Molekulární diagnostika

Transkript

1 Molekulární diagnostika Odry Michal Pohludka, Ph.D.

2 Buňka základní jednotka živé hmoty Všechny v současnosti známé buňky se vyvinuly ze společného předka, tedy buňky, která žila asi před 3,5-3,8 miliardami lety Dva základní typy buněk: Prokaryotní buňka Eukaryotní buňka (Viry) ALBERTS, Bruce, et al Essential Cell Biology (2004) Alberts B, Johnson A, Lewis J. et al. Molecular Biology of the Cell (2002)

3 Prokaryotní buňka Neobsahuje jádro Menší rozměry Menší ribozomy Absence mitochondrií a jiných kompartmentů Listeria monocytogenes Dennis Kunkel Microskopy. Inc. Jiný koncept genové exprese vč. lokalizací a regulací Jinak uspořádaný metabolismus Thanbichler M, Wang S, Shapiro L: J Cell Biochem (2005) Shih YL, Rothfield L: Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2006) Fuerst J: Annu Rev Microbiol (2005)

4 Eukaryotní buňka Jádro Kompartmenty Mitochondrie GA Cytoplazmatické retikulum Lysozom Živočišná a rostlinná buňka Tvorba mnohobuněčných organismů Schopnost diferenciace

5 Dogma molekulární biologie transkripce translace DNA RNA Protein Replikace Relugace trankripce Modifikace DNA Transport do cyto. Ret. Strukturální uspořádání Modifikace RNA Vazebné proteiny.. Relugace translace Transport do GA.. Posttranslační mod. Transport do cílového místa Regulace Degradace proteinů Tvorba komplexů..

6 Dogma molekulární biologie transkripce translace DNA RNA Protein Replikace Relugace trankripce Modifikace DNA Transport do cyto. Ret. Strukturální uspořádání Modifikace RNA Vazebné proteiny.. Relugace translace Transport do GA.. Posttranslační mod. Transport do cílového místa Regulace Degradace proteinů Tvorba komplexů.. ROSTE Variabilita, Složitost a Komplexnost

7 Stejná DNA výbava rozdílný expresní profil a proteom

8 Infekční onemocnění Virové Prokaryotické Eukaryotické

9 Virové a bakteriální infekce dle orgánů, které napadají

10 Molekulární diagnostika Virové Prokaryotické Eukaryotické 1. Rozpoznání infekčního agens 2. Rozpoznání odpovědi org.

11 Molekulární diagnostika Detekce imunitní odpovědi ELISA Chemiluminiscence xmap technology 1. Rozpoznání infekčního agens 2. Rozpoznání odpovědi org.

12 Molekulární diagnostika Detekce imunitní odpovědi xmap technology Mikrobiologie PCR Diagnostika 1. Rozpoznání infekčního agens 2. Rozpoznání odpovědi org.

13 Molekulární diagnostika Detekce imunitní odpovědi xmap technology Mikrobiologie PCR Diagnostika 1. Rozpoznání infekčního agens 2. Rozpoznání odpovědi org.

14 PCR Diagnostika Proč je metoda PCR vhodným nástrojem pro diagnostiku? Stanovení DNA (zásadní pozitivum) Universální metoda detekující viry, bakterie i eukaryoty Citlivost (jedna kopie ve vzorku) Minimum biologického materiálů Rozšířená metoda hojně používaná na téměř každém výzkumném pracovišti v oblasti molekulární biologie, genetiky, Prostorově malá technologie

15 PCR Diagnostika Proč je metoda PCR vhodným nástrojem pro diagnostiku? Stanovení DNA (zásadní pozitivum) Universální metoda detekující viry, bakterie i eukaryoty Citlivost (jedna kopie ve vzorku) Minimum biologického materiálů Rozšířená metoda hojně používaná na téměř každém výzkumném pracovišti v oblasti molekulární biologie, genetiky, Prostorově malá technologie

16 Struktura DNA Definovaná stabilní struktura Komplemetarita bazí A-T, C-G Minimální náchylnost na degradaci a kontaminaci Snadná izolace

17 Polymerase Chain Reaction (PCR) molekulárně-biologická metoda pro namnožení specifického úseku DNA Směs DNA (celý genom vč. extracellularních DNA sekvencí) Detekce od 1 kopie ve vzorku Amplifikace specifického úseku DNA Přístrojová či gelová detekce (real time PCR resp konvenční PCR)

18 PCR cyklus 95 C 60 C 72 C

19

20 Konvenční PCR Konvenční PCR měření pouze výsledného produktu Není možnost měřit multiplexovou analýzu Nutnost gelové elfo a vizualizace

21 Real Time PCR Detekce fluorescenčních barviček Měření signálu po každém cyklu Možnost kvantifikace Možnost multiplexové analýzy

22 Kvantifikace pomocí real time PCR resp. Dynamický rozsah Dynamický rozsah 10 řádů Citlivá metoda Přesná metoda Možnost stanovit stádium onemocnění Záloha dat (CFR modul) Rychlost

23 Detekční limity konvenční PCR a Real time PCR

24 PCR Diagnostika Nový produkt od podzimu 2010

25 Konvenč ční PCR př řístroje První PCR cycler byl uveden na trh v roce 1988 Nejprodávanější PCR cyclery na světě i v ČR V současné době 8 generace PCR cycleru PTC-100 MJ Mini MyCycler C1000 S1000 Dyad + Disciple Tetrad 2

26 Real-Time PCR přístroje První real-time PCR cycler byl uveden na trh v roce 1999 Přední postavení na celosvětovém trhu i v ČR Inovativní přístup První upgradeable real-time PCR přístroj První přístroj schopný multiplexové analýzy (4 analyty) První systém s možností gradientu

27 PCR Diagnostika &

28 PCR Testy Mycobacterium tuberculosis Borrelia burgdorferi Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Chlamydia pneumoniae Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae Herpes Simplex virus Varicella-Zoster virus Cytomegalovirus Epstein-Barr virus Mycoplasma pneumoniae Hepatitis B virus (ve fázi vývoje a certifikací) Hepatitis C virus (ve fázi vývoje a certifikací) CE IVD soupravy jsou vyvíjeny a produkovány společností GeneProof

29 Testy byly validovány na Real-Time PCR přístroje

30 Řešení PCR diagnostiky Objem vzorku - 48, 96 a 384 jamkové formát (stripy) Jednoduchá konstrukce kitu Master mix a vzorek Všechny kity mají stejnou PCR metodu Spojení Bio-Rad přístrojů a GeneProof kitu zajišťuje vysokou citlivost

31 Proč právě Bio-Rad a GeneProof Bio-Rad přístroje: vysoká kvalita PCR přístrojů dlouholetá zkušenost a etablovanost v oblasti PCR na českém i světovém trhu přímé zastoupení, kompletní servis a podpora GeneProof kity: Česká společnost - vývoj, produkce a distribuce v ČR Aplikační podpora

32 Metodický protokol

33 Děkuji za pozornost Michal Pohludka