázek 7). Lineární oblast pro Cd 2+ byla mezi 100 0,02 mm s R 2 = 0,98 a pro Pb 2+ byla linearita mezi 25 0,08 mm s faktorem spolehlivosti R 2 = 0, y = x R² = Nano CPE2 Cd 2+ Pb y = x R² = Koncentrace Cd 2+ mm Koncentrace Pb 2+ mm Obr. 7 Závislosti koncentrací (mm) Cd 2+ a Pb 2+ nanocpe2. na odezvu signálu pro 30

31 Signal (na) Signal (na) 5.3. Modifikace uhlíkových pastových elektrod chitosanem Optimalizací detekce kademnatých a olovnatých iontů na vybraných CPE elektrodách jsme získali základní představu o jejich funkčnosti. Přesto, že nanotrubicemi modifikované CPE dosáhly celkově lepších výsledů než mikrocpe, limity detekce přesto zůstávají vysoké (µm). Dalším cílem tedy bylo, limity detekce snížit na koncentrace (nm). Pro tento cíl jsme zvolili další modifikaci CPE elektrod a to látkou chitosan. Chitosan je polysacharid výraběný deacetylací chitinu, který je obsažen například vnějších kostrách korýšů. Má schopnost na sebe vázat těžké kovy i některé jiné látky, a proto se také používá v čističkách vod. Přidáním do uhlíkové pasty výrazně zvyšuje citlivost a detekční limit (Huang, a kol., 2002, Xiang, a kol., 2007) mikrocpe modifikovaná chytosanem Modifikovaná mikro CPE chitosanem vykazovala zvýšenou citlivost ke zkoumaným těžkým kovům a výraznou stabilitu elektrochemického signálu. Signály jsou lineárně závislé na koncentraci a mají stabilnější pozici oproti nemodifikovaným elektrodám. Limitu detekce jsme dosáhli na hodnotě 180 nm (Cd 2+ ) a 400 nm (Pb 2+ ). Jednotlivé kalibrační křivky jsou znázorněny na obrázku y = 0.182x R² = chitosan mikro CPE Cd 2+ Pb y = x R² = Koncentrace Cd 2+ nm Koncentrace Pb 2+ nm Obr. 8 Závislosti koncentrací (nm) Cd 2+ a Pb 2+ na odezvu signálu pro chitosan mikrocpe. 31

32 Signal (na) Signal (na) Signal (na) Signal (na) nanocpe1 a nanocpe2 modifikovaná chytosanem Modifikací nano uhlíkových pastových elektrod, jsme dosáhli limitu detekce 100 nm u nanocpe1 a 10 nm u nanocpe2, přičemž oba kovy poskytovali velmi dobře vyvinuté symetrické píky. U kademnatých iontů odezva signálu se vzrůstající koncentrací lineárně roste od nm podle rovnice y = 0.393x s faktorem spolehlivosti R 2 = (Obrázek 9). Olovnaté ionty měli i zde horší odezvu. Lineární křivka byla v rozsahu hodnot nm podle rovnice y = 0.722x s faktorem spolehlivosti R² = (Obrázek 10) y = 0.393x R² = chitosan nano CPE1 Cd 2+ Pb y = 0.722x R² = Koncentrace Cd 2+ nm Koncentrace Pb 2+ nm Obr. 9 Závislosti koncentrací (nm) Cd 2+ a Pb 2+ na odezvu signálu pro chitosan nanocpe Cd 2+ y = x R² = chitosan nano CPE Pb 2+ y = 0.378x R² = Koncentrace Cd 2+ nm Koncentrace Pb 2+ nm

33 Obr. 10 Závislosti koncentrací (nm) Cd 2+ a Pb 2+ na odezvu signálu pro chitosan nanocpe Sledování vlivu kademantých iontů na Zea mays L. Po optimalizaci a charkterizaci elektrochemické detekce kademnatých a olovnatých iontů jsme mohli přistoupit k biologické části experimentu a to ke sledování vlivu Cd 2+ na růst a morfologické změny Zea mays L. a na syntézu fytochelatinů. Rostliny vystavené abiotickému stresu jsou nuceny zvýšit syntézu různých biologicky aktivních molekul, jako jsou sloučeniny obsahující volné SH skupiny (glutathion, fytochelatiny, metalothioneinu a podobné proteiny). Řada takových molekul je syntetizována chemickou reakcí. Existují rozličné metody pro analýzu tiolových sloučenin (Babula, a kol., 2010, Zehnalek, a kol., 2004, Zehnalek, a kol., 2004). Nejčastěji se využívá vysoce účinná kapalinová chromatografie ve spojení s různými typy detektorů. K charakterizaci tiolových sloučenin lze také využít elektrochemických metod, jako jsou diferenční pulzní volumetrie 8 či chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza 19, kde nachází své uplatnění kromě visící rtuťové kapkové elektrody také pevné elektrody (Zitka, a kol., 2009, Zitka, a kol., 2009, Zitka, a kol., 2007) Vliv kademnatých iontů na růst Zea mays L. Rostliny byly vystaveny abiotickému stresu způsobeným kademnatými ionty o koncentraci 0, 5, 10, 25, 50 a 100 µmol/l. Rostliny rostly po dobu 8 dnů se 14 hod světelnou periodou (maximální intenzita světla byla kolem 100 µe.m -2 s -1 ) při teplotě C a vlhkosti %. Vzorky byly odebrány po 10 dnech růstu. Na obrázku 11 můžeme vidět fotografie testovaných rostlin při zvolených koncentracích Cd 2+. Vidíme, že rostliny bez vlivu Cd 2+ (0 µmol/l Cd 2+ ) vykazovaly zcela normální růst bez žádné inhibice, tyto rostliny sloužily po celou dobu experimentu jako kontrolní vzorky. U koncentrace 5 µmol/l Cd 2+ byl zaznamenán aktivnější růst a rostliny nevykazovaly žádné morfologické změny naopak zde došlo k mírné stimulaci růstu. Od koncentrace 10 µmol/l Cd 2+ byly vidět morfologické změny a postupná inhibice růstu. Největší deformace rostlinných orgánů a inhibice v růstu byly zaznamenány při koncentraci 100 µmol/l Cd

34 0 mol/l 5 mol/l 10 mol/l 25 mol/l 50 mol/l 100 mol/l Obr. 11 Rostliny kukuřice (Zea mays L.)kultivované za přítomnosti kademnatých iontů o konentraci ( 0, 5, 10, 25, 50 a 100 µmol/l) Růstové závislosti Růstové závislosti rostlin kukuřice délka (mm) podzemní i nadzemní části v závislosti na množství Cd 2+ jsou ukázány na obrázku 12. Hnědé sloupečky ukazují podzemní část a zelené nadzemní část rostliny. Vzorky byly odebrány 10 dne růstu. Výsledky ukazují, že se zvyšující se koncentrací Cd 2+ v roztoku rostla i inhibice růstu. U podzemní části byla pozorována inhibice, tedy kořeny rostly pomaleji oproti kontrole. Nadzemní část rostliny vykazovala u koncentrace 5 µmol/l Cd 2+ mírný nárůst a aktivnější růst oproti kontrole. Vysvětlit si to můžeme aktivizací biosyntézy obraných biomolekul jako je glutation a fytochelatiny a celkově zvýšením metabolické aktivity jako obrany proti kademnatým iontům. Jak ukazuje obrázek 12 ale vidíme, že od koncentrace 10 µmol/l Cd 2+ dochází už k výrazné inhibici růstu. 34

35 Délka podzemní části (mm) Délka nadzemní části (mm) 160 Podzemní část 45 Nadzemní část Koncentrace µmol/l Cd Koncentrace µmol/l Cd 2+ Obr. 12 Růstové charakteristiky rostliny kukuřice (Zea mays L.)kultivované za přítomnosti kademnatých iontů o konentraci ( 0, 5, 10, 25, 50 a 100 µmol/l). Hnědé sloupečky ukazují podzemní část a zelené nadzemní část rostliny a jejich délku v mm Vliv Cd 2+ na aktivitu γ-glutamyltransferázy GMT (µcat l -1 ) v Zea mays. GMT - γ-glutamyltransferáza EC patří mezi enzymy hrající hlavní roli při transportu vybraných aminokyselin a peptidů přes buněčnou membránu buněk. Aminokyselina se váže do aktivního centra enzymu. Pro přenos aminokyseliny do cytoplazmy je zapotřebí ji uvolnit z přenašeče. Tím mechanizmem je γ glutamyl, který se váže na příslušnou aminokyselinu a vzniká tak dipeptid. Ten může být následně z přenašeče uvolněn. Molekula poskytující γ glutamyl se nazývá glutathion -GSH (gamaglutamylcysteinylglycin). Po přenesení příslušné aminokyseliny musí být GSH opět syntetizován v gamaglutamylový cyklu, přičemž se spotřebovávají 3 ATP. Glutathion je buňkou využíván např. jako antioxidační látka, chránící buňku před různými oxidanty. GMT hraje klíčovou roli v metabolismu této, pro buňku velmi významné, sloučeniny. Výsledky z experimentu ukazuje obrázek 13. Celková aktivita GMT u pozdemní části rostliny se od koncentrace 5 µmol/l Cd 2+ snížila téměř o 60% tento 35

36 GMT (µcat l -1 ) GMT (µcat l -1 ) pokles pak trval i u další koncentracích 10, 25, 50 a 100 µmol/l Cd 2+. Naproti tomu u nadzemní části, zelené sloupečky, se aktivita GMT postupně zvyšovala. Od koncentrace 25 µmol/l Cd 2+ byl nárůst o téměř 30 % u vyšších koncentracích nedocházelo v aktivitě GMT k výrazným změnám. Celkově u kontrolních vzorků byla aktivita GMT vyšší u podzemní části o proti části nadzemní. 1.4 Podzemní část 0.75 Nadzemní část Koncentrace µmol/l Cd 2+ Koncentrace µmol/l Cd 2+ Obr. 13 Aktivita enzymu GMT γ-glutamyltransferáza EC (µcat l -1 ) u rostlin kukuřice (Zea mays L.)kultivované za přítomnosti kademnatých iontů o konentraci ( 0, 5, 10, 25, 50 a 100 µmol/l). Hnědé sloupečky ukazují podzemní část a zelené nadzemní část rostliny Vliv Cd 2+ na množství fytochelatinů v Zea mays. Posledním experimentem bylo stanovení celkových fytochelatinů (PCs) obrázek 14. Dle výsledků jde vidět, že množství fytochelatinů jak v nadzemní tak i podzemní části rostlin v koncentraci 5 µmol/l Cd 2+ bylo zaznamenáno o zhruba 50% méně PCs než u kontroly. Pokud se ale podíváme na koncentraci 10 µmol/l Cd 2+ celkové množství PCs opět vzrostlo. Působením dalších koncentracích se u podzemní části rostlin množství PCs výrazně neměnilo. Tento trend ale nebyl zaznamenán u nadzemní části. Zde působením vyšších koncentracích kademnatých iontů docházelo k poklesu hladiny PCs oproti kontrole o 60%. Což je podle hypotézy následkem právě narušením proteosyntézy, fotosynetického aparátu, narušením permeabilit membrán a samotné syntézy PCs. 36

37 Množství PCs (%) Množství PCs (%) 120 Podzemní část 120 Nadzemní část Koncentrace µmol/l Cd 2+ Koncentrace µmol/l Cd 2+ Obr. 14 Množství celkových PCs u rostlin kukuřice (Zea mays L.) kultivované za přítomnosti kademnatých iontů o konentraci ( 0, 5, 10, 25, 50 a 100 µmol/l). Hnědé sloupečky ukazují podzemní část a zelené nadzemní část rostliny. 37

38 VI. ZÁVĚR Přítomnost toxických kovů v našem životním okolí je velmi vážný problém a zasluhuje si naší plnou pozornost. Uhlíkové pastové elektrody mají velký potenciál při konstrukci biosenzorů. Jejich různě modifikace, které jim zvyšují limit detekce a stabilitu elektrochemického signálu, je pořád přibližují k vlastnostem současného přijatého standardu visící rtuťové kapkové voltametrie, ale mohou být zabudovány do přenosných přístrojů, kde se sníží jak cena přístroje tak i náročnost kvalifikovaného pracovníka při měření v in-situ podmínkách. Tato metoda byla aplikována na reálné vzorky rostlin ovlivněné koncentracemi kademnatých iontů a byla sledována změna hladiny těchto látek v analyzovaných rostlinách ve srovnání s kontrolou. 38

39 VII. LITERATURA ADAM, V.; BEKLOVA, M.; PIKULA, J.; HUBALEK, J.; TRNKOVA, L.; KIZEK, R. Shapes of differential pulse voltammograms and level of metallothionein at different animal species. Sensors, 2007, roč. 7. č. 10, s ISS clanek IF ADRIANO D. C. SPRINGER VERLAG, N. Y., 866 S., ISBN Trace Elements in Terrestrial Environments. New York: Springer Verlag, (2001). AHMAD, P.; SARWAT, M.; SHARMA, S. Reactive oxygen species, antioxidants and signaling in plants. Journal of Plant Biology, 2008, roč. 51. č. 3, s ISS ALMENDRAS, M. L.; CARBALLA, M.; DIELS, L.; VANBROEKHOVEN, K.; CHAMY, R. Prediction of Heavy Metals Mobility and Bioavailability in Contaminated Soil Using Sequential Extraction and Biosensors. Journal of Environmental Engineering-Asce, 2009, roč č. 9, s ISS ARTHUR, E. L.; RICE, P. J.; ANDERSON, T. A.; BALADI, S. M.; HENDERSON, K. L. D.; COATS, J. R. Phytoremediation - An overview. Critical Reviews in Plant Sciences, 2005, roč. 24. č. 2, s ISS BABULA, P.; OPATRILOVA, R.; KRYSTOFOVA, O.; ZEHNALEK, J.; ADAM, V.; HAVEL, L.; KIZEK, R. THE IMPORTANCE AND EFFECTS OF COPPER ON PLANTS. Listy Cukrovarnicke a Reparske, 2010, roč č. 11, s ISS BATKOVA, P.; POSPISILOVA, J.; SYNKOVA, H. Production of reactive oxygen species and development of antioxidative systems during in vitro growth and ex vitro transfer. Biologia Plantarum, 2008, roč. 52. č. 3, s ISS BERTIN, G.; AVERBECK, D. Cadmium: cellular effects, modifications of biomolecules, modulation of DNA repair and genotoxic consequences (a review). Biochimie, 2006, roč. 88. č. 11, s ISS COBBETT, C. S. Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification. Plant Physiology, 2000, roč č. 3, s ISS FLORIJN, P. J.; VANBEUSICHEM, M. L. CADMIUM DISTRIBUTION IN MAIZE INBRED LINES - EFFECTS OF PH AND LEVEL OF CD SUPPLY. Plant and Soil, 1993, roč č. 1, s ISS X. FLORIJN, P. J.; VANBEUSICHEM, M. L. UPTAKE AND DISTRIBUTION OF CADMIUM IN MAIZE INBRED LINES. Plant and Soil, 1993, roč č. 1, s ISS X. FOJTA, M.; HAVRAN, L.; BILLOVA, S.; KOSTECKA, P.; MASARIK, M.; KIZEK, R. Two-surface strategy in electrochemical DNA hybridization assays: Detection of osmium-labeled target DNA at carbon electrodes. Electroanalysis, 2003, roč. 15. č. 5-6, s ISS clanek IF GILL, S. S.; TUTEJA, N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 2010, roč. 48. č. 12, s ISS GREENE, D. Effects of lead on the environment. The journal of The LEAD, 1993, roč. 1. č. 2, s. ISS