DETEKCE MIKROORGANISMŮ Srovnání s jinými mikrobiologickými metodami Praktické aplikace. Ladislav Čurda Ústav technologie mléka a tuků VŠCHT Praha

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "DETEKCE MIKROORGANISMŮ Srovnání s jinými mikrobiologickými metodami Praktické aplikace. Ladislav Čurda Ústav technologie mléka a tuků VŠCHT Praha"

Ondřej Liška
před 5 lety
Počet zobrazení:

1 IMPEDANČNÍ METODY DETEKCE MIKROORGANISMŮ Srovnání s jinými mikrobiologickými metodami Praktické aplikace Ladislav Čurda Ústav technologie mléka a tuků VŠCHT Praha

2 Rychlé mikrobiologické metody Význam Klasické mikrobiologické metody nevýhody referenční při zavádění nových metod Možnosti zkrácení doby mikrobiologického rozboru automatizace klasických metod alternativní metody přímé nepřímé

4 Rychlé mikrobiologické metody Význam Klasické mikrobiologické metody nevýhody referenční při zavádění nových metod Možnosti zkrácení doby mikrobiologického rozboru automatizace klasických metod alternativní metody přímé nepřímé

5 Modifikace a automatizace klasických metod Automatizované systémy pro ředění vzorků,... SystémyPetrifilm,Isogrid,Redigel PetriFoss & BioFoss

6 Rychlé mikrobiologické metody Význam Klasické mikrobiologické metody nevýhody referenční při i zavádění nových metod Možnosti zkrácen cení doby mikrobiologického rozboru automatizace klasických metod alternativní metody přímé nepřímé

7 Metody s přímým p počítáním bakteriáln lních buněk DEFT (Direct epifluorescent filter technique) BactoScan 8000S

8 BactoScan 8000S - schéma

9 Záznam PHA BactoScanu

10 BactoScan - BSC versus CFU CFU = 3 CFU = 7 BSC = 12

11 BactoScan - kalibrace

12 BactoScan - kalibrace

13 BactoScan Kalibrace Výhody rychlost (výsledek za 5 min) vysoká kapacita (80 vzorků/h) přesnost Nevýhody vysoká pořizovací cena jednoúčelové zařízení pro stanovení CPM v syrovém mléce

14 Rychlé mikrobiologické metody Význam Klasické mikrobiologické metody nevýhody referenční při i zavádění nových metod Možnosti zkrácen cení doby mikrobiologického rozboru automatizace klasických metod alternativní metody příímé nepřímé

15 Nepřímé mikrobiologické metody Princip Měřené veličiny: impedance, vodivost ATP pyruvát generované teplo radioaktivní CO 2 turbidita změna barvy indikátoru (ph, redox, volné -NH 2 skupiny) enzymová aktivita imunoreakce (ELISA)

16 Bioluminiscenční metoda Princip: luciferáza ATP+ luciferin + O > oxyluciferin + AMP + PPi + CO 2 + světlo Mg 2+ 1 CFU 0.47 (0.22 až 1.03) fg ATP Formy ATP a jejich rozlišení somatický mikrobiální Postup analýzy (přístroj Lumac)

17 Vzorek obsahující pouze mikrobiáln lní ATP:

18 Vzorek obsahující pouze mikrobiáln lní ATP:

19 Vzorek s mikrobiáln lním m i nemikrobiáln lním m ATP:

20 Vzorek s mikrobiáln lním m i nemikrobiáln lním m ATP:

21 Vzorek s mikrobiáln lním m i nemikrobiáln lním m ATP:

22 Bioluminiscenční metoda Příklady aplikací: sledování celkové kontaminace povrchu kontrola účinnosti čisticího postupu po kalibraci stanovení CPM např. v mléce Výrobci přístrojů pro stanovení ATP Lumac BioOrbit Henkel Foss Elecric (BactoFoss)

23 BactoFoss

24 BactoFoss - schéma

25 Kalibrační graf - BactoFoss

26 Bioluminiscenční metoda Výhody relativně nízká počáteční investice vysoká citlivost rychlost Nevýhody nelze rozlišit jednotlivé skupiny mikroorganismů vysoká cena chemikálií

27 IMPEDANČNÍ METODA

28 Impedanční metoda Princip Měření a registrace změn impedance růstového média v průběhu kultivace závislost průběhu změn impedance na výchozím počtu mikroorganismů Impedance

29 BacTrac - měřené veličiny iny relativní změna impedance média relativní změna elektrodové impedance detekční čas

30 Detekční čas - DT Definice - doba kultivace nutná pro dosažení nastavené změny impedance Parametry ovlivňující DT počáteční koncentrace MO druh MO (generační doba) fyziologický stav kultivační médium

31 Přístroj BacTrac Konfigurace a technické parametry Řídící počítač + inkubační bloky (až 6) Kapacita bloku 20 vzorků (MiniTrac), 40 vzorků (Bactrac 4100) Temperace Měření v opakovaně sterilovatelných celách, objem 10 ml (příp. 100 ml) Doba měření, interval snímání impedance

32 Obslužný program Demonstrační program BACDEMO.BAT

33 Porovnání impedančního měřm ěření na přístroji BacTrac s ostatními metodami ředění vzorků výhoda využití optimální teploty a selektivních médií (Salmonella, Listeria, Clostridium, Staphylococcus aureus, Enterobacteriaceae, koliformní, kvasinky) měření elektrodové impedance pro média s vyšší vodivostí po inokulaci nevyžaduje další obsluhu zkrácení doby analýzy - zejména pro více kontaminované vzorky automatické ukládání dat a jejich vyhodnocení možnost dalšího zpracování dat vzorek po kultivaci lze použít k další konfirmaci vyšší investice, avšak poměrně nízké provozní náklady

34 Aplikace impedanční metody ověř ěřované na Ústavu technologie mléka a tuků Kalibrace impedanční metody Aktivita jogurtové kultury Vliv různých podmínek na aktivitu jogurtových kultur (inokulum, teplota,...) Vliv obsahu tuku a sušiny na průběh impedanční křivky Porovnání kysací schopnosti kravského a kozího mléka Průběh kysací a impedanční křivky Opakovatelnost měření Sterilita UHT výrobku Vliv nemléčných aditiv na růst bakterií mléčného kvašení Další možnosti vyhodnocení impedanční křivky

35 Kalibrace přístrojep BacTrac 4100 Stanovení CPMM a koliformních MO v syrovém mléce a v Lučině

36 Kalibrace přístroje BacTrac 4100 CPMM v syrovém mléce, médium 001A, inokulum 10 %, 30 C b(0) = b(1) = r = 0.84 DT [h] Experimentální data Regresní přímka Konfidenční interval Log CFU

37 Kalibrace přístroje BacTrac 4100 Koliformní MO v syrovém mléce, médium 160 B, inokulum 10 %, 30 C b(0) = b(1) = r = 0.79 DT [h] Experimentální data Regresní přímka Konfidenční interval Log CFU

38 Kalibrace přístroje BacTrac 4100 CPMM v Lučině, médium 001 A, inokulum 10 %, 30 C b(0) = b(1) = r = 0.86 DT [h] Experimentální data Regresní přímka Konfidenční interval Log CFU

39 Vyhodnocení kalibrace přístroje Bactrac 4100 Kalibrační rovnice: Log CFU (BacT) = a(0) + a(1)*dt a(0) a(1) r Sxy Syrové mléko CPMM COLI Lučina CPMM

40 Ov Ověř ěřen ení kalibrace kalibrace Plotnová metoda CFU BacTrac DT-M5% DT-M5% COLI CPMM COLI CPMM COLI CPMM Vzorek [1/ml ] [1/ml ] [1/ml ] [1/ml ] [hod] [hod]

41 Aktivita jogurtové kultury

47 Vliv obsahu tuku média na průběh impedanční křivky Jogurtová kultura, médium - mléko o různé tučnosti, inokulum %, 42 C M [%] Tuk: 0.05 % 1.8 % 3.6 % 6.0 % 12.0 % 18.0 % 24.0 % 33.0 % Čas [h]

48 Vliv sušiny média na průběh impedanční křivky Jogurtová kultura, médium - mléko o různé sušině, inokulum %, 42 C 35 M [%] Sušina: 5 % 10 % 15 % 20 % 25 % Čas [h]

49 Porovnání prokysávání kozího a kravského mléka Jogurtová kultura, inokulum 0.01 %, 42 C M [%] Kozí mléko Kravské mléko Čas [h]

50 Porovnání průběhu kysací a impedanční křivky

51 Porovnání průběhu ph, SH a M-hodnoty Jogurtová kultura A - MZ, 0.1 % inokulum, 42 C ph 6 5 ph SH M-hodnota M-hodnota [%], SH Doba kultivace [h]

52 Comparison of ph and impedance measurement Yoghurt culture at 38 C, DVS Total solids %, fat 3.7 %, sugar 1 % ph ph Relative ph M-value Target ph RpH, M-value [%] Cultivation time [h]

53 Opakovatelnost měření impedance

54 25 Opakovatelnost měření změn impedance Jogurtová kultura 38 C, DVS Sušina %, tuk 2.5 %, cukr 5.5 %, 10 paralelních měření 20 M-hodnota [%] Doba kultivace [h]

55 Testování sterility

56 Test sterility UHT výrobku 12 M [%] bez předkultivace 3 dny 5 dní 5 dní (kont.) Čas [h]

57 Vliv nemléčných ných aditiv na růstr bakterií mléčného kvašen ení

58 18 Vliv nisinu na průběh impedanční křivky Lactococcus lactis subsp. lactis, kmen R5, BiMedia 001A, inokulum 1 % M [%] IU 25 IU 50 IU 100 IU 250 IU Čas [h]

59 Závislost detekčního času na koncentraci nisinu Lactococcus lactis subsp. lactis, kmen R5, BiMedia 001A, inokulum 1 % DT [h] Koncentrace nisinu [IU]

60 Vliv přídavku medu na průběh impedanční křivky Lactobacillus acidophilus A92, médium - mléko, inokulum 0.1 %, 37 C M [%] % medu 3 % N 3 % T 3 % S 10 % N 10 % T 10 % S Čas [h]

61 Další možnosti vyhodnocení inflexní bod impedanční křivky směrnice lineární části Vyhodnocení průběhu impedanční křivky Lactobacillus acidophillus A92, 1 % inokulum v obnoveném mléce, 37 C M [%] dm [%] Čas [h]

Podobné dokumenty

Laboratorní testování na přítomnost koliformních bakterií, psychrotrofních a termorezistentních mikroorganismů a sporotvorných anaerobních bakterií

Laboratorní testování na přítomnost koliformních bakterií, psychrotrofních a termorezistentních mikroorganismů a sporotvorných anaerobních bakterií Ing. Pavel Kopunecz, ČMSCH a.s. Přehled metod hodnocení