Real time PCR detekce Borrelia burgdorferi Sensu Lato

Transkript

1 Real time PCR detekce Borrelia burgdorferi Sensu Lato In vitro diagnostikum -80 až -20 C Viz. obal RT-BBSL-050 Viz. obal POPIS SOUPRAVY Real Time PCR souprava pro detekci Borrelia burgdorferi Sensu Lato je diagnostický kit pro stanovení Borrelia burgdorferi Sensu Stricto, B.afzelii, B.garinii a B.valaisiana. Doporučeným výchozím matriálem je zejména močový sediment, likvor, punktát, při akutních stavech plná krev(edta/citrát.). Biologický materiál se zpracovává některým z klasických komerčních postupů purifikace DNA, souprava byla optimalizována pro izolaci NK pomocí Qiagen QIAamp DNA Mini kit. Real Time PCR detekce vychází ze sekvence genu pro syntézu Flagelinu, která je běžně pro podobné účely používána (Schwaiger et al., 2001; Mommert et al., 2001; Pahl et al., 1999). SKLADOVÁNÍ Soupravu je doporučeno skladovat při -20 C (případně nižší), zvláště citlivá k vyšším teplotám je polymeráza. Je nutné zamezit zbytečnému opakovanému rozmrazování reagencií, které může snižovat jejich stabilitu. PMX II je citlivý na světlo, je doporučeno zkumavku vystavovat osvětlení jen na dobu nezbytně nutnou k přípravě analýzy. OBECNÁ DOPORUČENÍ PRO PCR DIAGNOSTIKU PCR je vysoce citlivá metoda schopná zachytit i velmi malé množství nukleové kyseliny, které může sloužit jako templát pro amplifikaci a způsobit kontaminaci analýzy. Zdrojem kontaminací PCR mohou být zejména: Laboratorní stůl, příslušenství a pipety kontaminované z předchozí izolace nukleových kyselin Kontakt mezi vzorky PCR produkty z předchozí analýzy STD/pozitivní kontroly Diagnostiku pomocí molekulárně genetických analýz mohou provádět pouze kvalifikované osoby k tomuto účelu školené a profesně způsobilé. Za chybné výsledky způsobené neodbornou manipulací se soupravou výrobce neručí. Doporučená fyzická izolace prostorů/oblastí pro: Purifikaci nukleových kyselin Přípravu reagencií pro amplifikaci Vlastní PCR analýzu a hodnocení Stránka 1 z 9

2 Jednotlivé oblasti musí být vybaveny přístroji a pomůckami, které jsou speciálně určené pro daný prostor (místnost nebo laminární box), je nutné pomůcky používat pouze v odpovídajícím prostoru a nepřenášet je mezi vytyčenými oblastmi. Extrakce nukleových kyselin a příprava PCR reagencií musí být prováděny ve vyhrazeném biohazardním boxu a PCR laminárním boxu nebo jiném sterilním místě, které je vybaveno UV lampou. Před použitím by mělo být příslušenství vyzářeno minimálně 15min. UV světlem, doporučuje se použití látek degradujících DNA/RNA (Termi-DNA-Tor, apod.). Pro skladování je doporučeno reagencie fyzicky oddělit do jednotlivých krabiček pro extrakci nukleových kyselin, přípravu PCR reakce, zejména však je nutné umístit do oddělených prostor pozitivní kontroly!, které bývají nejčastějším zdrojem kontaminace. Při manipulaci s reagenciemi a příslušenstvím je doporučeno: Dodržet striktně prostorovou izolaci jednotlivých postupů Nepoužívat expirované ani jinak znehodnocené výrobky Reagencie mohou být na čistém místě rozalikvotovány pro denní použití a náležitě uskladněny Používat roztoky RNase/DNase free a sterilní špičky s filtrem Před a po každé analýze použít chemickou DNA-dekontaminační metodu pro všechny povrchy, pipety, stojánky a příslušenství příp. vyzářit prostory UV lampami Zabránit tvorbě aerosolu Používat jednorázové rukavice a pravidelně je měnit Po každé proceduře vyprázdnit nádoby na biologický odpad Při extrakci nukleových kyselin nebo přípravě PCR je vhodné ponechat ve stojánku mezi zkumavkami mezery, aby se snížilo riziko vzniku kontaminace mezi vzorky Při přípravě PCR pipetovat v pořadí: 1.negativní kontrola, 2.analyzované vzorky, 3.pozitivní kontrola LIKVIDACE ZBYTKU SOUPRAVY S jednotlivými komponentami soupravy a se spotřebním materiálem je doporučeno zacházet jako s infekčním materiálem. Odpad je vhodné uložit do nádob určených pro likvidaci infekčního biologického materiálu. SOUPRAVA OBSAHUJE: Amplifikační reagencie pro přípravu Real Time PCR analýzy 50 vzorků: PMX I (600µl) PMX II (24µl) PMX III (408µl) PMX IV (24µl) Negativní kontrola (110 l) Polymeráza TAQ (24µl) BBSL STD (55µl) pozitivní kontrola Stránka 2 z 9

3 POTŘEBNÉ REAGENCIE A SPOTŘEBNÍ MATERIÁL, KTERÉ SOUPRAVA NEOBSAHUJE: Izolační souprava Zkumavky objemu 1,5 2ml pro přípravu Mastermixu Sterilní špičky s filtrem Zkumavky SmartCycler / PCR zkumavky POTŘEBNÉ PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ Termoblok nebo vodní lázeň nastavitelná na 56 o C Centrifuga s minimálním odstředivým zrychlením x g Biohazardní box, PCR box Pipety s nastavitelným objemem 0,5-1000µl Vortex, chlazený blok Real Time Cycler s optickým systémem pro čtení FAM, TxR fluorochromů (souprava byla optimalizována pro přístroje SmartCycler/Cepheid a RotorGene/Qiagen) Prostor pro skladování -20 o C BIOLOGICKÝ MATERIÁL Doporučeným materiálem je moč, likvor, punktát, v akutních stavech i plná krev(edta/citrát.). Biologický materiál je doporučeno uchovávat při 0 až 4 C a okamžitě zpracovat (do 12h). Je-li to nutné, vzorek je možné zamrazit a dlouhodoběji uchovávat při -20 o C. Doporučený objem moči pro získání močového sedimentu je minimálně 8ml, optimálně 10ml a více, moč po centrifugaci při maximálních otáčkách (14 000g a více) po dobu 10minut vytvoří sediment, který je vhodné 2x promýt pomocí pufru PBS a následně rozpustit ve 100µl fyziologického roztoku. V případě analýzy likvoru, punktátů či krve je vhodné použít minimálně 200µl vzorku, doporučené množství je µl vzorku. Metoda byla testována na druzích Borrelia burgdorferi Sensu Stricto, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Borrelia valaisiana. Specificita byla ověřena na výše uvedených druzích BBSL a dále na příbuzných organizmech (Treponema) a řadě dalších bakteriálních kmenů. Předpokládaná citlivost: 10E1-10E2/ml PURIFIKACE DNA Z MOČOVÉHO SEDIMENTU, LIKVORU, PUNKTÁTU A SÉRA, PŘÍP.PLNÉ KRVE Doporučené komerční kity pro zpracování výše uvedených vzorků: QIAamp DNA Mini Kit(50) REF: QIA / (250) REF: QIA QIAamp MinElute Virus Spin Kit(50) REF: QIA QIAamp DNA Blood Mini Kit(50) REF: QIA / (250) REF: QIA Vzorky je doporučeno zpracovat dle návodu výrobce konkrétní soupravy. Takto zpracovaný vzorek lze přímo použít pro amplifikaci či skladovat v lednici při teplotě od 2 do 8 C po dobu 24h, pro delší skladování je doporučena teplota -20 C až -80 C. REAL TIME PCR ANALÝZA (reakční objem = 20 l) Po samovolném rozmrazení se všechny zkumavky potřebné k přípravě analýzy důkladně zvortexují (je nevhodné roztoky vystavovat vyšší teplotě než pokojové, z důvodu rychlejšího rozmrazení!). Následně se pipetují do čisté sterilní eppendorf zkumavky (1,5 2 ml) všechny komponenty v odpovídajícím objemu, nutném pro přípravu Mastermixu pro daný počet vzorků (n+1) a navýšený o 1x pozitivní a 1x negativní kontrolu dle protokolu: Stránka 3 z 9

4 PCR/1reakce (20µl): 2 l izolátu DNA 10 l PMX I 0,4 l PMX II 6,8 l PMX III 0,4 l PMX IV 0,4 l TAQ polymerázy (5U/ l) 20 l objem jednoho vzorku Zkumavku s připraveným Mastermixem důkladně zvortexovat. Následně pipetovat po 18 µl Mastermixu do připravených Smart zkumavek/pcr zkumavek umístěných v chlazeném bloku. Poté napipetujte do příslušných zkumavek 2 l izolátu/pozitivní a negativní kontroly. (Je doporučeno nejdříve pipetovat negativní kontrolu, připravené izoláty a jako poslední pozitivní kontrolu). Po přidání negativní kontroly, vzorku či pozitivní kontroly je doporučeno okamžitě zkumavku uzavřít, aby nebylo zvyšováno riziko kontaminace mezi jednotlivými zkumavkami. Následně se zkumavky centrifugují cca 10s a vloží do cycleru. NASTAVENÍ PROTOKOLU REAL TIME PCR REAKCE V SMARTCYCLER SOFTWARE: V menu software v záložce Define protocol New protocol se vytvoří teplotně časový profil analýzy: Následně se zadá počet testovaných vzorků a definuje se jejich umístění v konkrétních pozicích cycleru. Přes ikonu Start Run se spustí analýza. Hodnota Threshold pro jednotlivé optické kanály: channel 1 (FAM) 30RFU channel 3 (TxR) 30 RFU HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ Detekce Borrelia burgdorferi SL probíhá na základě detekce FAM signálu v prvním kanále (channel1) Detekce Interní kontroly probíhá na základě detekce TxR signálu ve třetím kanále (channel3) Stránka 4 z 9

5 Borrelia burgdorferi (FAM) + Interní kontrola (TxR) Výsledky se posuzují jako validní pouze v případě, že pozitivní kontrola vykazuje pozitivní výsledek (RFU>30), negativní kontrola je ve výsledku analýzy negativní (RFU<30). Vzorek se hodnotí jako pozitivní, pokud nárůst fluorescence ve FAM kanále překročil mezní hodnotu 30RFU Treshold. Vzorek se hodnotí jako negativní pouze v případě, že vykazuje při analýze pozitivní signál Interní kontroly. Pokud nárůst fluorescence překročil hodnotu Threshold později než v 42.cyklu, je doporučeno analýzu zopakovat. V případě vzorků pozitivních na Borrelia burgdorferi SL může vysoká pozitivita způsobit inhibici amplifikace Interní kontroly takovéto vzorky se hodnotí jako pozitivní i přes negativní signál Interní kontroly. NASTAVENÍ PROTOKOLU REAL TIME PCR REAKCE V ROTOR-GENE SOFTWARE: 1. Přes ikonu "New" nastavte správný rotor, použitý objem vzorku, pozici vzorku a vytvořte teplotně časový profil analýzy dle následující tabulky: KROK TEPLOTA ( O C) ČAS POČET CYKLŮ Hold 95 5 min s Cycling s * FAM/Green ROX/TxR/Orange s Stránka 5 z 9

6 2. Nastavte fluorescenční kanály dle obrázku: teplotu na 60 o C a zaškrtněte políčko Perform Optimisation Before 1st Acquisition 3. Umístěte PCR zkumavky do přístroje. 4. Spusťte amplifikační program. 5. Po dokončení měření spusťte analýzu dat a interpretaci výsledků. NASTAVENÍ FLUORESCENČNÍCH KANÁLŮ V ROTOR-GENE PRO ANALÝZU VÝSLEDKŮ KANÁL THRESHOLD OUTLIER REMOVAL SLOPE CORRECT Prahová hodnota Vymazání odchylek Oprava sklonu křivky FAM/Green 0,03 0% OFF TxR/ROX/Orange 0,03 0% OFF Borrelia burgdorferi SL kanál FAM/Green Stránka 6 z 9

7 Interní kontrola kanál ROX/TxR/Orange HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ DNA Borrelia burgdorferi SL je detekována ve fluorescenčním kanálu FAM/Green. Interní kontrola je detekována ve fluorescenčním kanálu ROX/TxR/Orange. Vzorek je považován za pozitivní, jestliže je přítomna Ct hodnota. Fluorescenční křivka má typický sigmoidní tvar a překřižuje prahovou linii v exponenciálním růstu pouze jednou. Vzorek je považován za negativní, jestliže v kanálu FAM/Green není přítomna Ct hodnota (fluorescenční křivka nepřekračuje prahovou linii), zatímco v kanálu ROX/TxR/Orange je pozitivní signál Interní kontroly. Pokud je vzorek pozitivní na Borrelia burgdorferi SL může dojít k inhibici Interní kontroly, v takovém případě je vzorek pozitivní i přes negativní signál IC. Stránka 7 z 9

8 PROBLÉMY Důsledek Příčina Doporučení k nápravě Problémy při izolaci nukleových kyselin Viz návod příslušné izolační soupravy Viz návod příslušné izolační soupravy a) enzym nebyl do reakce Zajistěte přidání enzymu do přidán nebo je neaktivní správné zkumavky, zopakujte Pozitivní vzorky/pozitivní kontroly jsou negativní Negativní kontroly/negativní vzorky jsou pozitivní Nižší hodnoty výsledků než bylo předpokládáno b) nedokonalé odstranění promývacích pufrů během izolace c) opakované rozmrazování a zamrazování analýzu Zajistěte správné nastavení rychlosti centrifugace při izolaci, zopakujte izolaci Snažte se tomu vyhnout, zopakujte celou proceduru s novými kontrolami/vzorky d) nesprávné skladování Vzorky/kontroly skladujte při teplotě určené výrobcem, zopakujte analýzu s novými kontrolami/vzorky e) část či celý kit byl nesprávně skladován či je expirovaný f) při izolaci nebyl přidán ethanol do příslušných pufrů Kontaminace PCR z předešlé analýzy či během její realizace a) izolát byl příliš dlouho skladován než byl analyzován b) izolace byla příliš pomalá či nevhodně přerušena c) PCR neproběhla optimálně kvůli špatné manipulaci s kitem Pravidelně kontrolujte správné teploty a životnost kitu Dodržujte postup přípravy pufrů určený výrobcem, zopakujte izolaci a analýzu Měňte špičky po každém pipetování, pravidelně měňte rukavice Dbejte doporučené izolace jednotlivých úkonů Používejte UV lampy, dezinfekční činidla pro pracovní plochy Zamezte zbytečnému kontaktu jednotlivých zkumavek ve stojánku i v centrifuze Zabraňte kontaktu špičky s vnitřní plochou zkumavky či jejím víčkem Zopakujte analýzu s novými kontrolami/vzorky Doporučuje se provést analýzu co nejdříve po izolaci, zopakujte celou proceduru Doporučuje se pracovat kontinuálně bez zbytečných prodlev, zopakujte celou proceduru Kontrolujte pravidelně skladovací podmínky a životnost kitu, zopakujte analýzu Stránka 8 z 9

9 * SmartCycler je registrovanou obchodní značkou společnosti Cepheid * Rotor-Gene je registrovanou obchodní značkou společnosti Qiagen DYNEX LABORATORIES, s.r.o. Sídlo: Vodičkova 791/41, Praha, Provozovna: Lidická 977, Buštěhrad, , Česká Republika Tel , mail: office@dynex.cz, web: Stránka 9 z 9