FSH ELISA test pro kvantitativní stanovení folikuly stimulujícího hormonu (FSH) v lidském séru

Transkript

1 FSH ELISA test pro kvantitativní stanovení folikuly stimulujícího hormonu (FSH) v lidském séru Obj. číslo: testů kompletní souprava Účel použití Folikuly stimulující hormon (FSH) je glykoproteinový hormon o přibližně 35,5 kda, který se tvoří v hypofýze. Tento hormon fyziologicky působí na varlata a vaječníky, kde podporuje tvorbu spermatu (u mužů) a steroidů (u žen). Všechny menstruační cykly mají charakteristickou šablonu vylučování FSH. Zatímco se koncentrace FSH s pokračující folikulární fází snižuje, vrcholové hodnoty jsou pozorovány blízko času ovulace, tj. okolo středu cyklu. Klinický a diagnostický význam měření FSH pro zjištění homeostázy regulace plodnosti prostřednictvím hypothalamohypofyzárně-gonadální osy byl dobře prokázán. Princip Test HUMAN FSH ELISA je založen na klasické sendvičové technice ELISA. Jako analýza druhé generace využívá extrémně vysoké afinity systému Biotin-Streptavidin. Streptavidinem je povlečen povrch mikrotitračních jamek. V prvním inkubačním kroku jsou vzorky, kalibrátory nebo kontroly, enzymový konjugát (protilátka proti FSH značená peroxidázou) a druhá biotinylovaná monoklonální protilátka proti FSH smíchány za vzniku sendvičového komplexu, který je vázán na povrch jamek interakcí biotinu s immobilizovaným streptavidinem. Na konci inkubace jsou přebytečný enzymový konjugát a monoklonální protilátky vymyty. Je přidán substrát a výsledná barva, která se po zastavení reakce ukončovacím roztokem mění na žlutou, je fotometricky měřena. Intenzita barvy je přímo úměrná koncentraci FSH ve vzorku. Koncentrace je vyhodnocena pomocí kalibrační křivky, která je stanovena z kalibrátorů dodaných se soupravou. Obsah soupravy [MIC] 12 Mikrotitrační destičky (v jednodestičkovém držáku) 8-jamkové ulamovatelné řádky, potažené streptavidinem [CAL] A - F Kalibrátory (bílé víčko) 6x2.0mlPřipraveno k použití, v lidském séru FSH koncentrace: 0 (A), 5 (B), 10 (C), 25 (D), 50 (E), a 100 (F) IU/l [CON] 13 ml Konjugát Protilátka-Enzym (bílé víčko) připraveno k použití, zelená ph 7.45 ± 0.1 anti-fsh (kozí) značené HRP, anti-fsh (monoklonální, myší) biotinylované 1.0 µg/ml [WS] 20 ml Promývací roztok (černé víčko) Koncentrát pro asi 1000 ml ph 8.8 ± 0.4 MOPSem pufrovaná sůl 5 mmol/l [SA] 7.0 ml Substrátová reagencie A (žluté víčko) ph 3.5 ± 0.1 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) 4 mmol/l Acetátový pufr 0.05 mol/l [SB] 7.0 ml Substrátová reagencie B (modré víčko) ph 4.5 ± 0.1 Peroxid močoviny 0.8 g/l Acetátový pufr 0.05 mol/l [STOP] 7.5 ml Ukončovací roztok (červené víčko) Kyselina sírová 0.5 mol/l 1 Lepící páska Konzervanty: Celková koncentrace <0,04% Bezpečnostní poznámky Nepolykejte reagencie. Zabraňte potřísnění očí, kůže a sliznic. Se všemi vzorky a [CAL] zacházejte jako s materiálem potenciálně infekčním. [CAL] byly kontrolovány na úrovni dárců na přítomnost protilátek proti HCV a HIV-1/2 a HBsAg s negativním výsledkem. Používejte ochranné oblečení a jednorázové rukavice dle zásad správné laboratorní praxe. Všechny materiály, kontaminované vzorky pacientů nebo [CAL], musí být inaktivovány schválenými postupy (autoklávování nebo chemické ošetření) v souladu s příslušnými předpisy.

2 [STOP] dráždí oči, kůži a sliznice. Při kontaktu pečlivě omývejte velkým množstvím vody a konzultujte s lékařem. Stabilita Při skladování při teplotě 2 8 C jsou reagencie stabilní do data exspirace uvedeného na jednotlivých štítcích. Po otevření musí být reagencie uloženy při teplotě 2 8 C a použity během 60 dnů (viz Poznámky). [MIC] - uzavřeno v hliníkovém obalu se sušidlem - před otevřením musí mít pokojovou teplotu - nepoužité: vraťte se sušidlem zpět do obalu a skladujte při 2-8 C. (viz poznámka) Nedotýkejte se horního okraje ani vnitřku jamek prsty! Příprava reagencií Zahřejte před použitím všechny reagencie na pokojovou teplotu (15-25 C). Nepoužívané reagencie by měly být skladovány vždy při 2-8 C Pracovní promývací roztok [WASH] -slabý zákal, který se může objevit v koncentrátu [WS], se při ředění úplně rozpustí -zřeďte [WS] tak, že vylijete obsah lahvičky do 1000 ml čerstvé deionizované vody ve vhodné nádobě. Několikrát lahvičku [WS] roztokem [WASH] propláchněte. Stabilita po zředění: 60 dní při C. Pracovní roztok substrátu [SUB] - pro použití na delší časový úsek: připravte potřebné množství smícháním stejných dílů [SA] a [SB]. Používejte pouze čisté plastikové lahvičky vypláchnuté neionizovanou vodou. - pro použití během 30 dní: Slijte obsah lahviček [SA] a [SB] dohromady, promíchejte a skladujte při 2-8 C. - se [SUB] zacházejte opatrně a zabraňte kontaminaci! Nepoužívejte, jestliže roztok vypadá modře. - Skladujte chráněné před světlem. - Stabilita: 30 dní při 2-8 C Vzorky Sérum Nepoužívejte vysoce lipemické a hemolyzované vzorky. Vzorky je možné skladovat při 2-8 C 5 dní nebo 30 dní při -20 C. Zmrazujte a rozmrazujte pouze jednou. Rozmražené vzorky musí být homogenizovány. Odstraňte částice centrifugací nebo filtrací. Pracovní postup Dodržujte postup přesně! Poznámky k postupu P1: Nemíchejte složky s jinými čísly šarží. Nezaměňujte víčka lahviček (nebezpečí kontaminace). Nepoužívejte reagencie po jejich datu exspirace. P2: Nepoužívejte reagencie, které mohou být kontaminovány nebo vypadají či páchnou jinak než je obvyklé. P3: Zaznamenávejte pečlivě vzorky a kontroly do formuláře dodávaného s kitem P4: [MIC] vyberte požadovaný počet stripů (řádek) destičky a řádně upevněte v držáku. P5: Nechte probíhat reakce kontrol, [CAL] a vzorků duplicitně (od každého dvě). Pipetujte kontroly a vzorky i [CAL] přímo na dno mikrojamek. P6: Vždy přidávejte reagencie v tomtéž pořadí, abyste minimalizovali rozdíly v reakčním čase mezi jamkami. Toto je důležité pro reprodukovatelné výsledky. Pipetování vzorků by nemělo překročit 10 minut. Jinak pipetujte kalibrační křivku v naznačených polohách v poločase série. Jestli se používá více než jedna destička, opakujte dávce odpovídající (kalibrační) křivku pro každou destičku. P7: Odstraňte vzduchové bubliny před inkubací a odečítání absorbance. P8: [SUB] inkubujte ve tmě. [SUB] iniciuje kinetickou reakci, která je zakončena přidáním [STOP]. P9: [MIC] jemně kývejte s destičkou sekund po každém pipetovacím kroku, abyste důkladně promíchali obsah jamek, aniž vylijete roztoky. Je-li to možné, míchejte na automatické míchačce. Promývací procedura Promývací procedura je kritická. Nedostatečné promytí sníží přesnost nebo falešně zvýší absorbanci. W1: Odstraňte lepící pásku, vylijte obsah jamek a přidejte [WASH] do každé jamky, po 30 sekundách navlhčování vylijte a opakujte promytí. W2: V případě automatického promývání začněte s [WASH] a promyjte stripy 3x.. Ujistěte se, že promývač úplně plní všechny jamky a účinně vylívá obsah po 30 sekundách (zbývající kapalina po vylití v jamce< 15ml). W3: Po promytí odstraňte zbývající kapalinu buničinou s destičky obrácené vzhůru nohama.

3 Pipetovací schéma Reagencie a vzorky musí mít před použitím pokojovou teplotu Krok 1 Jamka [µl] A1...D2 kalibrátory E2... vzorky [CAL] A-F; dvakrát Vzorky, Kontroly; dvakrát [CON] Promíchejte a přikryjte [MIC] lepící páskou. Inkubujte 60 min při C Promyjte 3 x jak je popsáno (viz W1 - W3) [WASH] Krok 2 [SUB] Inkubujte 15 min při C (viz P8) [STOP] Opatrně promíchejte. Změřte absorbanci at 450 nm hned, jakmile je to možné nebo během 10 min. po skončení reakce, za použití referenční vlnové délky nm (je-li to možné). Platnost testu Výsledky testu jsou platné, jsou-li splněna následující kritéria: 1) Maximální absorbance (kalibrátor F) O.D. max 1,5 2) Analyzuje se na 3 úrovních: Koncentrace FSH při 80 % O.D. max. = 75 ± 20 IU/l Koncentrace FSH při 50 % O.D. max. = 40 ± 10 IU/l Koncentrace FSH při 20 % O.D. max. = 15 ± 5 IU/l Výpočet Kalibrační křivka se používá k odečtení koncentrace FSH v neznámých vzorcích. 1. Vyneste na milimetrový papír absorbance duplicitních kalibrátorů proti odpovídající koncentraci FSH v IU/l (nepočítejte z dvojic průměrnou hodnotu a vyneste obě hodnoty absorbance). 2. Vytvořte regresní přímku. 3. Koncentraci FSH v neznámém vzorku (S) zjistíte tak, že od hodnoty průměrné absorbance vzorku na svislé ose vedete přímku až protne křivku, tomuto bodu odpovídá na horizontální ose příslušná koncentrace (v IU/l). Pro ilustraci viz obrázek. Interpretace výsledků Koncentrace FSH závisí na různých jiných faktorech:, než je hypofyzární homeostáza. Proto pouze samotný údaj o FSH nestačí pro zhodnocení klinického stavu. FSH je potlačován estrogeny, přesto u žen užívajících orální antikoncepci mohou být hladiny FSH normální. K nízké koncentraci FSH může vést nadměrná dieta a ztráta váhy. Očekávané hodnoty Fáze cyklu FSH [IU/l] Folikulární fáze Střed cyklu Luteální fáze Stav po menopauze 3,0 12,0 8,0 22,0 2,0 12,0 35,0-151 U mužů byly hlášeny hodnoty FSH 1,0 14,0 IU/l. Každá laboratoř by si měla stanovit své vlastní očekávané hodnoty vzhledem k používaným přístrojům, metodám odběru krve a testovacím technikám obecně v této laboratoři užívaným Parametry testu Test ELISA FSH HUMAN má citlivost zhruba 0,8 IU/l FSH. Vzorky s koncentracemi přesahujícími 100 IU/l musí být zředěny smícháním 25 ml vzorku s 25 ml kalibrátoru A (0,0 IU/l FSH) v odpovídajících jamkách se vzorky. Výsledek násobte 2. Analýza je standardizována ve shodě s WHO 2. IRP (78/549)

4 Typické údaje o parametrech testu lze najít ve Verification Report na: or Poznámka Výrobky jsou i po otevření stabilní do data exspirace. Jejich kontaminace ovšem přímo souvisí s počtem otevření lahviček. Proto je z důvodu bezpečnosti stanoven 60denní limit pro používání po prvním použití. Opatrná manipulace dle zásad správné laboratorní práce (*) poskytuje možnost používat reagencie i po uplynutí 60 dnů. Reagencie musí vždy splnit kritéria kontroly kvality! (* To zahrnuje: Uzavírat lahvičky správnými zátkami a těsně je dotahovat / množství reagencií potřebné pro analýzu odebrat z velkých balení, mohou-li tyto reagencie přijít do styku s kontaminujícími látkami (např. séry pacientů) / reagencie co nejdřív vracet do chladničky (2 8 C). Literatura 1. Odell W,D., et al., Journal of Clinical Investigation 47, 2551 (1961) Human Gesellschaft für Biochemica und Diagnostica mbh Max-Planck-Ring 21 - D Wiesbaden - Germany Telefon: Telefax: Saxema B.B., et al., Journal of Clinical Endocrinology nad Metabolism 28, 591 (1968)

5 EL-FSH INF GB