Real time PCR detekce bakterií Legionella pneumophila+micdadei, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae a Bordetella pertussis

Transkript

1 Real time PCR detekce bakterií Legionella pneumophila+micdadei, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae a Bordetella pertussis In vitro diagnostikum -80 až -20 C Viz. obal RT-PPX-050 Viz. obal POPIS SOUPRAVY Real Time Multiplex assay pro detekci Legionella pneumophila a Legionella micdadei, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae a Bordetella pertussis. Diagnostický kit je určen pro molekulárně biologickou diagnostiku hlavních původců respiračních onemocnění. Doporučeným výchozím materiálem je BAL a výtěr nosohltanu. Souprava obsahuje pozitivní kontrolu (STD), která zahrnuje cílové sekvence všech detekovaných agens. Biologický materiál je doporučeno zpracovávat některým z klasických komerčních postupů purifikace DNA, souprava byla optimalizována pro izolaci nukleových kyselin pomocí QIAmp DNA Mini Kit/QIAGEN. SKLADOVÁNÍ Soupravu je doporučeno skladovat při teplotě -20 o C (případně nižší), zvláště citlivá k vyšším teplotám je polymeráza. Je nutné zamezit zbytečnému opakovanému rozmrazování reagencií, které může snižovat jejich stabilitu. PMX II a IC PMX II jsou citlivé na světlo, je doporučeno zkumavky vystavovat osvětlení jen na dobu nezbytně nutnou k přípravě analýzy. OBECNÁ DOPORUČENÍ PRO PCR DIAGNOSTIKU PCR je vysoce citlivá metoda schopná zachytit i velmi malé množství nukleové kyseliny, které může sloužit jako templát pro amplifikaci a způsobit kontaminaci analýzy. Zdrojem kontaminací PCR mohou být zejména: laboratorní stůl, příslušenství a pipety kontaminované z předchozí izolace nukleových kyselin kontakt mezi vzorky PCR produkty z předchozí analýzy STD/pozitivní kontroly 1

2 Diagnostiku pomocí molekulárně genetických analýz mohou provádět pouze kvalifikované osoby k tomuto účelu školené a profesně způsobilé. Za chybné výsledky způsobené neodbornou manipulací se soupravou výrobce neručí. Doporučená fyzická izolace prostorů/oblastí pro: purifikaci nukleových kyselin přípravu reagencií pro amplifikaci vlastní PCR analýzu a hodnocení Jednotlivé oblasti musí být vybaveny přístroji a pomůckami, které jsou speciálně určené pro daný prostor (místnost nebo laminární box), je nutné pomůcky používat pouze v odpovídajícím prostoru a nepřenášet je mezi vytyčenými oblastmi. Extrakce nukleových kyselin a příprava PCR reagencií musí být prováděny ve vyhrazeném biohazardním boxu a PCR laminárním boxu nebo jiném sterilním místě, které je vybaveno UV lampou. Před použitím by mělo být příslušenství vyzářeno minimálně 15min. UV světlem, doporučuje se použití látek degradujících DNA/RNA (Termi-DNA-Tor, apod.). Pro skladování je doporučeno fyzicky oddělit do jednotlivých krabiček reagencie pro extrakci nukleových kyselin, přípravu PCR reakce, zejména však je nutné umístit do oddělených prostor pozitivní kontroly!, které bývají nejčastějším zdrojem kontaminace. Při manipulaci s reagenciemi a příslušenstvím je doporučeno: dodržet striktně prostorovou izolaci jednotlivých postupů nepoužívat expirované ani jinak znehodnocené výrobky reagencie mohou být na čistém místě rozalikvotovány pro denní použití a náležitě uskladněny používat roztoky RNase/DNase free a sterilní špičky s filtrem před a po analýze použít chemickou DNA-dekontaminační metodu pro všechny povrchy, pipety, stojánky a příslušenství případně vyzářit prostory UV lampami zabránit tvorbě aerosolu používat jednorázové rukavice a pravidelně je měnit po každé proceduře vyprázdnit nádoby na biologický odpad při extrakci nukleových kyselin a přípravě PCR se doporučuje nechávat ve stojánku mezi zkumavkami mezery, aby se snížilo riziko vzniku kontaminace mezi vzorky při přípravě PCR pipetovat v pořadí: 1.negativní kontrola, 2.analyzované vzorky, 3.pozitivní kontrola 2

3 LIKVIDACE ZBYTKU SOUPRAVY S jednotlivými komponentami soupravy a se spotřebním materiálem je doporučeno zacházet jako s infekčním materiálem. Odpad je vhodné uložit do nádob určených pro likvidaci infekčního biologického materiálu. SOUPRAVA OBSAHUJE: Amplifikační reagencie pro přípravu Real Time PCR analýzy 50 vzorků: Mastermix pro detekci L.pneumophila+micdadei, M.pneumoniae, Ch.pneumoniae, B.pertussis PMXI (550µl) PMXII (22µl) PMXIII (55µl) Taq polymeráza (30µl) ddh 2O (400µl) PP STD (55µl) pozitivní kontrola Amplifikační reagencie pro přípravu Real Time PCR analýzy 50 vzorků: Mastermix pro detekci Interní kontroly IC PMXI (550µl) IC PMXII (22µl) IC PMXIII (400µl) IC Taq polymeráza (22µl) IC STD (28µl) interní pozitivní kontrola POTŘEBNÉ REAGENCIE A SPOTŘEBNÍ MATERIÁL, KTERÉ SOUPRAVA NEOBSAHUJE: Izolační souprava Sterilní špičky s filtrem Zkumavky objemu 1,5-2ml pro přípravu Mastermixu Zkumavky SmartCycler nebo PCR 0,2 ml POTŘEBNÉ PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ Biohazardní box, PCR box Pipety s nastavitelným objemem 0,5-1000µl Vortex, chladicí blok Centrifuga s minimálním odstředivým zrychlením x g Termoblok nebo vodní lázeň nastavitelná na 56 o C Real Time Cycler souprava byla optimalizována pro přístroje SmartCycler/Cepheid a RotorGene/Qiagen Lednička, mrazák 3

4 BIOLOGICKÝ MATERIÁL Doporučeným materiálem je BAL, nasofaryngeální výtěr, sputum. Biologický materiál je doporučeno uchovávat při 0 o až 4 o C a okamžitě zpracovat (do 24h). Je-li to nutné, vzorek je možné zamrazit a dlouhodoběji uchovávat při -20 o C. Předpokládaná citlivost : 10E1-10E2/ml. PURIFIKACE DNA Z BALU, VÝTĚRU A SPUTA Doporučené komerční kity pro zpracování výše uvedených vzorků: QIAamp DNA Mini Kit(50) REF: QIA QIAamp DNA Mini Kit(250) REF: QIA Vzorky je doporučeno zpracovat dle návodu výrobce konkrétní soupravy. Takto zpracovaný vzorek lze přímo použít pro amplifikaci či skladovat v lednici při teplotě 2-8 o C po dobu 24h, pro delší skladování je doporučena teplota -20 o až -80 o C. PŘÍPRAVA REAL TIME PCR ANALÝZY Po samovolném rozmrazení všechny zkumavky potřebné k přípravě analýzy důkladně zvortexujte (je nevhodné roztoky vystavovat vyšší teplotě než pokojové, z důvodu rychlejšího rozmrazení!). Následně napipetujte do čisté sterilní eppendorf zkumavky (1,5-2ml) všechny komponenty v odpovídajícím objemu nutném pro přípravu Mastermixu pro daný počet vzorků (n+1) a navýšený o 1x negativní a 1x pozitivní kontrolu dle protokolu: Příprava PPX Mastermixu: PCR/1 reakce (20µl) 2 µl izolátu DNA 10 µl PMX I 0,4 µl PMX II 1 µl PMX III 6,2 µl ddh 2O 0,4 µl Taq polymeráza (5U/µl) 20 µl objem jednoho vzorku Příprava IC Mastermixu: PCR/1 reakce (20µl) 1,5 µl izolátu DNA/templát 0,5 µl IC STD 10 µl IC PMX I 0,4 µl IC PMX II 7,2 µl IC PMX III 0,4 µl IC Taq polymeráza (5U/µl) 20 µl objem jednoho vzorku 4

5 Zkumavky s oběma Mastermixy důkladně promíchejte. Připravte si odpovídající množství SMART/PCR zkumavek do chlazeného bloku pro každý Mastermix (1 sada zkumavek pro PPX Mastermix, 1 sada zkumavek pro IC Mastermix) a následně napipetujte 18 µl Mastermixu do připravených zkumavek pro každý vzorek. Doporučujeme nejdříve napipetovat negativní kontroly (ddh 2O či TE pufr), poté připravené izoláty a jako poslední pozitivní kontroly STD = plazmid obsahující cílové sekvence DNA všech detekovaných bakteriálních agens. Po přidání negativní kontroly, vzorku či pozitivní kontroly zkumavku okamžitě uzavřete, aby nebylo zvyšováno riziko kontaminace mezi jednotlivými zkumavkami. Následně zkumavky krátce centrifugujte cca 5-10 sec a vložte do cykléru. NASTAVENÍ PROTOKOLU REAL TIME PCR REAKCE V SMARTCYCLER SOFTWARE: V menu software v záložce Define protocol New protocol se vytvoří teplotně časový profil analýzy: pro oba Mastermixy Následně se zadá počet testovaných vzorků a definuje se jejich umístění v konkrétních pozicích cykléru. Přes ikonu Start Run se spustí analýza. Hodnoty Threshold pro jednotlivé optické kanály: Channel 1 (FAM) 50 RFU Channel 2 (Cy3/HEX) 30 RFU Channel 3 (TxR/ROX) 10 RFU (pro Interní kontrolu 30 RFU)! Channel 4 (Cy5) 30 RFU 5

6 Legionella pneumophila+micdadei (FAM) Mycoplasma pneumoniae (Cy3/HEX) Chlamydia pneumoniae (TxR/ROX) Bordetella pertussis (Cy5) Interní kontrola (TxR/ROX) 6

7 NASTAVENÍ PROTOKOLU REAL TIME PCR REAKCE V ROTORGENE SOFTWARE: 1. přes ikonu New nastavte správný rotor, vhodný objem vzorku, pozici vzorku a vytvořte teplotně časový profil analýzy: pro oba Mastermixy KROK TEPLOTA ( O C) ČAS (sec.) POČET CYKLŮ Hold Cycling Cycling *detekce fluorescence umístěte PCR zkumavky do přístroje 3. spusťte amplifikační program 4. po dokončení měření spusťte analýzu dat a interpretaci výsledků NASTAVENÍ KANÁLŮ V ROTORGENE PRO ANALÝZU VÝSLEDKŮ KANÁL THRESHOLD Prahová hodnota OUTLIER REMOVAL Vymazání odchylek SLOPE CORRECT Oprava sklonu křivky FAM/GREEN 0,05 15% On CY3/HEX/YELLOW 0,05 0% On TXR/ROX/ORANGE 0,05 0% On CY5/RED 0,05 10% On Legionella pneumophila+micdadei (kanál FAM/Green) Mycoplasma pneumoniae (kanál Cy3/Yellow) 7

8 Chlamydia pneumophila + Interní kontrola (kanál TxR/Orange) Bordetella pertussis (kanál Cy5/Red) HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ DETEKČNÍ KANÁL FAM/GREEN CY3/HEX/JOE/YELLOW TXR/ROX/ORANGE CY5/RED VÝSLEDEK Detekce Legionella Pneumophila + Micdadei Detekce Mycoplasma Pneumoniae Detekce Chlamydia Pneumoniae + Interní Kontrola Detekce Bordetella Pertussis Výsledky se posuzují jako validní pouze v případě, že pozitivní kontrola (STD) vykazuje pozitivní signál ve všech detekčních kanálech, negativní kontrola je naopak ve všech detekčních kanálech negativní. Vzorek se hodnotí jako pozitivní, pokud má fluorescenční křivka typický sigmoidní tvar, překřižuje prahovou linii v exponenciálním růstu fluorescence pouze jednou a Ct hodnota ve výsledkové tabulce pro příslušný kanál je menší než hraniční hodnota. Vzorek se hodnotí jako negativní v případě absence sigmoidní křivky nepřekřižující prahovou linii (nemá hodnotu Ct) nebo Ct přesahuje uvedené hraniční hodnoty. Pokud nárůst fluorescence překročil prahovou hodnotu později než v 42.cyklu, je doporučeno analýzu zopakovat. 8

9 PROBLÉMY Důsledek Příčina Doporučení k nápravě Problémy při izolaci nukleových kyselin Viz návod příslušné izolační soupravy Viz návod příslušné izolační soupravy a) enzym nebyl do reakce přidán Zajistěte přidání enzymu do nebo je neaktivní správné zkumavky, zopakujte analýzu Pozitivní vzorky/pozitivní kontroly jsou negativní Negativní kontroly/negativní vzorky jsou pozitivní Nižší hodnoty výsledků než bylo předpokládáno b) nedokonalé odstranění promývacích pufrů během izolace c) opakované rozmrazování a zamrazování Zajistěte správné nastavení rychlosti centrifugace při izolaci, zopakujte izolaci Snažte se tomu vyhnout, zopakujte celou proceduru s novými kontrolami/vzorky d) nesprávné skladování Vzorky/kontroly skladujte při teplotě určené výrobcem, zopakujte analýzu s novými kontrolami/vzorky e) část či celý kit byl nesprávně Pravidelně kontrolujte správné skladován či je expirovaný teploty a životnost kitu f) při izolaci nebyl přidán ethanol do příslušných pufrů Kontaminace PCR z předešlé analýzy či během její realizace a) izolát byl příliš dlouho skladován než byl analyzován b) izolace byla příliš pomalá či nevhodně přerušena c) PCR neproběhla optimálně kvůli špatné manipulaci s kitem Dodržujte postup přípravy pufrů určený výrobcem, zopakujte izolaci a analýzu Měňte špičky po každém pipetování, pravidelně měňte rukavice Dbejte doporučené izolace jednotlivých úkonů Používejte UV lampy, dezinfekční činidla pro pracovní plochy Zamezte zbytečnému kontaktu jednotlivých zkumavek ve stojánku i v centrifuze Zabraňte kontaktu špičky s vnitřní plochou zkumavky či jejím víčkem Zopakujte analýzu s novými kontrolami/vzorky Doporučuje se provést analýzu co nejdříve po izolaci, zopakujte celou proceduru Doporučuje se pracovat kontinuálně bez zbytečných prodlev, zopakujte celou proceduru Kontrolujte pravidelně skladovací podmínky a životnost kitu, zopakujte analýzu 9

10 DYNEX LABORATORIES, s.r.o. Sídlo: Vodičkova 791/41, Praha, Provozovna: Lidická 977, Buštěhrad, Česká Republika Tel ; mail: web: 10