Real time PCR detekce bakterií Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae a Listeria monocytogenes

Transkript

1 Real time PCR detekce bakterií Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae a Listeria monocytogenes In vitro diagnostikum -80 až -20 C Viz. obal RT-HNSL-050 Viz. obal POPIS SOUPRAVY Multiplex Real Time PCR souprava pro detekci Haemophilus influenzae (sérologické skupiny A až F), Neisseria meningitidis (sérologické skupiny B a C), Streptococcus pneumoniae a Listeria moncytogenes. Diagnostický kit je určený pro molekulárně biologickou diagnostiku hlavních původců závažných bakteriálních meningitid. Doporučeným výchozím matriálem je zejména CSF. Biologický materiál je doporučeno zpracovávat některým z klasických komerčních postupů purifikace DNA, souprava byla optimalizována pro izolaci nukleových kyselin pomocí Qiagen QIAamp DNA Mini kit. SKLADOVÁNÍ Soupravu je doporučeno skladovat při teplotě -20 C (případně nižší), zvláště citlivá k vyšším teplotám je polymeráza. Je nutné zamezit zbytečnému opakovanému rozmrazování reagencií, které může snižovat jejich stabilitu. PMX II je citlivý na světlo, je doporučeno zkumavku vystavovat osvětlení jen na dobu nezbytně nutnou k přípravě analýzy. OBECNÁ DOPORUČENÍ PRO PCR DIAGNOSTIKU PCR je vysoce citlivá metoda schopná zachytit i velmi malé množství nukleové kyseliny, které může sloužit jako templát pro amplifikaci a způsobit kontaminaci analýzy. Zdrojem kontaminací PCR mohou být zejména: Laboratorní stůl, příslušenství a pipety kontaminované z předchozí izolace nukleových kyselin Kontakt mezi vzorky PCR produkty z předchozí analýzy STD/pozitivní kontroly Diagnostiku pomocí molekulárně genetických analýz mohou provádět pouze kvalifikované osoby k tomuto účelu školené a profesně způsobilé. Za chybné výsledky způsobené neodbornou manipulací se soupravou výrobce neručí. 1

2 Doporučená fyzická izolace prostorů/oblastí pro: Purifikaci nukleových kyselin Přípravu reagencií pro amplifikaci Vlastní PCR analýzu a hodnocení Jednotlivé oblasti musí být vybaveny přístroji a pomůckami, které jsou speciálně určené pro daný prostor (místnost nebo laminární box), je nutné pomůcky používat pouze v odpovídajícím prostoru a nepřenášet je mezi vytyčenými oblastmi. Extrakce nukleových kyselin a příprava PCR reagencií musí být prováděny ve vyhrazeném biohazardním boxu a PCR laminárním boxu, nebo jiném sterilním místě, které je vybaveno UV lampou. Před použitím by mělo být příslušenství vyzářeno minimálně 15 min. UV světlem, doporučuje se použití látek degradujících DNA/RNA (Termi-DNA-Tor, apod.) Pro skladování je doporučeno fyzicky oddělit do jednotlivých krabiček reagencie pro extrakci nukleových kyselin, přípravu PCR reakce, zejména však je nutné umístit do oddělených prostor pozitivní kontroly!, které bývají nejčastějším zdrojem kontaminace. Při manipulaci s reagenciemi a příslušenstvím je doporučeno: Dodržet striktně prostorovou izolaci jednotlivých postupů Nepoužívat exspirované ani jinak znehodnocené výrobky Reagencie mohou být na čistém místě rozalikvotovány pro denní použití a náležitě uskladněny Používat roztoky RNase/DNase free a sterilní špičky s filtrem Před a po analýze použít chemickou DNA-dekontaminační metodu pro všechny povrchy, pipety, stojánky a příslušenství, případně vyzářit prostory UV lampami Zabránit tvorbě aerosolu Používat jednorázové rukavice a pravidelně je měnit Po každé proceduře vyprázdnit nádoby na biologický odpad Při extrakci nukleových kyselin a přípravě PCR ponechat ve stojánku mezi zkumavkami mezery, aby se snížilo riziko vzniku kontaminace mezi vzorky Při přípravě PCR pipetovat v pořadí: 1. negativní kontrola, 2. analyzované vzorky, 3. pozitivní kontrola LIKVIDACE ZBYTKU SOUPRAVY S jednotlivými komponentami soupravy a se spotřebním materiálem je doporučeno zacházet jako s infekčním materiálem. Odpad je vhodné uložit do nádob určených pro likvidaci infekčního biologického materiálu. 2

3 SOUPRAVA OBSAHUJE: Amplifikační reagencie pro přípravu Real Time PCR analýzy 50 vzorků: Mastermix pro detekci Haemophilus influenzae a Interní kontroly HI PMX I (600µl) HI PMX II (24µl) HI PMX III (380µl) HI STD (55µl) - pozitivní kontrola Amplifikační reagencie pro přípravu Real Time PCR analýzy 50 vzorků: Mastermix pro detekci Neisseria meningitidis a Streptococcus pneumoniae NS PMX I (600µl) NS PMX II (24µl) NS PMX III (60µl) NS H 20 (350µl) NS STD (55µl) - pozitivní kontrola Amplifikační reagencie pro přípravu Real Time PCR analýzy 50 vzorků: Mastermix pro detekci Listeria monocytogenes a Interní kontroly LM PMX I (600µl) LM PMX II (24µl) LM PMX III (380µl) LM STD (55µl) - pozitivní kontrola Taq Polymeráza (70 µl) pro všechny Mastermixy Negativní kontrola (170 µl) - pro všechny Mastermixy POTŘEBNÉ REAGENCIE A SPOTŘEBNÍ MATERIÁL, KTERÉ SOUPRAVA NEOBSAHUJE: Izolační souprava Sterilní špičky s filtrem Zkumavky SmartCycler / PCR zkumavky příp. PCR destičky Zkumavky objemu 1,5-2ml pro přípravu Mastermixu Průhledné lepicí folie pro PCR destičky POTŘEBNÉ PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ Centrifuga s minimálním odstředivým zrychlením x g Termoblok nebo vodní lázeň nastavitelná na 56 o C Biohazardní box, PCR box Pipety s nastavitelným objemem 0,5-1000µl Vortex, chladicí blok Real Time Cycler (např. SmartCycler/Cepheid; RotorGene/Qiagen; LightCycler 480/Roche) Lednička, mrazák 3

4 BIOLOGICKÝ MATERIÁL Doporučeným materiálem je likvor, plná krev (EDTA/citrát.), stěry. Biologický materiál je doporučeno uchovávat při 0 až 4 C a okamžitě zpracovat (do 24h). Je-li to nutné, vzorek je možné zamrazit a dlouhodoběji uchovávat při -20 o C. V případě analýzy likvoru je vhodné použít minimálně 200µl vzorku, doporučené množství je µl vzorku. Metoda byla testována na druzích H.influenzae, N. meningitidis, S. pneumoniae a L.monocytogenes. Specificita byla ověřena na výše uvedených druzích a dále na příbuzných organizmech a řadě dalších bakteriálních kmenů. Předpokládaná citlivost: 10E1-10E2/ml. POSTUP PURIFIKACE DNA Z LIKVORU, SÉRA A STĚRU Doporučené komerční kity pro zpracování výše uvedených vzorků: QIAamp DNA Mini Kit(50) REF: QIA / (250) REF: QIA QIAamp MinElute Virus Spin Kit(50) REF: QIA QIAamp DNA Blood Mini Kit(50) REF: QIA / (250) REF: QIA Vzorky je doporučeno zpracovat dle návodu výrobce konkrétní soupravy. Takto zpracovaný vzorek lze přímo použít pro amplifikaci či skladovat v lednici při teplotě 2-8 C po dobu 24h, pro delší skladování je doporučena teplota -20 C až -80 C. REAL TIME PCR ANALÝZA (reakční objem = 20 µl) Po samovolném rozmrazení se všechny zkumavky potřebné k přípravě analýzy důkladně promíchejte (je nevhodné roztoky vystavovat vyšší teplotě než pokojové, z důvodu rychlejšího rozmrazení!). Následně se napipetujte do čisté sterilní eppendorf zkumavky (1,5 2ml) všechny komponenty v odpovídajícím objemu, nutném pro přípravu Mastermixu pro daný počet vzorků (n+1), navýšený o 1x pozitivní a 1x negativní kontrolu dle protokolu: Příprava HI Mastermixu: Příprava NS Mastermixu: Příprava LM Mastermixu: PCR/1reakce(20µl): 2 l izolátu DNA 10 l HI PMX I 0,4 l HI PMX II 7,2 l HI PMX III 0,4 l Polymeráza (5U/ l) 20 l objem jednoho vzorku Zkumavky s připravenými Mastermixy je třeba důkladně zvortexovat. Následně pipetujte po 18µl Mastermixu do připravených Smart/PCR zkumavek umístěných v chlazeném bloku příp. do destičky. Poté napipetujte do příslušných zkumavek/jamek v destičce 2 µl izolátu/pozitivní a negativní kontroly. (Je doporučeno nejdříve pipetovat negativní kontroly /ddh 2O či TE pufr/, připravené izoláty a jako poslední pozitivní kontroly). PCR/1reakce(20µl): 2 l izolátu DNA 10 l NS PMX I 0,4 l NS PMX II 1 l NS PMX III 6,2 l NS H 2O 0,4 l Polymeráza (5U/ l) 20 l objem jednoho vzorku PCR/1 reakce (20μl): 2 μl izolátu DNA 10 μl LM PMX I 0,4 μl LM PMX II 7,2 μl LM PMX III 0,4 μl Polymeráza (5U/μl) 20 μl objem jednoho vzorku 4

5 Po přidání negativní kontroly, vzorku či pozitivní kontroly je doporučeno okamžitě zkumavky uzavřít, aby nebylo zvyšováno riziko kontaminace mezi jednotlivými zkumavkami. Destičku je třeba důkladně zalepit průhlednou folií. Následně zkumavky zcentrifugujte cca 10s a vložte do cycleru. NASTAVENÍ PROTOKOLU REAL TIME PCR REAKCE V SMARTCYCLER SOFTWARE: V menu software v záložce Define protocol New protocol se vytvoří teplotně časový profil analýzy: Následně se zadá počet testovaných vzorků a definuje se jejich umístění v konkrétních pozicích cycleru. Přes ikonu Start Run se spustí analýza. Hodnoty Threshold pro jednotlivé optické kanály: Channel 1 (FAM) 30 RFU Channel 3 (TxR) 10 RFU pro Mastermix HI a LM Channel 3 (TxR) 30 RFU pro Mastermix NS HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ HI Mastermix Detekce Haemophilus influenzae probíhá na základě detekce FAM signálu v prvním kanále (channel1) Detekce interní kontroly probíhá na základě detekce TxR signálu ve třetím kanále (channel3) NS Mastermix Detekce Neisseria meningitidis probíhá na základě detekce FAM signálu v prvním kanále (channel1) Detekce Streptococcus pneumoniae probíhá na základě detekce TxR signálu ve třetím kanále (channel3) LM Mastermix Detekce Listeria monocytogenes probíhá na základě detekce FAM signálu v prvním kanále (channel 1) Detekce Interní kontroly probíhá na základě detekce TxR signálu ve třetím kanále (channel 3) 5

6 Haemophilus influenzae(fam) + Interní kontrola(txr) Neisseria meningitidis(fam) + Streptococcus pneumoniae(txr) 6

7 Listeria monocytogenes(fam) + Interní kontrola(txr) Výsledky se posuzují jako validní pouze v případě, že pozitivní kontrola vykazuje pozitivní výsledek (RFU>30), negativní kontrola je ve výsledku analýzy negativní (RFU<30). Vzorek se hodnotí jako pozitivní, pokud nárůst fluorescence překročil mezní hodnotu 30RFU Threshold. Vzorek se hodnotí jako negativní pouze v případě, že vykazuje při analýze pozitivní signál interní kontroly. Pokud nárůst fluorescence překročil hodnotu Threshold později než v 45. cyklu, je doporučeno analýzu zopakovat. V případě pozitivních vzorků Haemophilus influenzae a Listeria monocytogenes může vysoká intenzita pozitivity způsobit inhibici amplifikace Interní kontroly takovéto vzorky se hodnotí jako pozitivní i přes negativní signál Interní kontroly. NASTAVENÍ PROTOKOLU REAL TIME PCR REAKCE V ROTOR-GENE SOFTWARE: 1. přes ikonu New nastavte správný rotor, vhodný objem vzorku, pozici vzorku a vytvořte teplotně časový profil analýzy: pro všechny Mastermixy KROK TEPLOTA ( o C) ČAS POČET CYKLŮ Hold 95 8 min sec Cycling 57 40* detekce fluorescence sec 7

8 2. nastavte fluorescenční kanály dle obrázku níže: teplotu na 57 o C a zaškrtněte políčko Perform Optimisation Before 1st Acquisition 3. umístěte PCR zkumavky do přístroje 4. spusťte amplifikační program 5. po dokončení měření spusťte analýzu dat a interpretaci výsledků NASTAVENÍ KANÁLŮ V ROTOR-GENE PRO ANALÝZU VÝSLEDKŮ KANÁL THRESHOLD OUTLIER REMOVAL SLOPE CORRECT Prahová hodnota Vymazání odchylek Oprava sklonu křivky FAM/Green 0,05 15% On TxR/ROX/Orange 0,05 0% On 8

9 Neisseria meningitidis + Haemophilus influenzae + Listeria monocytogenes kanál FAM/Green Streptococcus pneumoniae + Interní kontrola (HI/LM mastermixy) kanál ROX/Orange 9

10 HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ DETEKČNÍ KANÁL FAM / GREEN ROX / ORANGE NS mastermix Neisseria meningitidis + Streptococcus pneumoniae + HI mastermix Haemophilus influenzae + Interní kontrola + LM mastermix Listeria monocytogenes + Interní kontrola + Vzorek je považován za pozitivní, jestliže je přítomna Ct hodnota. Fluorescenční křivka má typický sigmoidní tvar a překřižuje prahovou linii v exponenciálním růstu pouze jednou. Vzorek je považován za negativní, jestliže není přítomna Ct hodnota. Fluorescenční křivka nemá typický tvar a nepřekřižuje prahovou linii. Pokud je vzorek pozitivní Haemophilus influenzae nebo Listeria monocytogenes může dojít k inhibici Interní kontroly, v takovém případě je vzorek považován za pozitivní. NASTAVENÍ PROTOKOLU REAL TIME PCR REAKCE V LIGHTCYCLER SOFTWARE: Vložte destičku do přístroje. zadejte New Experiment, v záložce Run protocol zadejte detekční formát nastavený od výrobce Dual Color Hydrolysis Probe/UPL Probe. nastavte reakční objem 20 µl, dále teplotní profil viz níže: Program name Cycles Analysis Mode Hold 1 None Cycling 55 Quantification Cooling 1 None Target, o C Acquisition Mode Hold (hh:mm:ss) Ramp Rate ( o C/s) 95 None 00:08: None 00:00: Single 00:00: None 00:00: None 00:00: přes pole Sample Editor vlevo nahoře zadejte typ analýzy, jednotky, nastavte typ a pozici jednotlivých vzorků a kontrol 10

11 vraťte se zpět přes políčko Experiment vlevo nahoře a vpravo dole klikněte na Start Run; uložte tento běh (bez uložení nelze test spustit) po skončení běhu klikněte na políčko Analysis v menu vlevo; v novém okně vyberte Abs Quant/Fit points, poté označte vzorky a klikněte na Calculate Kanál FAM ( ) Neisseria meningitidis + Haemophilus influenzae + Listeria monocytogenes 11

12 Kanál Yellow ( ) Streptococcus pneumoniae + Interní kontrola (HI/LM mastermixy) PROBLÉMY 12

13 Důsledek Příčina Doporučení k nápravě Problémy při izolaci nukleových kyselin Viz návod příslušné izolační soupravy Viz návod příslušné izolační soupravy a) enzym nebyl do reakce Zajistěte přidání enzymu do přidán nebo je neaktivní správné zkumavky, zopakujte Pozitivní vzorky/pozitivní kontroly jsou negativní Negativní kontroly/negativní vzorky jsou pozitivní Nižší hodnoty výsledků než bylo předpokládáno b) nedokonalé odstranění promývacích pufrů během izolace c) opakované rozmrazování a zamrazování analýzu Zajistěte správné nastavení rychlosti centrifugace při izolaci, zopakujte izolaci Snažte se tomu vyhnout, zopakujte celou proceduru s novými kontrolami/vzorky d) nesprávné skladování Vzorky/kontroly skladujte při teplotě určené výrobcem, zopakujte analýzu s novými kontrolami/vzorky e) část či celý kit byl nesprávně skladován či je expirovaný f) při izolaci nebyl přidán ethanol do příslušných pufrů Kontaminace PCR z předešlé analýzy či během její realizace a) izolát byl příliš dlouho skladován než byl analyzován b) izolace byla příliš pomalá či nevhodně přerušena c) PCR neproběhla optimálně kvůli špatné manipulaci s kitem Pravidelně kontrolujte správné teploty a životnost kitu Dodržujte postup přípravy pufrů určený výrobcem, zopakujte izolaci a analýzu Měňte špičky po každém pipetování, pravidelně měňte rukavice Dbejte doporučené izolace jednotlivých úkonů Používejte UV lampy, dezinfekční činidla pro pracovní plochy Zamezte zbytečnému kontaktu jednotlivých zkumavek ve stojánku i v centrifuze Zabraňte kontaktu špičky s vnitřní plochou zkumavky či jejím víčkem Zopakujte analýzu s novými kontrolami/vzorky Doporučuje se provést analýzu co nejdříve po izolaci, zopakujte celou proceduru Doporučuje se pracovat kontinuálně bez zbytečných prodlev, zopakujte celou proceduru Kontrolujte pravidelně skladovací podmínky a životnost kitu, zopakujte analýzu 13

14 * SmartCycler je registrovanou obchodní značkou společnosti Cepheid * Rotor-Gene je registrovanou obchodní značkou společnosti Qiagen * LightCycler 480 II je registrovanou obchodní značkou společnosti Roche DYNEX LABORATORIES, s.r.o. Sídlo: Vodičkova 791/41, Praha, Provozovna: Lidická 977, Buštěhrad, 27343, Česká Republika Tel , mail: office@dynex.cz, web: 14