Monitorování hladin jednotlivých antimykotik pomocí HPLC. E. Klapková, R. Průša ÚKBP, 2. LF UK a FN Motol

Transkript

1 Monitorování hladin jednotlivých antimykotik pomocí HPLC E. Klapková, R. Průša ÚKBP, 2. LF UK a FN Motol

2 Invazivní mykotické infekce (IFI) bakteriální infekce X IFI výskyt morbidita a mortalita příčiny: pokroky v lék. péči agresivní terapeutické přístupy transplantace solidních orgánů nádorová onemocnění (hematologické malignity) Spektrum invazivních mykóz 8% 6% 3% Aspergillus 9% 44% Candida jiné plísně nespecifikované plísně Zygomycetes Fusarium (Pappas PG. Transnet database FOFI 2005) 30%

3 Antimykotika Polyenová antibiotika (nystatin, amfotericin B) místo působení - buněčná membrána Azolová antimykotika (itrakonazol, flukonazol, vorikonazol, posakonazol) místo působení buněčná membrána Echinokandiny (kaspofungin, anidulafungin, mikafungin) místo působení buněčná stěna Ostatní (flucytosin) místo působení mykotická RNA

4 Polyenová antibiotika (nystatin, amfotericin B) chemicky podobné látky (streptomycety) účinek: fungicidní zabudování do biol. membrány vznik hydrofilních pórů nystatin lokální aplikace amfotericin B široké spektrum lokálně kandidózy intravenózně poškození ledvin

5 Azolová antimykotika (ketokonazol, itrakonazol, flukonazol, vorikonazol, posakonazol) Imidazolové deriváty (ketokonazol, mikonazol ) Triazolové deriváty (itrakonazol, posakonazol, vorikonazol) itrakonazol flukonazoll

6 účinek fungistatický především na kvasinky (Candida), vláknité houby (Aspergillus) (Scedosporium, Fusarium), ale i mikromycety Antimykotický efekt inhibice cytochromu P α demethylasy hromadění nefunkčních sterolů (defektní mem.) schopnost inhibice konidiace v pořadí účinnosti: vorikonazol >> posakonazol > itrakonazol

7 pacienti s vysokým rizikem preventivní antimykotická léčba (itrakonazol) pacienti s prokázanou systémovou infekcí cílená dlouhodobá léčba (vorikonazol, posakonazol) Vorikonazol inhibice syntézy ergosterolu kandid 10 x účinněji než flukonazol (C. krusei) fungistatické působení oproti amfotericinu B lék 1. volby invazivní aspergilózy, kandidózy Itrakonazol metabolizován v játrech na aktivní metabolit hydroxyitrakonazol ve steady state jsou přítomny itrakonazol a hydroxyitrakonazol v poměru 1:1 1:2 nutné stanovovat oba analyty

8 Echinokandiny (kaspofungin, anidulafungin, mikafungin) nová skupina antimykotik, vysoká tolerance lipopeptidy ~1200 kd odlišný mechanismus účinku buněčná stěna kandidy fungicidní; aspergily fungistatický odlišná biotransformace, mimo cytochrom P-450 pouze nitrožilní podání lineární farmakokinetika výhodné

9 Buněčná stěna Candida albicans Bennett JE. Echinocandins for candidemia in adults without neutropenia. N Engl J Med 2006; 355:

10 Je nutné monitorovat antimykotika? nutnost monitorování hladin při perorální léčbě porucha vstřebávání ze zažívacího traktu azolová antimykotika ovlivnění enz. procesů na cyt. P-450 klíčový enz. systém hepatocytů v biodegradaci léčiv inter a intraindividuální variabilita Lékové interakce závažné lékové interakce: barbituráty, karbamazepin, sirolimus, rifampin, léky snižující koncentraci: fenytoin, nevirapin, rifabutin léky zvyšující koncentraci: ritonavir, omeprazol, delaviridin léky, jejichž koncentraci zvyšují: warfarin, cyklosporin, takrolimus, statiny, benzodiazepiny

11 itrakonazol Prevence: 0,5 1 mg/l Terapie: 1 3 mg/l Terapeutické rozmezí posakonazol a vorikonazol Účinné: 0,5-2,5 mg/l Tolerované z hlediska nežádoucích účinků: 2-4 mg/l Toxická koncentrace: > 4 mg/l Stabilita vzorku 1 týden laboratorní teplota 2 týdny 2 8 C 2 měsíce -20 C

12 Kapalinový chromatograf Agilent 1200 degasser kvartérní pumpa autosampler termostat kolon DAD detektor

13 příprava vzorku na stanovení itrakonazolu a metabolitu: 1 ml séra μl I.S. (ketokonazol) protřepat přidat 5 ml extrakční směsi (heptan:isoamylalkohol; 9:1) 5 min třepat centrifugace (5 min, 3000 ot/min) odpipetovat 4 ml org. vrstvy sušení při 50 C rozpuštění odparku ve 150 μl MF Chromatografické podmínky DAD detektor, 255 nm MF: ACN:metanol:fosfátový pufr 50mM (45:20:35) průtok MF: 2,0 ml/min kolona: Agilent Zorbax SB C18, 5 μm t: 40 C

14 Kalibrační standard: Chromsystems Itrakonazol 0,70 mg/l Hydroxyitrakonazol 0,91 mg/l Sérové kontroly: Chromsystems Level I Itrakonazol 0,153 0,225 mg/l Hydroxyitrakonazol 0,23 0,351 mg/l Level II Itrakonazol 0,288-0,432 mg/l Hydroxyitrakonazol 0,44 0,67 mg/l Level III Itrakonazol 1,08 1,62 mg/l Hydroxyitrakonazol 1,89 2,79 mg/l

15 Kalibrátor I.S. OH itrakonazol itrakonazol Khoschsoru, Freuhwirth, Zelzer: Antimicrobial agents and chemotherapy, 2005,

16 Analýza pacientského vzorku I.S. OH itrakonazol Itrakonazol

17 Možnost společného stanovení itrakonazolu a vorikonazolu

18 příprava vzorku na stanovení posakonazolu a vorikonazolu: 100 μl plazmy μl I.S. (ketokonazol) protřepat přidat 3 ml extrakční směsi (hexan:dichlormetan; 7:3) 20 min třepat centrifugace (5 min, 3000 ot/min) odpipetovat 2,5 ml org. vrstvy sušení při 30 C rozpuštění odparku ve 150 μl MF Chromatografické podmínky DAD detektor, 255 nm MF: ACN:voda:fosfátový pufr 50mM (52.5:0,25:45) průtok MF: 0,5 ml/min kolona: Agilent Eclipse C8, 5 μm, 250 mm t: 25 C

19 Kalibrace vorikonazol I.S. posakonazol Chhun S., Rey E., Tran A.: Simultaneous quantification of voriconazole and posakonazole in human plazma by HPLC with UV detection, J. of chromatography

20 Standard vorikonazol a posakonazol komerčně nedostupné Interní kontrola kvality 2 hladiny Externí kontrola kvality

21 Kontrola Chromsystems I.S. posakonazol

22 Validace metody Analyt Itrakonazol Hydroxyitrakonazol Vorikonazol Posakonazol Opakovatelnost koncentrace (mg/ml) (průměr ± SD) CV (%) Reprodukovatelnost koncentrace (mg/ml) (průměr ± SD) CV (%) 0,38 ± 0,01 3,92 0,73 ± 0,04 5,5 1,45 ± 0,07 4,16 1,01 ± 0,06 5,9 0,54 ± 0,01 0,96 1,1 ± 0,02 1,8 2,21 ± 0,04 1,83 1,43 ± 0,03 2,1 0,52 ± 0,02 3,50 0,51 ± 0,03 6,7 1,17 ± 0,05 4,19 1,22 ± 0,07 5,7 0,46 ±0,02 4,34 0,48 ± 0,03 6,5 1,18 ± 0,04 4,77 1,22 ± 0,07 5,6 Výtěž nost (%) 96,2 95,7 103,1 98,1

23 Závěr vyvinuta metoda umožňující stanovení itrakonazolu a hydroxyitrakonazolu v séru vyvinuta metoda umožňující stanovení posakonazolu a vorikonazolu v plazmě jednoduchá příprava vzorku, vysokou stabilitou nevýhody žádný kontrolní materiál, nedostupnost analytických standardů pro kalibraci zkušený personál

24 Děkuji Vám za pozornost