NÁVRH A PŘÍPRAVA PEPTIDŮ A LIPOPEPTIDŮ S ANTIMIKROBIÁLNÍM ÚČINKEM A STUDIUM JEJICH BIOLOGICKÝCH VLASTNOSTÍ

Transkript

1 NÁVRH A PŘÍPRAVA PEPTIDŮ A LIPOPEPTIDŮ S ANTIMIKROBIÁLNÍM ÚČINKEM A STUDIUM JEJICH BIOLOGICKÝCH VLASTNOSTÍ A. Macůrková R. Ježek P. Lovecká V. Spiwok P. Ulbrich T. Macek

2 Antimikrobiální peptidy přírodní peptidy s antimikrobiální aktivitou obvykle: kationické délka do 50 AMK široké spektrum účinku alternativa antibiotik? poslední nové antibiotikum daptomycin vysoká cena produkce

3 Ultrakrátké peptidy syntetické; přírodních málo obvykle kationické jednoduché aminokyselinové složení délka do 10 AMK snaha dosáhnout stejných vlastností jako u přírodních templátů příznivější cena produkce

4 Návrh * G-Gly; h-hydrfobní, +-pozitivně nabitá, p-polární/nabitá; x-libovolná; Tossi et al. Eur. J. Biochem. 250, (1997)

5 Peptidy MO a TK Základní 6 AA G, K, R, A, L, V 3 peptidy SHP-1.1 LVKRAG-NH 2 SHP-2.1 LVKGAR-NH 2 SHP-3.1 GVLKRA-NH 2 Modifikace N-koncová acylace kys. palmitovou SHP-x.2 N-koncová acylace kys. litocholovou SHP-x.3

6 Peptidy MO a TK Základní 6 AA G, K, R, A, L, V 3 peptidy SHP-1.1 LVKRAG-NH 2 MO G+ (S. aureus, B. subtilis, atd.) G- (E. coli, P. aeruginosa, atd.) kvasinky (C. albicans, atd.) SHP-2.1 LVKGAR-NH 2 SHP-3.1 GVLKRA-NH 2 Modifikace N-koncová acylace kys. palmitovou SHP-x.2 N-koncová acylace kys. litocholovou SHP-x.3 TK HepG2 (K), HEK 293T (E) DNA plasmid pbluescriptii KS- (2961 bp) izolace z E. coli DH5α

7 Biologické testy Minimální inhibiční koncentrace spektrofotometrické měření mikrobiálního růstu mikrobiální kultury (G+, G-, F) v tekutém médiu koncentrační řady multipliky

8 OD SHP-1.2 Acinetobacter baumanii 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, čas [h] 50 ug/ml 75 ug/ml 100 ug/ml kontrola růstu médium až na výjimky vykazují SHP i modifikované slabou nebo žádnou aktivitu vůči gramnegativním bakteriím MO Peptid TYP MO SHP-1.1 SHP-2.1 SHP.3.1 SHP-1.2 SHP-2.2 SHP-3.2 SHP-1.3 SHP-2.3 SHP-3.3 MIC [mg/ml] MIC [µg/ml] MIC [µg/ml] E. coli G- >1 >1 >1 >100 >100 >100 >100 >100 >100 S. enteritidis G- >1 >1 >1 >100 >100 >100 >100 >100 >100 P. aeruginosa G- >1 >1 >1 55 >100 >100 >100 >100 >100 K. pneumoniae G- >1 >1 >1 >100 >100 >100 >100 >100 >100 A. baumanii G- >1 >1 >1 60 >100 >100 >100 >100 >100

9 OD SHP-3.3 Staphylococcus aureus 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, čas [h] 25 ug/ml 30 ug/ml 35 ug/ml kontrola růstu médium vůči gram-pozitivním bakteriím vykazují SHP, zvláště modifikované silnou aktivitu účinné koncentrace jsou porovnatelné s antibiotiky MO Peptid TYP MO SHP-1.1 SHP-2.1 SHP.3.1 SHP-1.2 SHP-2.2 SHP-3.2 SHP-1.3 SHP-2.3 SHP-3.3 MIC [mg/ml] MIC [µg/ml] MIC [µg/ml] B. subtilis G+ >1 > > S. aureus G+ 1 >1 >1 50 > S. equi subs. zoo. G+ >1 >1 >1 40 >100 >100 >100 >100 >100 M. luteus G+ 1 >1 > E. faecalis G+ >1 >1 >1 40 > >100 >100 40

10 OD SHP-1.3 Candida tropicalis 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, čas [hod] 10 μg/ml 20 μg/ml 30 μg/ml kontrola růstu medium vůči kvasinkám rodu Candida vykazují SHP, zvláště modifikované kys. litocholovou silnou aktivitu MO Peptid TYP MO SHP-1.1 SHP-2.1 SHP.3.1 SHP-1.2 SHP-2.2 SHP-3.2 SHP-1.3 SHP-2.3 SHP-3.3 MIC [mg/ml] MIC [µg/ml] MIC [µg/ml] C. albicans F >1 >1 >1 >100 >100 >100 >100 >100 >100 C. krusei F >1 >1 >1 >100 >100 >100 >100 >100 >100 C. tropicalis F >1 >1 >1 80 >100 >

11 Biologické testy II Hemolytická aktivita Cytotoxicita difúzní metoda na krevním agaru SHP-x.2 (pouze HEK 293T), SHP-x.3 základní i modifikované RTCA DP Analyzer (Roche) pozitivní kontrola chrysophsin-3 (20-AA AMP) Měření impedance koncentrace ~ 50, 100, 200 µg/ml Pouze pro adherentní buňky max koncentrace ~ 10 mg/ml koncentrace >50 µg/ml

12 CI 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0-0,5 HEK 293T - SHP čas [h] Pozadí Kontrola růstu 50 ug/ml 200 ug/ml 100 ug/ml v porovnání s pozitivní kontrolou nejsou SHP prokazatelně hemolytické vůči TK, zvláště proti ledvinovým buňkám, vykazují SHP silný toxický efekt jaterní buňky jsou prokazatelně proti tomuto působení odolnější Peptid SHP-1.2 SHP-2.2 SHP-3.2 SHP-1.3 SHP-2.3 SHP µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml TK % inhibice růstu HepG2 n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a HEK 293T * ± 3 %

13 Biologické testy III Kinetika vymírání Vazba DNA pouze modifikované pouze modifikované snižování CFU/ml vlivem působení antimikrobiální látky bakteriostatický/baktericidní LDH test detekce míry poškození buněk (t = 1 h) plasmid pbluescriptii KS- cirkulární i linearizovaný (EcoRV) zpomalení migrace DNA agarosovým gelem různé poměry DNA:SHP koncentrace ~ 2 x MIC

14 až na SHP-3.3 jsou peptidy baktericidní ve většině případů nedochází k významnému poškození buněk lze usuzovat na ovlivnění metabolismu buňky SHP-1.2 SHP-2.2 SHP-3.2 SHP-1.3 SHP-2.3 SHP-3.3 KP MHB KP MHB KP MHB KP MHB KP MHB KP MHB Kinetika LDH +/- +/- +/- +/- - +/- +/ baktericidní baktericidní baktericidní baktericidní baktericidní bez výrazné destrukce buněk bez výrazné destrukce buněk bez výrazné destrukce buněk bez výrazné destrukce buněk výrazná destrukce buněk v MHB bakteristatický

15 Všechny SHP byly schopny ovlivnit migraci obou typů DNA v agarosovém gelu. Cirkulární DNA: SHP-2.3: 5.0 SHP-1.2: 20.0 SHP-2.2: 30.0 SHP-3.2: 20.0 SHP-1.3: 10.0 SHP-3.3: Mobilita cirkulární a linearizované plasmidové DNA (pbluescriptii KS-) za zvyšujících se poměrů SHP-1.3 Linearizovaná DNA: SHP-2.3: 8.0 SHP-1.2: 10.0 SHP-2.2: 60.0 SHP-3.2: 15.0 SHP-1.3: 10.0 SHP-3.3: 10.0

16 Biologické testy IV Vizualizace efektu SHP na bakterie pouze modifikované S. aureus DBM 3002 naměřeny hodnoty MIC pro všechny modifikované SHP TEM doba inkubace h koncentrace ~ 2 x MIC

17 Vizualizace efektu SHP-2.3 na buňky S. aureus po 4 h inkubace. a: bez SHP-2.3; b: SHP µg/ml, MHB; c: SHP µg/ml, KP pufr Ve většině případů bylo pozorováno narušení obalů mikrobiální buňky. Dále byl pozorován vznik tubulárních útvarů v blízkém okolí buněk a pozvolný rozpad buněk těmito útvary obklopených.

18 Závěr Modifikované prokázána schopnost antimikrobiálního působení Základní účinné koncentrace porovnatelné s antibiotiky (<100 µg/ml) nehemolytické prokázána schopnost antimikrobiálního působení toxické vůči lidským jaterním a ledvinovým buňkám účinné koncentrace vysoké (>1 mg/ml) konjugace s kys. palmitovou zvýšení aktivity nehemolytické úzké spektrum bakterie konjugace s kys. litocholovou zvýšení aktivity široké spektrum bakterie i kvasinky mechanismus účinku je komplexní působení na buněčné obaly i intracelulární cíle

19 Poděkování Finanční podpoře evropských, českých a interních grantových projektů Týmům laboratoří V04, V05, V06 a 209, HPLC, MS a TEM

20 Děkuji za pozornost