Návod k použití. 1. Použití Klinické využití a princip metody Složení soupravy (kitu)... 4

Transkript

1 Ref

2 Návod k použití Obsah 1. Použití Klinické využití a princip metody Složení soupravy (kitu) Uchovávání, skladování, exspirace Upozornění Zdravotní rizika Obecná pravidla pro použití soupravy Odběr vzorku, manipulace a uchovávání Postup stanovení Přípravy před pipetováním Pipetovací schéma Pracovní postup Kvantitativní a kvalitativní interpretace Technická data Charakteristika Analytická citlivost Specifičnost a senzitivita Linearita Přesnost Kalibrace Literatura...11 Distributor: BioVendor Laboratorní medicína a.s. Karásek 1767/ Brno, Česká republika Tel.: Fax: Info@biovendor.cz Výrobce: AESKU.DIAGNOSTICS GmbH & Co. KG Mikroforum Ring Wendelsheim, Germany Tel.: Fax: Info@aesku.com

3 1. Použití AESKULISA je enzymoimuno-analytická souprava pro oddělenou kvantitativní a kvalitativní detekci revmatoidních faktorů (RF) IgG, IgM, a IgA v lidském séru využívající vysoce čištěného Fc fragmentu humánního imunoglobulinu (IgG). Tuto metodu lze využít k diagnostice revmatoidní artritidy (RA). 2. Klinické využití a princip metody Revmatoidní faktory (RF), které byly poprvé popsány v roce 1940 jako protilátky reagující s gama globuliny; jde o autoprotilátky, které jsou namířené proti C-terminální části konstantního fragmentu těžkého řetězce IgG (IgG Fc). Ačkoli jsou revmatoidní faktory pojmenovány po nemoci, se kterou byly původně spjaty, vyskytují se jak u zdravé populace, tak u řady dalších nemocí. Mezi nemoci běžně spojené s vysokými koncentracemi RF patří revmatoidní artritida (RA; 50-90%) a Sjögrenův syndrom (SS; 75-95%). RF běžně nacházíme také při systémovém lupus erythematodes (SLE; 15-35%), systémové skleróze (20-30%), polymyozitidě/dermatomyozitidě (5-10%), kryoglobulinemii (40-100%), a smíšených onemocnění pojivových tkání (MCTD; 50-60%). I když je přítomnost IgM RF v séru pokládána za nejdůležitější laboratorní indikátor přítomnosti RA (a proto je zahrnuta v doporučení ACR jako jedno z kritérií pro stanovení diagnózy), revmatoidní faktory podtřídy IgG a IgA jsou pro diagnózu a diferenciální diagnózu neméně důležité. Ve srovnání s konvenčními metodami, jako je latexový aglutinační test a nefelometrie, poskytuje detekce těchto izotypů vzhledem k diagnóze, diferenciální diagnóze a sledování pacientů s RA doplňkovou informacíi. Zatímco RF podtřídy IgM jsou nejvíce senzitivní pro diagnózu RA, a tedy vhodnější pro screening RA, RF podtřídy IgG jsou nejvíce specifické pro RA a podobně jako IgA korelují s klinickým obrazem a aktivitou onemocnění. Přítomnost protilátek všech tří podtříd dohromady je téměř 100% specifická pro diagnózu RA. RF při SLE jsou spojeny se sicca syndromem, hypergammaglobulinemií, vysokým titrem antinukleárních protilátek, anémií a obvykle objevením se SS-A a SS-B protilátek. Všechny tři podtřídy jsou nalézány při SLE. Zejména podtřída IgA vymezuje podskupinu SLE pacientů charakterizovanou odlišným autoimunitním fenoménem a vysokou aktivitou nemoci s absencí nefritidy. Princip stanovení Vzorky séra ředěné 1:101 jsou inkubovány na mikrotitračních destičkách v jamkách pokrytých specifickým antigenem. Jsou-li ve vzorku séra pacienta přítomny protilátky, naváží se na antigen. Jejich nenavázaná frakce se v následujícím kroku vymyje. Poté je přidán konjugát (protilátka proti lidskému imunoglobulinu konjugovaná s křenovou peroxidázou), vzorek inkubován a dojde k reakci s komplexem antigen-protilátka, vzniklém v mikrodestičce v předchozím kroku. Nenavázaný konjugát je v dalším kroku vymyt. Přídavek roztoku substrátu TMB (tetramethylbenzidin) vede k enzymatické kolorimetrické reakci (modrá barva), která je zastavena přidáním zředěné kyseliny (barva se změní na žlutou). Intenzita barvy vzniklé z chromogenu je přímo úměrná množství konjugátu vázaného na komplex antigen-protilátka a potažmo množství původní koncentrace příslušných protilátek ve vzorku zkoumaného séra.

4 3. Složení soupravy (kitu) Položka Ředící roztok (5x) Promývací roztok Položka Negativní kontrola Pozitivní kontrola Cut-off kalibrátor Množství NUTNO PŘIPRAVIT PŘED POUŽITÍM Barva víčka Barva roztoku 1 x 200 ml Bílá Žlutá 1 x 200 ml Bílá Zelená Množství PŘIPRAVENO K POUŽITÍ Barva víčka Barva roztoku 1 x 1,5 ml Zelená Bez barvy 1 x 1,5 ml Červená Žlutá 1 x 1,5 ml Modrá Žlutá Kalibrátory 6 x 1,5 ml Bílá Žlutá Konjugáty, IgG IgM IgA Roztok substrátu TMB Zastavovací roztok Mikrotitrační deska 1 x 15 ml 1 x 15 ml 1 x 15 ml Modrá Zelená Červená Modrá Zelená Červená 1 x 15 ml Černá Bez barvy Popis / obsah 5x koncentrovaný Tris, chlorid sodný (NaCl), bovinní sérový albumin (BSA(, azid sodný <0,1% (konzervační látka) 50x koncentrovaný Tris, NaCl, Tween 20, azid sodný <0,1% (konzervační látka) Popis / obsah Lidské sérum (naředěné), bovinní sérový abumin (BSA), azid sodný <0,1% (konzervační látka) Lidské sérum (naředěné), bovinní sérový abumin (BSA), azid sodný <0,1% (konzervační látka) Lidské sérum (naředěné), bovinní sérový abumin (BSA), azid sodný <0,1% (konzervační látka) Koncentrace každého kalibrátoru: 0, 3, 10, 30, 100, 300 U/ml. Lidské sérum (ředěné), bovinní sérový albumin (BSA), azid sodný <0,1% (konzervační látka) Obsahuje: protilátka proti lidskému imunoglobulinu konjugovaná s křenovou peroxidázou, bovinní sérový albumin (BSA) Stabilizovaný tetramethylbenzidin a peroxid vodíku TMB/H2O2 1 x 15 ml Bílá Bez barvy 1M kyselina chlorovodíková 12 x 8 jamek v oddělitelných proužcích * Barva tmavne se zvyšující se koncentrací N/A N/A S oddělitelnými mikrojamkami. Viz paragraf 1 potahování. DALŠÍ POTŘEBNÝ MATERIÁL (NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU) Přístroj na měření absorbancí mikrotitračních destiček (reader) s filtrem 450 nm, a volitelným 620 nm referenčním filtrem ( nm). Laboratorní sklo (odměrný válec ml), zkumavky pro ředění roztoků. Vortex, pipety s přesností 10, 100, 200, 500, 1000 l nebo multikanálová pipeta μl. Přístroj na promývání mikrotitračních destiček (300 μl opakování nebo multikanálová pipeta nebo automatický systém), adsorbční papír. Naše testy jsou vyrobeny k použití s purifikovanou vodou odpovídající definici Pharmacopeia USA (USP 26-NF 21) a European Pharmacopeia (Eur. Ph. 4th Ed.).

5 4. Uchovávání, skladování, exspirace Všechny reagencie a mikrotitrační destičku uchovávejte v originálních obalech při teplotě 2-8 C. Rekonstituované (rozpuštěné připravené roztoky) jsou při teplotě 4 C stabilní minimálně 1 měsíc. Reagencie a mikrotitrační destičky by měly být používány pouze do vypršení exspirace, uvedené na každé komponentě. Vyhněte se intenzivní expozici roztoku substrátu TMB světlem. Uchovávejte mikrotitrační destičky v originální fólii včetně desikantu, fólii vždy neprodyšně uzavřete (zalepte). 5. Upozornění 5.1. Zdravotní rizika Tento produkt je určen POUZE PRO POUŽITÍ IN VITRO. Se soupravou by měl pracovat pouze personál odborně způsobilý a speciálně vyškolený v manipulaci s diagnostickými metodami IN VITRO. Ačkoli tento produkt není za normálních podmínek používání považován za přímo škodlivý nebo nebezpečný, k zajištění maximální bezpečnosti pročtěte následující text: Doporučení a bezpečnostní opatření Tato souprava obsahuje potenciálně nebezpečné komponenty. Přestože reagencie soupravy nejsou klasifikovány jako dráždivé vůči očím a kůži, doporučujeme vyhnout se jejich kontaktu s očima a kůží a při práci používat jednorázové rukavice. POZOR! Kalibrátory, kontroly a pufry obsahují azid sodný (NaN3) jako konzervant. NaN3 může být toxický při požití nebo při potřísnění kůže nebo proniknutí do očí. NaN3 může reagovat s olověným nebo měděným potrubím za vytvoření vysoce výbušných kovových azidů. Při likvidaci promyjte odpad proudem vody kvůli zabránění jejich vzniku. Prosíme, řiďte se pokyny pro dekontaminaci dle CDC nebo jiných místních/národních pravidel. Nekuřte, nejezte a nepijte, pracujete-li se soupravou. Nepipetujte ústy. Veškerý materiál lidského původu použitý pro výrobu této soupravy (kontroly, standardy atd.) byl schválenými metodami testován a potvrzen negativním na HbsAg, Hepatitis C a HIV 1. Nicméně žádný test nemůže garantovat úplnou absenci virových agens v takovýchto materiálech. Proto zacházejte s kontrolami, standardy a vzorky sér pacientů jako s potenciálně infekčními materiály v souladu s platnými předpisy. Souprava obsahuje materiál zvířecího původu, jak je uvedeno v tabulce se složením, pracujte proto s materiálem v souladu s platnými předpisy Obecná pravidla pro použití soupravy V případě, že příbalový leták včetně štítků je vadný nebo nesprávný, kontaktujte prosím výrobce nebo dodavatele soupravy. Nesměšujte a nenahrazujte reagencie nebo mikrotitrační destičky s odlišnými čísly šarže. Mohlo by to vést k odlišným výsledkům. Pro optimální výkonnost testu umožněte všem komponentám dosáhnout před použitím pokojové teploty (20-32 C), dobře promíchejte a dodržujte doporučené inkubační schéma. Inkubace: U automatizovaných systémů doporučujeme test provádět při 30 C. Nikdy nevystavujte komponenty teplotám vyšším než 37 C. Při pipetování roztoku substrátu vždy používejte nové nepoužité špičky. Chraňte toto reagens před světlem. Nikdy nepipetujte konjugát špičkou použitou dříve s jinou reagencií.

6 Definitivní klinická diagnóza by neměla být založena pouze na výsledcích provedených testů, ale měla by být stanovena lékařem po zhodnocení všech klinických a laboratorních nálezů. Diagnóza musí být ověřena pomocí různých diagnostických metod. 6. Odběr vzorku, manipulace a uchovávání Používejte přednostně čerstvě získané vzorky séra. Odběr krve musí být proveden podle platných předpisů. Nepoužívejte ikterické, lipemické, hemolyzované nebo bakteriemi kontaminované vzorky. Séra s obsahem částic by měla být vyčištěna nízkorychlostním odstředěním (<1000 x g). Vzorky krve by měly být odebrány do čistých, suchých a prázdných zkumavek. Po separaci by sérum mělo být ihned použito, případně uschováno v těsně uzavřené zkumavce při teplotě 2-8 C max. 3 dny, pro delší uschování pak zamraženo na teplotu -20 C. 7. Postup stanovení 7.1. Přípravy před pipetováním Nařeďte koncentrované reagencie Nařeďte koncentrovaný ředící roztok 1:5 destilovanou vodou (např. 20 ml + 80 ml). Nařeďte koncentrovaný promývací roztok 1:50 destilovanou vodou (např. 20 ml ml). Abyste se vyhnuli chybě, doporučujeme označit víčka různých kalibrátorů. Vzorky: Nařeďte vzorky sér 1:101 s ředícím roztokem (1x) (např l ředícího roztoku (1x) + 10 l séra. Dobře promíchejte!! Promývání: Připravte 20 ml naředěného promývacího roztoku (1x) pro 8 jamek, nebo 200 ml pro 96 jamek (např. 4 ml koncentrátu ml destilované vody). Automatické promývání: Zvažte nadbytečný objem požadovaný pro nastavení přístrojů a mrtvý objem robotické pipety. Manuální promývání: Slijte tekutinu z jamek obrácením destičky. Energicky poklepejte rámem destičky s jamkami obrácenými dolů na čistý adsorpční papír. Napipetujte 300 l naředěného promývacího roztoku do každé jamky a počkejte 20 sekund. Opakujte celý postup ještě dvakrát. Mikrodestičky: Zjistěte počet jamek nezbytný pro provedení testu. Odstraňte nevyužité jamky z rámu, pro uschování je umístěte do poskytnutého plastikového obalu spolu s desikantem, v něm neprodyšně zalepte a uchovejte při teplotě 2-8 C.

7 7.2. Pipetovací schéma Doporučujeme pipetovat kalibrátory, kontroly a vzorky následně: Poznámka: jestliže paralelně stanovujete IgG, IgA i IgM, musí být kalibrační roztoky, kontroly a vzorky připraveny pro každou podskupinu samostatně. Pro KVALITATIVNÍ interpretaci Pro KVALITATIVNÍ interpretaci CalA: kalibrátor A CalD: kalibrátor D PC: pozitivní kontrola P1: pacient 1 CalB: kalibrátor B CalE: kalibrátor E NC: negativní kontrola P2: pacient 2 CalC: kalibrátor C CalF: kalibrátor F CC: cut off kalibrátor P3: pacient Pracovní postup Krok Popis 1. Před pipetováním zajistěte, aby byly provedeny činnosti z kroku 7.1 výše. 2. Proveďte následující kroky v souladu s kvantitativní/kvalitativní interpretací výsledků: 3. KONTROLY & VZORKY Napipetujte 100 µl do připravených jamek, jak je popsáno v kapitole 7.2 výše: a. kalibrátorů (CAL.A až CAL.F) pro KVANTITATIVNÍ nebo b. cut-off kalibrátor (CC) pro KVALITATIVNÍ interpretaci a 100 µl od každého: Negativní kontrola (NC) a Pozitivní kontrola (PC) a Naředěná séra pacientů (P1, P2..) 4. Inkubujte 30 minut při C. 5. Promyjte 3x s 300 µl promývacího roztoku (naředěného 1:50). KONJUGÁT

8 6. Napipetujte 100 µl konjugátu do každé jamky. 7. Inkubujte 30 minut při při teplotě C. 8. Promyjte 3x s 300 µl promývacího roztoku (naředěného 1:50). SUBSTRÁT 9. Napipetujte 100 µl roztoku substrátu TMB do každé jamky. 10. Inkubujte v temnu 30 minut při při teplotě C. ZASTAVOVACÍ ROZTOK 11. Napipetujte 100 µl stop činidla do každé jamky za použití stejného postupu, jako při pipetování substrátu.

9 12. Inkubujte minimálně 5 minut sekund opatrně protřepávejte destičku. 14. Změřte absorbance při vlnové délce 450 nm (volitelně 450/620 nm) do 30 minut po předchozím kroku. 8. Kvantitativní a kvalitativní interpretace Pro kvantitativní interpretaci sestrojte křivku vedenou průsečíky bodů vzniklých vynesením hodnot OD (optické denzity), získaných měřením každého kalibračního roztoku na osu Y a korespondujících hodnot koncentrací kalibračních roztoků (U/ml), které leží na ose X. Pro dosažení optimálních výsledků doporučujeme použít log/lin funkce nebo 4-parametrové funkce. Z OD každého zkoumaného vzorku zjistěte korespondující koncentraci protilátek vyjádřenou v U/ml. Normální rozmezí Neprůkazné výsledky Pozitivní výsledky < 12 U/ml U/ml > 18 U/ml Příklad standardní křivky Nepoužívejte tento příklad pro interpretaci výsledků vyšetření vzorků Vašich pacientů!!! Příklad výpočtu Kalibrační roztoky IgA/IgG/IgM OD 450/620 nm CV % 0 U/ml 0,035 2,3 3 U/ml 0,138 2,6 10 U/ml 0,342 3,2 30 U/ml 0,632 3,2 100 U/ml 1,216 0,5 300 U/ml 2,178 0,1 Pacient Opakování (OD) Průměr (OD) Výsledek (U/ml) P 01 0,872/0,922 0,897 54,7 P 02 1,159/1,188 1,174 86,3 Vzorky nad nejvyšším kalibračním rozmezím by měly být reportovány jako >Max. Měly by být ředěny jako přiměřené a znovu testované. Vzorky pod kalibračním rozmezím by měly být reportovány jako < Min.

10 Údaje o každé jednotlivé šarži jsou přiloženy v letáku o kontrole kvality. Laboratoře mohou provádět vlastní kontrolu kvality používáním vlastních kontrol a/nebo interních směsných sér, jak uvádějí směrnice EU. Každá laboratoř by měla stanovit své vlastní referenční rozmezí odvozené od jejích vlastních technik, kontrol, vybavení a populace pacientů s ohledem na její vlastní zavedené postupy. V případě, že hodnoty kontrol nesplňují kritéria, je test neplatný a musí být opakován. Následující technické záležitosti by měly být ověřeny: Datum exspirace (připravených) reagencií, skladovací podmínky, pipety, přístroje, fotometr, inkubační podmínky a promývací metody. V případě, že testované položky vykazují abnormální hodnoty nebo jinou odchylku nebo kritéria validace nejsou splněna bez vysvětlitelných příčin, obraťte se na výrobce nebo dodavatele této soupravy. Pro kvalitativní interpretaci zjistěte optickou denzitu cut-off kalibrátoru a vzorků pacienta. Srovnejte OD vzorků pacienta s OD cut-off kalibrátoru. Pro kvalitativní stanovení doporučujeme považovat výsledky vzorků sér v rozmezí 20% okolo hodnoty výsledku cut-off kalibrátoru jako neprůkazné. Všechny vzorky, jejichž OD je vyšší než OD cut- off kalibrátoru, jsou považovány za pozitivní, vzorky s nižším OD jsou považovány jako negativní. Negativní: OD pacienta < 0,8 x OD cut-off Šedá zóna: 0,8 x OD cut-off OD pacienta 1,2 OD cut-off Pozitivní OD pacienta > 1,2 x OD cut-off 9. Technická data Vyšetřovaný materiál: Objem vzorku: Celková inkubační doba: Kalibrační rozmezí: Detekční limit: Uchovávání: Počet stanovení: sérum 10 µl vzorku naředěného 1:101 s 1x ředícího roztoku 90 minut při teplotě C U/ml 1,0 U/ml při 2-8 C, používejte pouze originální lahvičky 96 testů 10. Charakteristika Analytická citlivost Testováním ředícího pufru (30x) na AESKULISA (kat.č. 7161) byla analytická citlivost této soupravy stanovena na 1,0 U/ml Specifičnost a senzitivita Mikrodestičky jsou pokryty Fc fragmentem humánního imunoglobulinu (IgG). Nebyla zjištěna zkřížená reaktivita s ostatními autoantigeny. Revmatoidní faktory jsou detekovány u 70-90% pacientů s revmatoidní artritidou (RA).

11 10.3. Linearita Touto soupravou byla testována vybraná séra, přičemž byla zjištěna lineární korelace. Nicméně vzhledem k heterogenní povaze lidských autoprotilátek mohou existovat vzorky, které se nebudou chovat v souladu s tímto principem. Vzorek číslo Diluční faktor Naměřená koncentrace (U/ml) Předpokládaná koncentrace (U/ml) Vzájemný poměr (%) 1 1 / ,1 53,4 95,7 1 / ,2 26,7 94,4 1 / ,4 13,4 92,5 1 / 800 6,3 6,7 94,0 1 / 800 6,3 6,7 94,0 2 1 / ,1 138,0 97, Přesnost 1 / ,0 69,0 107,2 1 / ,1 34,5 93,0 1 / ,1 17,3 93,0 K určení přesnosti této metody byla posouzena variabilita (intra a inter-asay) a to na reprodukovatelnosti výsledků tří vybraných reprezentativních vzorků reprezentujících rozmezí hodnot nad kalibrační křivkou. Intra-Assay Inter-Assay Vzorek č. Průměr (U/ml) CV (%) Vzorek č. Průměr (U/ml) CV (%) 1 15,2 0,4 1 18,3 1,0 2 43,4 4,5 2 52,1 4, ,8 8, ,7 8, Kalibrace S ohledem na neexistenci mezinárodních referenčních kalibračních hodnot je tento test kalibrován v arbitrárních jednotkách (U/ml) pro IgG a IgA revmatoidní faktory. Pro IgM revmatoidní faktor je test kalibrován podle mezinárodního standardu WHO a výsledky jsou dány v IU/ml. 11. Literatura Peter JB, Shoenfeld Y (1996). Autoantibodies. Elsevier Sciences B.V., Amsterdam. Witte T, Hartung K, Sachse C, Matthias T, Fricke M, Kalden JR, Lakomek HJ, Peter HH, Schmidt RE (2000). Rheumatoid factors in systemic lupus erythematosus: Association with clinical and laboratory parameters. SLE study group. Rheumatol Int 19:

12 In vitro diagnostický prostředek Katalogové číslo Šarže Značka shody 96 testů Viz návod k použití Použijte do Uchovávejte při 2-8 C Výrobce Cut off kalibrátor Pozitivní kontrola Negativní kontrola Kalibrátor Výtěžnost Konjugát Potažená mikrotitrační destička Promývací roztok Substrát Zastavovací roztok Ředící roztok