Vliv prostředí na růst a množení mikrobiálních populací. Doc. RNDr. Jarmila Pazlarová, CSc.

Transkript

1 Vliv prostředí na růst a množení mikrobiálních populací Doc. RNDr. Jarmila Pazlarová, CSc.

2 Vlivy na růst mikroorganismů Teplota ph prostředí Vodní aktivita Oxidoredukční potenciál Povrchové napětí Záření Hydrostatický tlak Elektrický proud Ultrazvuk Záření Mechanické vlivy Působení antimikrobiálních látek Biologické vlivy

3 Faktory ovlivňující růst mikroorganismů v potravinách Vnitřní : živiny, ph, redox potenciál, vodní aktivita,antimikrobiální aktivity Vnější: vlhkost, teplota, atmosféra Implicitní: specifická růstová rychlost, synergismus, antagonismus, komensalismus Technologické: krájení, mytí, balení, záření, pasteurizace

4 Vnitřní faktory Nutrienty výživné látky ph a pufrační kapacita Redox potenciál Vodní aktivita Antimikrobiální látky Antimikrobiální struktury

5 Živiny Zdroj energie Materiál k tvorbě a obnově buněčných struktur C,O,N,S,P - cukry, polysacharidy Fe, Mg, K, Ca, Na Stopové prvky Zn, Cu, Co Speciální požadavky autotrofní, auxotrofní atd.

6 Obsah živin Koncentrace klíčových živin může do určité míry ovlivnit rychlost růstu mikroorganismů. Vztah mezi rychlostí růstu a koncentrací živiny je znám jako Monodova rovnice, je matematicky identický rovnicí Michaelis-Menten (enzymová kinetika). Odráží závislost mikrobiálního růstu na rychlost limitující enzymové reakci.

7 Specifická růstová rychlost Specifická růstová rychlost µ je pro každý mikroorganizmus, typ výživného média a způsob kultivace odlišná. Její hodnota je dána vnitřními faktory, tj. vlastními růstovými schopnostmi mikroorganismu, vnitřními limity jeho růstu, které jsou určené genetickým vybavením buňky.

8 Vliv výživy na růst mikroorganismů Monodova rovnice μ = μ m S / S + K s μ specifická růstová rychlost μ m maximální specifická růstová rychlost S koncentrace limitující živiny K s saturační konstanta

9 ph prostředí Pro bakterie a kvasinky je rozmezí poměrně úzké, u většiny plísní podstatně širší Bakterie? Kvasinky? Plísně?

10 ph prostředí min opt max B.subtilis 4,3 6,0-7,5 8,5 S. cerevisiae 3,0-3,8 4,2-5,0 7,3-7,5 A.niger 1,2 3,0-8,0 11,0

11 ph Bakterie slabě kyselé až slabě alkalické ph Kvasinky preferují kyselé prostředí Plísně tolerují velmi široké rozmezí

12 ph prostředí Bakterie v trávicím traktu Kyselinotvorné bakterie Hnilobné velmi citlivé ůči nízkému ph Vnější ph ovlivňuje regulační procesy metabolismu v buňce Alkalické prostředí tvorba glycerolu u kvasinek Neutralizací kyselin se zvyšuje tvorba kys. mléčné V koncentrovaných cukerných roztocích se tvoří kys. máselná na úkor acetonu a butanolu Odolnost vůči zvýšeným teplotám spory ph 4,3

13 Oxidoredukční potenciál Oxidoredukční potenciál je dán přítomností oxidačních nebo redukčních činidel Oxid.čin.: kyslík, dusičnany, železité ionty, peroxidy, železnaté ionty, vodík, sloučeniny se sulfhydrylovou skupinou nebo s reaktivními dvojnými vazbami Redukční činidla : cystein, askorbová kyselina, CO 2, vodík, thioglykolát sodný)

14 Oxidoredukční potenciál Oxidační redukční potenciál E H je rozdíl potenciálu mezi platinovou elektrodu umístěnou do daného prostředí a normální vodíkovou elektrodou Silně oxidační látky pozitivní Silně redukční negativní Aerobní mikroorganismy pozitivní Anaerobní mikroorgansimy - negativní

15 Redox potenciál - Eh

16 Vodní aktivita Potřeba vody je vyjádřena vodní aktivitou prostředí, ve kterém se buňky mohou rozmnožovat Vodní aktivita roztoku a H20 čili a w se rovná poměru tlaku vodních par nad tímto roztokem k tlaku vodních par nad destilovanou vodou

17 Vodní aktivita Vztah vodní aktivity ke koncentraci rozpuštěné látky N w a w = N w + N s N w - počet molů vody N s počet molů rozpuštěné látky

18 Aktivita vody - a w Snížení aktivity vody: odstranění využitelné vody sušením, uzením, odpařením, mražením zvýšení obsahu tuku zvýšení koncentrace rozpuštěných látek v prostředí (cukry - sacharosa, NaCl) zvýšení osmotického tlaku (hypertonické prostředí) difuze vody z buňky do prostředí zastavení metabolizmu až smrt buňky

19 Vodní aktivita Vodní aktivita vody je 1 Bakterie 0,99 0,93 (0,65 0,63) halofilní 15%,halotolerantní 10% NaCl (Micrococcus, Staphylococcus) Kvasinky 0,91-0,88 Osmotolerantní 0,73 (60% sacharosa) Zygosaccharomyces rouxii, Z. bailii) Plísně nižší než b. a kv., vyjímka vodní plísně Osmofilní plísně 0,60 A. glaucus

20 Vodní aktivita Sušení Zvýšení koncentrace rozpuštěných látek odpařováním Sacharosa 50-70% Chlorid sodný 10-15% Vnitrobuněčný tlak 0,35 do 0,6 MPa Osmofilní 30 MPA

21 Aktivita vody - aw

22 Působení antimikrobiálních látek Zastavení rozmnožování mikrobistatické Usmrcení mikrobicidní Bakteriostatické, bakteriocidní Fungistatické, fungicidní Nižší koncentrace - stimulační účinek

23 Působení antimikrobiálních látek Rozdělení : 1. Látky poškozující strukturu buňky nebo její funkci penicilin, polyenová antibiotika (Streptomyces) buněčná stěna rozpuštědla tuků, anionaktivní tenzidy, polyenová antibiotika (Bacillus), fenoly, inhibitory transportu cytoplasmatická membrána formadehyd, silná oxidační činidla, silná redukční činidla bílkoviny chloramfenikol, erythromycin ribozomy bakterií cyklohexiimid ribozomy kvasinek 2. Látky působící na mikrobiální enzymy těžké kovy (Hg) 3. Látky reagující s DNA alkylační činidla, deaminační činidla,cytostatika, mitomycin C

24 Přirozené antimikrobiální látky laktoperoxidasa (mléko), lysozym (vaječný bílek), saponiny a flavonoidy (byliny a koření), bakteriociny (LAB), a chitosan - krunýře korýšů Antimikrobiální látky přítomné v potravinách a koření byly přidávány ke zlepšení chuti.

25 Rostlinné antimikrobiální látky Antimikrobiální látky v rostlinách jsou běžně esenciální oleje, v listech (rozmarýn, šalvěj, bazalka, oregáno, tymián, majoránka, petržel) nebo v květech a pupenech (hřebíček), cibulkách (česnek a cibule), semenech (kmín, fenykl, muškátový ořišek).

26 Vnější faktory- environmentální relativní vlhkost teplota atmosféra

27 Relativní (poměrná) vlhkost vzduchu Relativní vlhkost vzduchu udává poměr mezi okamžitým množstvím vodních par ve vzduchu a množstvím par, které by měl vzduch o stejném tlaku a teplotě při plném nasycení. Udává se v procentech (%). Relativní vlhkost se též někdy označuje jako poměrná vlhkost. Je-li m hmotnost vodní páry, která je ve vzduchu obsažena, a M hmotnost vodní páry, kterou by obsahoval stejný objem vzduchu, kdyby byl při stejné teplotě a tlaku vodními parami nasycen, pak lze relativní vlhkost vzduchu vyjádřit jako ϕ = 100 m / M [%]. Tento vztah lze s pomocí výrazu pro absolutní vlhkost vzduchu přepsat ve tvaru ϕ = 100 Φ / Φn [%],kde Φn označuje absolutní vlhkost vzduchu nasyceného vodními parami.

28 relativní vlhkost Relativní vlhkost vzduchu udává poměr mezi okamžitým množstvím vodních par ve vzduchu a množstvím par, které by měl vzduch o stejném tlaku a teplotě při plném nasycení. Udává se v procentech (%). Relativní vlhkost se též někdy označuje jako poměrná vlhkost. Hlavním omezujícím faktorem je teplota vzduchu, neboť pro danou teplotu je vzduch schopen pojmout jen omezené množství vodních par.

29 Teplota Psychrofilní opt. tep. nižší než 20 o C a rostou při teplotách 0 5 o C - psychrotrofní se rozmnožují dosti rychle při teplotách 0-10 o C bez ohledu na optimální teplotu Pseudomonas, Micrococcus, Flavobacterium Mesofilní minimální teplota vyšší než 5 o C a optimální nižší než 45 o C bakterie 37 o C, kvasinky 30 o C

30 Teplota Tři základní body teploty: Minimální nejnižší teplota, při níž se daný druh rozmnožuje ještě zjistitelnou rychlostí Optimální rozmnožuje se nejvyšší rychlostí Maximální- nejvyšší teplota, při které je daný druh ještě schopen se rozmnožovat

31 Teplota Stanovení minimální teploty je poměrně obtížné postupně klesá Optimální cca o 30 o C vyšší než minimální Maximální o cca 5-10 o C vyšší než optimální Teplotní šok syntéza heat shock proteins Optimální teplota růstu x optimální teplota pro ostatní pochody v buňce ts- mutanty permisivní teplota - restriktivní teplota

32 Teplota Termofilní opt. tepl.45 o C a vyšší o C, B. stearothermophilis 80 o C, archebakterie více než 100 o C Nerozmnožují se při teplotách kolem o C rody: Bacillus, Clostridium (C. thermosacharolyticum) Lactobacillus (L.delbrueckii var. bulgaricus) Thermoactinomyces, Thermomonospora

33 Teplota Smrtící (letální) teplota nejnižší teplota, při které je mikroorganismus usmrcen během určité doby (10 min.) Mesofilní: o C, po dobu min. Sporotvorné: 120 o C, po dobu min. Spory kvasinek a plísní : o C, 10 min. Phialospora, Paecilomyces, Byssochlamys

34 Teplota Termální smrtící teplota- nejkratší doba pro usmrcení mikroorganismu za dané teploty Vztah mezi letální teplotou a dobou potřebnou k usmrcení mikroorganismu je dána letalitní křivkou Technická sterilace nekyselých konzerv ( Bacillus coagulans, termofilní druhy) Kyselé konzervy?

35 Teplota Chladový šok Staphylococcus aureus poměrně odolný B. stearotermophilus na 20 o C ztrácí životnost C. perfringens na 4 o C (95% buněk odumírá) Pomalé zmrazování Rychlé zmrazení Zmrazené potraviny!!!

36 Vliv teploty na růst Optimální teplota pro rozmnožování se musí shodovat s optimální teplotou pro ostatní procesy buňky. S.cerevisiae má optimální teplotu růstu o 5 až 8 o C vyšší než je T pro tvorbu askospor. Působením mutagenních prostředků byly získány mutanty senzitivní k teplotě (ts-mutanty), které mají výrazně sníženou jak maximální, tak optimální teplotu. Tyto mutanty mají některý nezbytný enzym více termolabilnější, než mají nezmutované kmeny.

37 Povrchové napětí Povrchové napětí a špatná smáčelivost - blanka (křís) Plísně Tenzidy: Anionaktivní tenzidy (mýdla) Kationaktivní tenzidy Neionogenní tenzidy (Tween)

38 Povrchové napětí Anionaktivní - ve vyšších koncentracích poškozují cyt.m., denaturace bílkovin, alkyl sulfáty, alkylsulfonáty Kationaktivní ve velmi nízkých koncentracích mají silné antimikrobiální účinky, smáčecí účinnost poměrně malá, kvarterní amoniové nebo pyridiniové soli

39 Záření Elektromagnetické záření o různých vlnových délek Infračervené záření a Hertzovy vlnynejdelší vlnové délky nemají smrtící účinek na mikroorganismy, působí tepelnými účinky Viditelné světlo ( nm) UV záření ( nm) letální účinek 265 nm NK, malá pronikavost

40 Záření Roentgenovo záření, γ-záření, kosmické záření (kratší než 10 nm), silné mutagenní a letální účinky, působí na DNA, vyvolávají tvorbu volných radikálů a oxiranu)- indukují zlomy chromozomů Nejcitlivější jsou G - bakterie, kvasinky a plísně oddolnější, vysoká odolnost Deinococcus radiodurans, D. radiophilus, D. proteolyticus) Mikroorganismy odolnější než člověk (až 4x) Vliv přítomnosti kyslíku (-), zmrazení, vysušení

41 Složení atmosféry Skladování potravin v řízené atmosféře plynů má ochranný účinek Vakuově balené potraviny (v obalech nepropustných pro kyslík) CO 2 brání růstu aerobní mikroflóry, používá se při skladování ovoce a zeleniny, nesmí se používat pro potraviny s vysokým obsahem tuku, protože má silné oxidační účinky a způsobuje žluknutí tuků

42 UV záření UV záření má vlnovou délku pod 450 nm a kvantum energie od 3-5 ev (10 12 ). Tato kvanta poskytují dost energie pro excitaci elektronů v molekulách, z jejich základního stavu na energeticky vyšší orbitaly a tak jsou molekuly reaktivnější. Chemické reakce v mikroorganismech takto indukované mohou působit selhání kritických metabolických procesů vedoucích k poškození nebo smrti.

43 UV záření Největší letalitu UV záření vykazuje vlnová délka okolo 260 nm, což odpovídá silné absorpci bazemi nukleových kyselin. Fotochemická dimerizace thyminů. Obecně, rezistance k UV záření stoupá od: Gram-negativních Gram-pozitivním = kvasinky bakteriální spory spory plísní virusy

44 Hydrostatický tlak Většina mikroorganizmů se rozmnožuje za normálního atmosférického tlaku. Zvýšení tlaku na MPa rozmnožování zpomaluje a MPa zcela zastavuje. Některé bakterie se dobře rozmnožují i při tlaku 60 MPa barofilní x barotolerantní (v hlubinách moří)

45 Hydrostatický tlak Zvýšení tlaku MPa zpomalení růstu MPa rozmnožování se zastaví Působení tlaků zmírní teplota o C moře - barofilní barotolerantní 60 MPA negativní působení na syntézu buněčné stěny 5-60 MPa anomalie v dělení buněk, replikace DNA, prodloužení lag fáze Usmrcení : MPa (minuty až hodiny) spory Bacillus MPa/hod

46 Faktory ovlivňující růst mikroorganismů v potravinách Vnitřní faktory Faktory prostředí Nepřímé faktory- implicitní Faktory zpracování

47 Implicitní - nepřímé faktory Specifická růstová rychlost Mutualismus Antagonismus Komensalismus

48 Implicitní faktory Specifická růstová rychlost individuální vlastnost geneticky kódovaná Synergismus spolupráce více druhů Antagonismus negativní ovlivňování různých typů mezi sebou Komensalismus -jedna populace využívá jinou bez jejího poškozování - jeden má ze vztahu prospěch zatímco druhý není ovlivněn

49 Biologické vlivy Komensalismus volné sdružení mikroorgansimů jež si ani neprospívají ani neškodí Mikroflora úst, kůže Syntrofismus (synergismus) určité mikroorganismy mohou žít v prostředí pouze v přítomnosti jiných Aerobní x anaerobní Kefírová kultura Symbiosa vzájemné soužití mikroorganismů prospěšné pro oba Řasy a houby Antagonismus- jeden druh působí nepříznivě na ostatní BMK a hnilobné bakterie Producenti antibiotik a citlivé druhy - Streptomyces Parazitismus- jeden organismus využívá vnitrobuněčných intermediátu metabolismu jiného mikroorgansimu Plísně na na konidích Aspergillus niger Saprofytismus růst na dumřeluých tělech rostlin nebo živočichů Metabiosa produkty jedněch organismů jsou postupně využívány jinými Kvasinky-alkohol a octové bakterie - ocet

50 Faktory ovlivňující růst mikroorganismů v potravinách Vnitřní faktory Faktory prostředí Nepřímé faktory- implicitní Faktory zpracování

51 Technologické faktory - související s konečným zpracováním a úpravou Krájení Mytí Balení Ozařování Pasterace

52 Mechanické vlivy Mechanické rozrušení buněk malé rozměry buněk neumožňují přímé sekání. Při kultivaci v míchaných reaktorech střižné síly Abrazivní materiál Rozmrazování a rozmrazování zmrazení a protlačení úzkou štěrbinou za pomoci vysokého tlaku- drcení 80-90% buněk

53 Elektrický proud Střídavý el.proud intensita ma nemá vliv Stejnosměrný el.proud nepřiznivě působí elektrolytickými účinky

54 Ultrazvuk Zvukové vlny o frekvenci vyšší než 20 khz, působí letálně jsou-li intenzivní (10 W/cm 2 ) tzv. Kavitační ultrazvuk- pulsace buněčných membrán a plasmy Nejcitlivější jsou dlouhé tyčinkové a vláknité mikroorganismy, koky a kvasinky poměrně odolné nemá 100% letální účinek Nekavitační ultrazvuk (1 MHz a s nízkým rozkmitem) se používá k lékařským účelům

55 Mikrovlné záření Mikrovlné záření, tj. oblast emitovaného spektra obsahuje frekvence mezi 10 9 Hz až po Hz a proto má relativně nízké kvantum energie. Microvlny působí nepřímo na mikroorganismy tím, že tvoří teplo. Když je potravina obsahující vodu umístěna do působení mikrovln, dipolární molekuly vody se spolu spojují. Jelikož pole působení mění svou polaritu 2 nebo 5 x 10 9 krát každou sekundu v závislosti na typu použité frekvence, molekuly vody neustále oscilují. Tato kinetická energie je předávaná sousedním molekulám a vede k rychlému růstu teploty v celé potravině.

56 Mikrovlné záření Základním problémem spojeným s domácím užitím mikrovlných ohřívačů je nestejnoměrné ohřívání potraviny, vzhledem k přítomnosti studených míst v troubě, a různé dielektrické vlastnosti (nehomogenost) ošetřované potraviny. Takto mohou vznikat studená místa v potravinách takto ohřívaných a je zde riziko spojené s konzumací neadekvátně tepelně upravenho jídla. Mělo by to být lépe vysvětleno v návodech k použití pro mikrovlné trouby.

57 Technologie překážek Kombinací různých faktorů vzniká řada překážek, které musí mikroorganizmy překonat. I když jednotlivé faktory nejsou dostatečné k zabránění růstu MO, jejich kombinací dochází k zesílení účinku. Čím nepříznivější překážka, tím vyšší úsilí musí mikroorganizmy vyvinout.

58 Prediktivní mikrobiologie Jedná se o popis odpovědi mikroorganizmů k jednotlivým podmínkám prostředí hlavně teplota, ph a vodní aktivita. Používá matematické modely (získané laboratorním testováním) a počítačový software ke grafickému popisu odpovědi. Modely PM nenahrazují laboratorní analýzy nebo úsudek zkušeného potravinářského mikrobiologa. ComBase prediktivní modely sbírka softwaru založeného na datech z ComBase k předpovědi růstu nebo inaktivace mikroorganizmů.

59

60 FAO/WHO definice probiotik Jsou to živé mikroorganismy, které ve vhodném množství přispívají ke zdravotnímu prospěch hostitele. [1] Bakterie mléčného kvašení BMK/LAB a bifidobakterie jsou nejčastější typy mikrobů užívaných jako probiotika; ale také některé kvasinky a bacily mohou pomáhat. Probiotika jsou obvykle konsumovány jako součást fermentovaných potravin obsahujících aktivní živé kultury; jako je jogurt nebo jako potravní doplňky.

61 Nejčastější probiotické kultury Pro obchodní účely jsou nejčastěji používány následující rody:lactobacillus a Bifidobacterium. Probiotické kmeny Lactobacillus sp. jsou L. acidophilus, L.johnsonii, L.casei, L.rhamnosus, L.gasseri, a L.reuteri. Kmeny Bifidobacterium sp. jsou hlavně B.bifidum, B.longum, a B.infantis.

62 Ukázka působení prebiotik