UTILISATION OF INTRACELLULAR ESTERASES FOR STUDY OF EXPLANT CULTURES VYUŽITÍ INTRACELULÁRNÍCH ESTERAS PRO STUDIUM EXPLANTÁTOVÝCH KULTUR

Transkript

1 UTILISATION OF INTRACELLULAR ESTERASES FOR STUDY OF EXPLANT CULTURES VYUŽITÍ INTRACELULÁRNÍCH ESTERAS PRO STUDIUM EXPLANTÁTOVÝCH KULTUR Víteček J. 1, Kizek R. 2, Petřek J. 1, Vacek J. 2, Havel L. 1 1 Ústav botaniky a fyziologie rostlin a 2 Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno, Česká republika. vitecek@ .cz ABSTRACT Growth is one of the basic properties of biological systems. The methods, which are commonly used for the determination of growth, are usually difficult and not very precise. In the present work we decided to test if the intracellular esterase activity can serve as a growth marker. To prove this hypothesis we used tobacco cell suspension (BY-2 line) and early somatic embryos of Norway spruce (clone 2/32) grown on semi-solid medium. Activity of intracellular esterases was detected by means of spectrophotometry and spectrofluorimetry Activity of intracellular esterases correlated well with the others growth characteristics. Keywords: BY-2, cell suspension, early somatic embryo, esterase, Norway spruce ABSTRAKT Růst představuje jednu ze základních charakteristik biologického systému. Běžně využívané metody pro stanovení růstu explantátových kultur jsou v některých případech obtížně proveditelné a kromě toho vykazují značnou experimentální chybu. Proto jsme přistoupili k testování esteras jako potenciálního růstového markeru. V našich experimentech jsme použili buněčnou suspenzi tabáku (linie BY-2) a kulturu raných somatických embryí smrku ztepilého (klon 2/32) kultivované na polotuhém mediu. Stanovení aktivity intracelulárních esteras bylo provedeno spektrofotometricky a spektrofluorimetricky. Aktivita intracelulárních esteras dobře korelovala s ostatními růstovými charakteristikami. Klíčová slova: BY-2, esterasa, buněčná suspenze, rané somatické embryo, smrk ztepilý Zkratky: ESE - rané somatické embryo smrku ztepilého; FDA - fluoresceindiacetát; pnpac - p-nitrofenylacetát; PI - propidium jodid ÚVOD Růst je jednou ze základních charakteristik biologického systému. Běžně používané metodiky pro stanovení růstových charakteristik explantátových kultur jsou založeny na sledování svěží hmotnosti nebo sušiny. Tento postup není v některých případech vhodný 1

2 z důvodu nízké výtěžnosti biologického materiálu a zásahu do kultivačního prostředí. Umožňuje-li to uspořádání experimentu, je vhodné použít počítačovou analýzu obrazu (Häder, 1992). Při práci se suspenzními kulturami se obvykle stanovuje buněčná hustota mikroskopickým pozorováním v počítací komůrce. Nicméně tato metoda je časově náročná a nelze ji úspěšně aplikovat vytváří-li buňky velké shluky. Rutinní sledování růstových charakteristik suspenzních kultur lze také realizovat nepřímo např. stanovením optické hustoty. Ovšem zde představuje závažný problém změna morfologie buněk během kultivační doby (Dixon a Gonzales, 1994; Jakoby a Pastan, 1979). Nutno podotknout, že ani jedna z výše uvedených metod neumožňuje rozlišit živé a mrtvé buňky. Stav kultury se také obvykle charakterizuje relativním zastoupením životaschopných buněk viabilitou. Pro stanovení viability bylo vyvinuto několik metod. Nějčastěji se provádí tzv. dye exclusion test založený na selektivní permeabilitě cytoplazmatické membrány. Dále je možné sledovat funkční metabolizmus buněk. Jednu z možností představují intracelulární esterasy. Jejich aktivitu lze detekovat prostřednictvím chromogenního nebo fluorigenního substrátu, který může pronikat přes intaktní cytoplazmatickou membránu, a to buď mikroskopicky nebo pomocí in vitro enzymového testu. (Amano a kol., 2003; Ishikawa a kol., 1995; Jones a Senft, 1985; Regel a kol., 2002; Steward a kol., 1999). Kromě toho některé publikované výsledky naznačují, že aktivita intracelulárních esteras dané kultury závisí pouze na počtu živých buněk (Amano, 2003; Steward a kol., 1999). MATERIÁL A METODY Chemikálie Všechny použité chemikálie byly v čistotě p. a. FDA a pnpac byly zakoupeny u firmy Sigma Aldrich Chemical Corp. (St. Louis, USA). Kultivační media byla připravena z chemikálií dodaných firmou Duchefa Biochemie BV (Haarlem, Nizozemí). Media a roztoky byly připraveny rozpuštěním příslušných látek v deionizované vodě Milli Q (18,2 MΩ). Buněčná suspenze BY-2 Suspenzní kultura tabáku linie BY-2 byla udržována v tekutém MS mediu obohaceném sacharosou (30 g.l -1 ), KH 2 PO 4 (0.2 g.l -1 ), thiaminem (1 mg. l -1 ) a kyselinou 2,4- dichlorfenoxyoctovou (0.2 mg.l -1 ) (Nagata a kol., 1992). Suspenze (20 ml) v 50 ml Erlenmeyerových baňkách byla umístěna na třepačce (Kühner Shaker, typ LT-W) za těchto kultivačních podmínek: tma, teplota 27±1 C, 135 ot.min -1. Subkultivace byla prováděna po 3 nebo 4 dnech přenesením 2 resp. 1 ml suspenze do čerstvého media. Pro experimenty byla použita kultura založená z 1 ml inokula. Raná somatická embrya smrku ztepilého 2

3 Klon 2/32 ESE odvozený na Ústavu botaniky a fyziologie rostlin (Havel a Procházka, 1992), byl udržován na modifikovaném LP/2 mediu (Havel a Durzan, 1996) v Petriho miskách o průměru 100 mm, kde bylo umístěno 10 embryonálních shluků. Subkultivace probíhala po 2 týdnech přenesením svrchních částí shluků na čerstvé medium. Kultury byly umístěny ve tmě při 23±2 C. Test viability Pro stanovení viability bylo použito modifikované dvojité barvení FDA/PI (Jones a Senft, 1985). Vzorek kultury byl doplněn tekutým mediem na objem 50 µl a byl inkubován 5 min při pokojové teplotě s FDA (1 µg.ml -1 ) a PI (20 µg.ml -1 ). Zastoupení živých (zeleně zbarvených) a mrtvých (červeně zbarvených) buněk bylo vyhodnoceno pomocí fluorescenčního mikroskopu (Olympus AX 70) vybaveného pro širokopásmovou UV excitaci (kostka U-MWU). Stanovení hustoty suspenze Vzorek buněčné suspenze byl zředěn destilovanou vodou a pipetován do Fuchs-Rosenthalovy počítací komůrky. Počet buněk zjištěný mikroskopickým pozorováním byl převeden na buněčnou hustotu podle parametrů počítací komůrky. Počítačová analýza obrazu Obrazy Petriho misek s ESE byly snímány pomocí kamery (UVP-GDS 8000, Sony) připojené k PC se softwarem Grab-IT (Synoptics Ltd., verze ). Pro tyto účely byla zvolena citlivost 5 bodů.mm -2 a 8-bitová hloubka odstínů šedi (Petřek a kol., 2003). Plocha embryonálních klastrů byla spočítána pomocí programu Image-Pro Plus (Sony, verze 1.3). Stanovení aktivity intracelulárních esteras Vzorky suspenze BY-2 (0,2 ml pro a fluoresceindiacetátový test a 0,5 ml pro nitrofenylacetátový test) a kultury 2/32 ESE (200 mg svěží hmotnosti) byly promyty 250 mm fosfátovým pufrem (ph 8,7) a centrifugovány (360 g, 10 min, 20 C). Tento krok byl opakován dvakrát. Získaný pelet byl rozsuspendován ve výše uvedeném pufru a uložen při 20 C. Rozmrazené vzorky byly doplněny na objem 1 ml fosfátovým pufrem (250 mm, ph 8,7) a desintegrovány v pístovém homogenizátoru uloženém v ledové lázni. Homogenát byl centrifugován ( g, 15 min, 4 C). Alikvot supernatantu byl přidán do reakční směsi obsahující fosfátový pufr (250 mm, ph 8,7) a 1 mm pnpac nebo 5 µm FDA. Po 15 minutové inkubaci v termostatu (35 C) byla změřena absorbance (Anthelie, Secoman) při 405 nm nebo v případě FDA fluorescence (RF-551, Shimadzu) excitace 490 nm / emise 514 nm. Zásobní roztoky obou substrátů v bezvodém acetonu byly uchovávány v dobře uzavřených nádobkách při 20 C. Množství acetonu v reakční směsi nepřekročilo 1 % (v/v). VÝSLEDKY A DISKUSE Esterasy se v rostlinných buňkách, popřípadě pletivech účastní mnoha biochemických dějů, jako například výstavby buněčné stěny (Willats a kol., 2001), metabolizmu xenobiotik 3

4 (Cummins a kol., 2001; Sandermann, 1992) a některých signálních procesů (Stuhlfelder a kol., 2002). Lze je také využít jako marker vývoje organizmu (Preťová a kol., 2001; Rasol a kol., 1999; Tchorbadjieva a Odjakova, 2001) a viability (Jones a Senft, 1985; Steward a kol., 1999). Některé práce naznačují, že aktivita intracelulárních esteras dané kultury závisí pouze na počtu živých buněk (Amano a kol., 2003; Steward a kol., 1999). Proto jsme prověřovali možnost jejich využití jako růstového markeru. Experimenty byly provedeny na buněčné suspenzi tabáku - linie BY-2, která představuje velmi dobrý modelový systém (Nagata a kol., 1992), a shlucích 2/32 ESE kultivovaných na polotuhém mediu (Havel a Procházka, 1992; Petřek a kol., 2003). Během experimentu nedocházelo k významným změnám viability obou zmíněných kultur (Obr. 1B a 2B). Stanovení aktivity intracelulárních esteras Intracelulární esterasy byly detekovány v buněčném extraktu prostřednictvím enzymové hydrolýzy pnpac a FDA. Zvolené koncentrace substrátů (1 mm pnpac a 5 µm FDA) představují nejvyšší možné u kterých nehrozí vznik zákalu. pnpac je esterasou konvertován na barevný produkt detekovatelný spektrofotometricky. Tato metoda nevyžaduje nákladné přístrojové vybavení, avšak díky nižší citlivosti (viz. dále) je třeba připravit větší množství vzorku. Naproti tomu FDA, jehož produkt hydrolýzy lze sledovat fluorimetricky umožňuje vysoce citlivé stanovení aktivity esteras. Aktivita intracelulárních esteras v buněčné suspenzi BY-2 Ze suspenze byly ve stanovených časech odebírány vzorky pro získání růstových a biochemických charakteristik. Růstová křivka (Obr. 1A) byla sestavena z dat získaných pomocí Fuchs-Rosenthalovy počítací komůrky. Tato metoda vykazuje značnou experimentální chybu (až 20 %). Růstová křivka sestavená na základě naměřených aktivit intracelulárních esteras je v dobré korelaci s přímým počítáním buněk. Navíc došlo k významnému snížení experimentální chyby (Obr. 1A). Abychom prověřili zda intracelulární esterasy představují vhodný marker pro konstrukci růstové křivky, byla aktivita intracelulárních esteras v různých časech kultivace vztažena na počet živých buněk. Obrázky 1B a 1C ukazují, že aktivita intracelulárních esteras konstantního množství živých buněk kolísá v průběhu kultivační doby díky chybě počítání buněk. 4

5 Obr. 1: Aktivita intracelulárních esteras buněčné suspenze BY-2, A: Růstová křivka stanovená mikroskopickým počítáním buněk a měřením aktivity intracelulárních esteras prostřednictvím enzymové hydrolýzy pnpac a FDA. 100 % aktivity intracelulárních esteras představuje 0.07 IU resp IU na 1 ml buněčné suspenze, B: Aktivita intracelulárních esteras 10 5 živých buněk stanovená nitrofenylacetátovým testem a zastoupení mrtvých buněk v závislosti na kultivační době. 100 % představuje aktivitu IU, C: Aktivita intracelulárních esteras 10 5 živých buněk stanovená fluoresceindiacetátovým testem v závislosti na kultivační době. 100 % představuje aktivitu IU (C) Aktivita intracelulárních esteras v kultuře 2/32 ESE Pro konstrukci růstové křivky bylo využito měření plochy shluků 2/32 ESE prostřednictvím počítačové analýzy obrazu (Obr. 2A). Tato metoda je pro kulturu shluků 2/32 ESE vhodná díky své malé časové náročností a nedestruktivnímu přístupu (Petřek a kol, 2003; Víteček a kol., 2003). Růstová křivka sestavená na základě měření aktivity intracelulárních esteras koreluje s daty z počítačové analýzy obrazu (Obr. 2A). Kromě toho se aktivita intracelulárních esteras konstantního množství 2/32 ESE v průběhu kultivační doby významně nemění (Obr. 2B a 2C). 5

6 Obr. 2: Aktivita intracelulárních esteras kultury 2/32 ESE, A: Růstová křivka stanovená počítačovou analýzou obrazu a měřením aktivity intracelulárních esteras prostřednictvím enzymové hydrolýzy pnpac a FDA. 100 % aktivity intracelulárních esteras představují 0.03 IU resp IU. Vnořený obrázek ukazuje morfologii shluku ESE, B: Aktivita intracelulárních esteras 100 živých ESE stanovená nitrofenylacetátovým testem a zastoupení mrtvých ESE v závislosti na kultivační době. 100 % představuje aktivitu IU, C: Aktivita intracelulárních esteras 100 živých ESE stanovená fluoresceindiacetátovým testem v závislosti na kultivační době. 100 % představuje aktivitu 1, IU Citlivost metodik stanovení aktivity intracelulárních esteras Důležitý úkol, který zbýval vyřešit, představuje určení limitů detekce. Za tímto účelem bylo pro stanovení aktivity esteras použito několik různých alikvotů buněčných extraktů. Na základě údajů o počtu zhomogenizovaných buněk byly vypočítány detekční limity. Nitrofenylacetátovým testem lze detekovat ekvivalent přibližně 10 4 živých buněk BY-2 a 25 živých 2/32 ESE. Naproti tomu fluoresceindiacetátovým testem lze detekovat ekvivalent 800 živých buněk BY-2 a 5 živých 2/32 ESE. To znamená zvýšení citlivosti 12,5 v případě buněčné suspenze BY-2 a 5 pro případ kultury 2/32 ESE. Rozdíl mezi těmito dvěma hodnotami může být způsoben různým profilem intracelulárních esteras v obou kulturách. Fluoresceindiacetátový test vykazuje mnohem vyšší citlivost, proto je vhodný, je-li k dispozici malé množství kultury (Víteček a kol., 2003). 6

7 ZÁVĚR V této práci potvrzujeme, že lze aktivitu intracelulárních esteras využít pro stanovení růstu buněčné suspenze tabáku line BY-2 a kultury 2/32 ESE. PODĚKOVÁNÍ Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty MZLU č , FRVŠ 1203/2003 a Národního výzkumného centra LN00A081. POUŽITÁ LITERATURA Amano T, Hirasawa K, O'Donohue MJ, Pernolle J a Schioi Y (2003) Anal. Biochem. 314: 1 7. Cummins I, Burnet M a Edwards R (2001) Physiol. Plant. 113: Dixon RA a Gonzales RA (1994) In: Dixon, R. A., Gonzales, R. A. (eds) Oxford University Press,, Oxford, Great Britain. Häder D-P (1992) In: (eds) CRC Press, London. Havel L a Durzan DJ (1996) Int. J. Plant Sci. 157: Havel L a Procházka J (1992) Biol. Plant. 34: 358. Ishikawa M, Robertson AJ a Gusta LV (1995) Plant. Sci. 107: Jakoby WB a Pastan IH (1979) Method. Enzymol. 58, Academic Press, San Diego, USA. Jones KH a Senft JA (1985) J. Histochem. Cytochem. 33: Nagata T, Nemoto Y a Hasezawa S (1992) Int Rev Cytol 132: Petřek J, Vacek J, Vlašínová H, Kizek R, Procházka S a Havel L (2003) Plant Cell Rep. odesláno. Preťová A, Obert B, Hajduch M a Gregová E (2001) Sex Plant Reprod. 13: Rasol MK, Čapčić H a Hagége D (1999) Chemico-Biological Interactions : Regel RH, Ferris JM, Ganf GG a Brookes JD (2002) Aquatic Toxicol. 59: Sandermann H (1992) Trends Biochem Sci 17: Steward N, Martin R, Engasser JM a Goergen JL (1999b) Plant Cell Rep. 19: Stuhlfelder C, Lottspeich F a Mueller MJ (2002) Phytochemistry 60: Tchorbadjieva M a Odjakova MK (2001) Plant Cell Rep. 20: Víteček J, Adam V, Petřek J, Vacek J, Kizek R a Havel L (2003) Plant Tiss. Org. Cult. odesláno. Willats WGT, Orfila C, Limberg G, Buchholt HC, van Alebeek G-JWM, Voragen AGJ, Marcus SE, Christensen TMIE, Mikkelsen JD, Murray BS a Knox JP (2001) J. Biol. Chem. 276: