Estriol ELISA test pro kvantitativní stanovení estriolu v lidském séru nebo plazmě

Transkript

1 Estriol ELISA test pro kvantitativní stanovení estriolu v lidském séru nebo plazmě Obj. číslo: testů kompletní souprava Účel použití Estriol (1, 3, 5(10)-estratrien-3, 16α, 17ß-triol; E3) reprezentuje až 90% estrogenních steroidů C 18 přítomných v plazmě a moči. Estriol je hlavní estrogenní steroid produkovaný během těhotenství 1. Jeho koncentrace v plazmě a moči během těhotenství neustále stoupá až na tisícinásobek ve třetím trimestru. Nekonjugovaný, volný estriol přechází z placenty do oběhu, kde je rychle přeměněn na deriváty usnadňujících jeho vylučování2. Estriol má proto v krvi matky krátkou dobu poločasu - pouze 20 minut 3. Volný estriol specificky odráží výstup fetoplacentální jednotky. Je nejčasněji určován jako součást biochemického monitorování vysoce rizikových těhotenství. Pro vyhodnocení současného stavu plodu je doporučeno vyhodnocování estriolu v plazmě, protože specifita plazmového estriolu pro fetoplacentální jednotku je mnohem více zvýšena ve srovnání se vzorky moči. Estriol v moči závisí také na funkci jater a ledvin matky nebo jejích poruchách 4 a mění se podle užívání různých antibiotik. Volný estriol v porovnání k celkovému estriolu odráží mnohem přesněji výstup při diabetických těhotenstvích a prezentuje rychlejší výsledky, protože není požadována hydrolýza vázaného estriolu. Princip - Kompetitivní EIA - Test Estriol ELISA je založen na kompetetivní interakci estriolu a hormon-enzymového konjugátu o omezený počet imobilizovaných (králičích) protilátek proti estriolu. Množství vázaného hormon-enzymového konjugátu je tedy nepřímo úměrné koncentraci estriolu ve vzorku. Po inkubaci vzorku a hormon-enzymového konjugátu v jamce je nenavázaný konjugát odstraněn promytím. Po přidání substrátového roztoku se vyvine modré zbarvení, které se po zastavení reakce ukončovacím roztokem mění na žluté. Intenzita barev je nepřímo úměrná množství estriolu ve vzorku. Absorbance kalibrátorů a vzorků je stanovena s využitím mikrodestičekového ELISA spektrofotometru (HUMAREADER). Koncentrace neznámých vzorků je interpolována z kalibrační křivky za využití kalibrátorů séra o známých koncentracích estriolu. Obsah soupravy [MIC] 12 Mikrotitrační destičky (v jednodestičkovém držáku) 8-jamkové ulamovatelné řádky, potažené antiestriolovými protilátkami (králičí) [CAL] A - G Kalibrátory (bile víčko) 6x1.0mlPřipraveno k použití, v lidském séru, červené Estriol koncentrace: 0 (A), 0,3 (B), 1,2 (C), 4,0 (D), 15 (E), a 40 (F) ng/ml [CON] 14 ml Enzymový konjugát (bílé víčko) připraveno k použití ph 6.9 ± 0.2 Estriol-HRP konjugát BSA 0.5 % TRIS/MOPS buffer 0.05 mol/l NaCl 0.1 mol/l [WS] 30 ml Promývací roztok (černé víčko) Koncentrát pro asi 1200 ml ph 7.3 ± 0.1 Trisem pufrovaná sůl 3 mmol/l TWEEN % [SUB] 14 ml Substrátový roztok (žluté víčko) ph Připravené k použití 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) 0,26 g/l Peroxid vodíku 0,015% Acetátový pufr 0.05 mol/l DMSO < 5 % [STOP]14 ml Ukončovací roztok (červené víčko) Kyselina sírová 0.5 mol/l 1 Lepící páska Konzervanty: Celková koncentrace <0,7%

2 Bezpečnostní poznámky Nepolykejte reagencie. Zabraňte potřísnění očí, kůže a sliznic. Se všemi vzorky a [CAL] zacházejte jako s materiálem potenciálně infekčním. [CAL] byly kontrolovány na úrovni dárců na přítomnost protilátek proti HCV a HIV-1/2 a HBsAg s negativním výsledkem. Používejte ochranné oblečení a jednorázové rukavice dle zásad správné laboratorní praxe. Všechny materiály, kontaminované vzorky pacientů nebo [CAL], musí být inaktivovány schválenými postupy (autoklávování nebo chemické ošetření) v souladu s příslušnými předpisy. [STOP] dráždí oči, kůži a sliznice. Při kontaktu pečlivě omývejte velkým množstvím vody a konzultujte s lékařem. Stabilita Při skladování při teplotě 2 8 C jsou reagencie stabilní do data exspirace uvedeného na jednotlivých štítcích. Po otevření musí být reagencie uloženy při teplotě 2 8 C a použity během 60 dnů (viz Poznámky). [MIC] - uzavřeno v hliníkovém obalu se sušidlem - před otevřením musí mít pokojovou teplotu - nepoužité: vraťte se sušidlem zpět do obalu a skladujte při 2-8 C. Destičky skladované tímto způsobe lze použít do 60 dnů (viz poznámka). Nedotýkejte se horního okraje ani vnitřku jamek prsty! Příprava reagencií Zahřejte před použitím všechny reagencie na pokojovou teplotu (15-25 C). Nepoužívané reagencie by měly být skladovány vždy při 2-8 C Pracovní promývací roztok [WASH] -zřeďte [WS] 1200 ml čerstvé deionizované vody do vhodné nádoby. Lahvičku roztokem několikrát propláchnete. - Stabilita: 2 týdny při C Vzorky Sérum nebo EDTA plasma Nepoužívejte vysoce lipemické a hemolyzované vzorky a vzorky obsahující azid sodný. Vzorky je možné skladovat při 2-8 C 3 dny nebo 30 dní při -20 C. Zmrazujte a rozmrazujte pouze jednou. Rozmražené vzorky musí být homogenizovány. Odstraňte částice centrifugací nebo filtrací. Pracovní postup Dodržujte postup přesně! Poznámky k postupu P1: Nemíchejte složky s jinými čísly šarží. Nezaměňujte víčka lahviček (nebezpečí kontaminace). Nepoužívejte reagencie po jejich datu exspirace. P2: Nepoužívejte reagencie, které mohou být kontaminovány nebo vypadají či páchnou jinak než je obvyklé. P3: Zaznamenávejte pečlivě vzorky a kontroly do formuláře dodávaného s kitem P4: [MIC] vyberte požadovaný počet stripů (řádek) destičky a řádně upevněte v držáku. P5: Nechte probíhat reakce kontrol, [CAL] a vzorků duplicitně (od každého dvě). Pipetujte kontroly a vzorky i [CAL] přímo na dno mikrojamek. P6: Vždy přidávejte reagencie v tomtéž pořadí, abyste minimalizovali rozdíly v reakčním čase mezi jamkami. Toto je důležité pro reprodukovatelné výsledky. Pipetování vzorků by nemělo překročit 10 minut. Jinak pipetujte kalibrační křivku v naznačených polohách v poločase série. Jestli se používá více než jedna destička, opakujte dávce odpovídající (kalibrační) křivku pro každou destičku. P7: Odstraňte vzduchové bubliny před inkubací a odečítání absorbance. P8: [SUB] inkubujte ve tmě. [SUB] iniciuje kinetickou reakci, která je zakončena přidáním [STOP]. P9: [MIC] jemně kývejte s destičkou sekund po každém pipetovacím kroku, abyste důkladně promíchali obsah jamek, aniž vylijete roztoky. Je-li to možné, míchejte na automatické míchačce. Promývací procedura Promývací procedura je kritická. Nedostatečné promytí sníží přesnost nebo falešně zvýší absorbanci. W1: Odstraňte lepící pásku, vylijte obsah jamek a přidejte [WASH] do každé jamky, po 30 sekundách navlhčování vylijte a opakujte promytí. W2: V případě automatického promývání začněte s [WASH] a promyjte stripy 3x.. Ujistěte se, že promývač úplně plní všechny jamky a účinně vylívá obsah po 30 sekundách (zbývající kapalina po vylití v jamce< 15ml). W3: Po promytí odstraňte zbývající kapalinu buničinou s destičky obrácené vzhůru nohama. Pipetovací schéma Reagencie a vzorky musí mít před použitím pokojovou teplotu Krok 1 Jamka [µl] A1...F2 G2... [CAL] A-G; dvakrát Vzorky, Kontroly; dvakrát [CON]

3 Promíchejte a přikryjte [MIC] lepící páskou. Inkubujte 60 min při C Promyjte 3 x jak je popsáno (viz W1 - W3) [WASH] Krok 2 [SUB] Inkubujte 15 min při C (viz P8) [STOP] Opatrně promíchejte. Změřte absorbanci at 450 nm hned, jakmile je to možné nebo během 30 min. po skončení reakce, za použití referenční vlnové délky nm (je-li to možné). Platnost testu Výsledky testu jsou platné, jsou-li splněna následující kritéria: 1) Maximální absorbance (kalibrátor A) O.D. max. 1,0 2) Analyzuje se na třech úrovních: Koncentrace estriolu při 80 % O.D. max. = 0,2 0,73 ng/ml Koncentrace estriolu při 50 % O.D. max. = 1,54 4,0 ng/ml Koncentrace estriolu při 20 % O.D. max. = 17,0 38,0 ng/ml Výpočet Kalibrační křivka se používá k odečtení koncentrace estriolu v neznámých vzorcích. 1. Vyneste na milimetrový papír absorbance duplicitních kalibrátorů proti odpovídající koncentraci estriolu v ng/ml (nepočítejte z dvojic průměrnou hodnotu a vyneste obě hodnoty absorbance). 2. Vytvořte regresní přímku. Koncentraci estriolu v neznámém vzorku (S) zjistíte tak, že od hodnoty průměrné absorbance vzorku na svislé ose vedete přímku až protne křivku, tomuto bodu odpovídá na horizontální ose příslušná koncentrace (v ng/ml). Pro ilustraci viz obrázek. Interpretace výsledků Pro interpretaci hodnot estriolu je nutno vzít v úvahu jeho variabilitu. Existuje periodický rytmus a fluktuace z hodiny na hodinu. Denní hladiny jsou vyšší než noční s maximem v poledne a minimem o půlnoci. Hladiny plazmového estriolu se stále zvyšují během těhotenství 5. Během posledního měsíce těhotenství je velmi široká biologická variabilita fetoplacentální jednotky, což má za následek odpovídající variabilitu hodnot estriolu. Očekávané hodnoty jsou uvedeny v tabulce níže. Náhlé nefyziologické snížení produkce fetoplacentálního estriolu má za následek prudké snížení hladiny volného estriolu v séru matky (6), což může být způsobeno placentální nedostatečností s rizikem potratu. Stanovení hodnoty estriolu samotné není postačující pro odlišení a diagnózu patologických stavů. Musí být použito ve spojení s jinými klinickými projevy a diagnostickými (hormonálními) parametry. Očekávané hodnoty Týden Hladina těhotenství estriolu p.m. (ng/ml) Týden těhotenství p.m. Hladina estriolu (ng/ml) těhotenství s dvojčaty (ng/ml) 12 0,3 1, , ,3 1, , ,4 1, , ,0 4, , ,4 6, , ,5 6, , ,6 8, , , , , , , , konverzní koeficient: 1 ng/ml = 3,47 nmol/l Každá laboratoř by si měla stanovit své vlastní očekávané hodnoty vzhledem k používaným přístrojům, metodám odběru krve a testovacím technikám obecně v této laboratoři užívaným.

4 Parametry testu Test ELISA estriol firmy Human má analytickou citlivost < 0,02 ng/ml vzorku. Vzorky s koncentrací estriolu nad 40 ng/ml musí být zředěny (1 + 9) kalibrátorem A (0 ng/ml) a znovu analyzovány. Výsledek násobte 10. Typické údaje o parametrech procesu můžete nalézt ve Verification Report dostupném na nebo Poznámka Součásti soupravy jsou i po otevření stabilní do data exspirace. Jejich kontaminace ovšem přímo souvisí s počtem otevření lahviček. Proto je z důvodu bezpečnosti, stanoven 60denní limit pro používání po prvním použití. Opatrná manipulace dle zásad správné laboratorní praxe (*) poskytuje možnost používat reagencie i po uplynutí 60 dnů. Reagencie musí vždy splnit kritéria kontroly kvality! (* To zahrnuje: Uzavírat lahvičky správnými zátkami a těsně je dotahovat / množství reagencií potřebné pro analýzu odebrat z velkých balení, mohou-li tyto reagencie přijít do styku s kontaminujícími látkami (např. séry pacientů) / reagencie co nejdřív vracet do chladničky (2 8 C). Literatura 1. Diczfalusy, E. and Mancuso, S., In: Foetus and Placenta (Klopper, A. and Diczfalusy, E. eds.), Blackwell Scientific Publications, Oxford, (1969) 2. Klopper, A. et al, Amer. J. Obstet and Gynecol 117, (1973) 3. Katagiri, H. et al, Amer. J. Obstet and Gynecol 124, (1976) 4. Young, et al, Amer. J. Obstet and Gynecol 126, (1976) 5. Goebelsmann, U. et al, Acta Endocrin 74, (1973) 6. Goebelsmann, U. and Jaffe, R. B., Acta Endocrin 66, 679 (1991) Human Gesellschaft für Biochemica und Diagnostica mbh Max-Planck-Ring 21 - D Wiesbaden - Germany Telefon: Telefax: human@human.de

5 EL-ESTRI INF GB