Pokročilé AFM mody Příprava nosičů a vzorků. Verze Jan Přibyl, pribyl@nanobio.cz

Transkript

1 Pokročilé AFM mody Příprava nosičů a vzorků Verze Jan Přibyl, pribyl@nanobio.cz

2 bsah prezentace 1 Pokročilé AFM módy Kontaktní mód - Konstatní výška - Konstantní síla - Chybový profil - Modulace síly - AFAM Semikontaktní mód - Fázový profil - Chybový profil Nekontaktní mód Techniky víceprůchodů - EFM - Kelvinova próba

3 bsah prezentace 2 Přípravy nosičů a imobilizace vzorků Atomárně rovné povrchy Slída HPG Další povrchy Sklo Zlato Plasty Imobilizované (bio)objekty Protein DNA Bakterie Buňky

4 Módy AFM mikroskopie

5 Kontaktní mód DC techniky

6 Kontaktní mód AC techniky

7 Semikontaktní mód

8 Nekontaktní mód

9 Víceprůchodové techniky

10 AFM spektroskopie

11 Přípravy nosičů Imobilizace vzorků

12 Atomárně rovné povrchy 1. HPG Highly rdered Pyrolytic Graphite Kishův grafit, původně odpadní produkt při výrobě oceli Hexagonální, planární struktura C-C vazba 142 pm, vzdálenost mezi rovinami 335 pm Vodivý, vysoce hydrofóbní Planární struktura čištění loupáním Syntetická forma grafitu, vysoká chemická čistota Tradiční podklad pro imobilizaci vzorků pro elektronovou mikroskopii, použitelný pro SEM, STM i AFM ( vodivost) Imobilizace spontánní adsorpcí na povrch ( hydrofobicita)

13 Atomárně rovné povrchy 1. HPG Highly rdered Pyrolytic Graphite Na větších plochách jsou viditelné šupiny Na malých plochách atomárně rovný

14 Atomárně rovné povrchy 2. Slída (muskovit, Mica) Kočičí stříbro, jméno Muskovit dle města Moskvy (těžba nejkvalitnější suroviny) Chem. struktura: K 2 Al Vysoce hydrofilní povrch Dobře chemicky modifikovatelný Imobilizace iontovou interakcí i kovalentní vazbou biomolekul pka ~ 3, při fyziologickém ph je povrch záporně nabitý Mica = křemičitan, z hlediska chemické modifikace lze povrch popsat jako hydratovaný oxid křemičitý -H

15 Atomárně rovné povrchy 2. Slída (muskovit, Mica) Velice rovná na větších i malých plochách

16 statní povrchy 1. Zlato Napařená vrstva zlata: tvořena nanočásticemi (4-50 nm) Inertní kov používaný zejména v elektrochemii jako pracovní elektroda Vodivost: použitelný pro STM i AFM Hydrofóbní: spontánní biomolekul (proteinů) adsorbce Chemická vazba pomocí koordinačně-kovalentní vazby thiolů (-SH) Příprava zlatých vrstev napařením Ve vodě nestabilní, potřeba aplikovat adhezivní vrstvu (Al/Cr/Ti)

17 statní povrchy 2. Sklo Nekrystalická (amorfní) hmota (podchlazená kapalina) Laboratorní sklo: 75% 2 plus Na 2, Ca, borát a aditiva v minoritním zastoupení Z hlediska chemické modifikace k němu přistupujeme jako ke slídě, tj. je to hydratovaný oxid křemičitý -H Méně hydrofilní než slída Drsnost povrchu (amorfnost materiálu, příprava lisováním) je mnohem vyšší než u slídy Nelze použít pro zobrazování malých molekul Typicky použití tam, kde i při optické mikroskopii, tj. pro velké (např. chromozóm) či celobuněčné útvary (bakterie, buňka, spermie)

18 sklo Makroskopické útvary na skle A. Thiooxidans zachycený na skle spermie zachycená na skle

19 statní povrchy 3. Plasty Fibroblast na PS Nemodifikovaný polystyren (PS) Plastové povrchy většinou jako součást standarních pomůcek (PS/PP misky) Neobsahují fční skupiny vhodné pro kovaletní imobilizaci Hydrofóbní povrchy: spontánní (nespecifická) adsorpce biomolekul

20 Imobilizační postupy 1. Proteiny Povrchy: slída nebo HPG (velmi nízká drsnost) Protein: náboj se řídí dle IEP a ph prostředí Imobilizace proteinu na slídu: pka (slída) < ph < IEP P P P - P IEP nulový náboj ph H H H H - - -

21

22 Imobilizace proteinu na HPG A. Imobilizace spontánní (nespec.) adsorpcí proteinu na hydrofóbní povrch (nejlépe při ph = IEP P P HPG P Adsorpce lysozymu na HPG

23 B. Imobilizace iontovou interakcí Vytvoření náboje na povrchu HPG HPG Vytvoření karboxylových skupin elektrochemicky (E ~ 2 V vs. Ag/AgCl) Adsorpce dlouhořetězcových (C 16 /C 18 ) alkanů zakončených vhodnou fční skupinou C - C - C - N H 2 N H 2 N H 2 N H 2 H 2 N HC HC HC HC HC HPG Možnost využití záporného náboje pro imobilizaci iontovou interakcí Nebo kovalentní vazba: aktivace karboxylu (např. NHSester, vazba NH 2 -skupiny) HPG HPG

24 Imobilizační postupy 2. DNA Povrchy: slída nebo HPG (velmi nízká drsnost) slída Problém: DNA (cukr-fosfátová kostra) i slída za fyziologického ph shodný (záporný) náboj Na povrch slídy je nutno zavést kladný náboj

25 H H H H H H N(Et) 3 cat. lanizace R = chemická modifikace povrchu slídy - Kovalentní modifikace povrchového H alkoxysiloxany - cíl: zavedení požadované fční skupiny na povrch slídy - lze použít i pro sklo, křemen, křemík, titan a Ti 2 - katalýza silnou bazí - průběh reakce lze dobře sledovat změnou kontaktního úhlu - CH 3 H CH 3 H 3 C CH 3 R-propyltrimethoxysilane R H H H H H lanizace Hydrofobizace

26 Nejčastěji používané alkoxysiloxany H 2 N HS N H 2 (3-Aminopropyl)trimethoxysilane APTES (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane MPTS 3-(Ethoxydimethylsilyl)propylamine APDMES

27 Problém praktického provádění: self-polymerizace R2 R2 R1 R2 R1 R1 R1 R2 R1 R1 H H -R 1 H R1 R1 R2 Zejména při použití APTES a provádění silanizace v kapalině Stačí i stopy vodních par pro spuštění Vzniklé útvary ruší topografickou studii povrchu H 2 N Řešení: provádění silanizace v parách (vakuum, sušidlo) Nové monoalkoxy-deriváty siloxanů, nemohou polymerovat: 3-(Ethoxydimethylsilyl)propylamine APDMES

28 Polymerní struktury vzniklé na povrchu slídy při provádění silanizace v APTES, katalýza TEA

29 Imobilizační postupy 2. DNA na povrchu HPG HPG Vytvoření kladného náboje na povrchu HPG: Adsorpce dlouhořetězcových (C 16 /C 18 ) alkanů zakončených vhodnou fční skupinou N H 2 N H 2 N H 2 N H 2 N H 2 HPG

30 Imobilizační postupy 3. Nanočástice Povrchy: nejčastěji slída nebo HPG (velmi nízká drsnost) ale také sklo, zlato, atp. Např. pro studium zlatých nanočástic (AuNP) lze použít slídu modifikovanou merkapto-derivátem siloxanu (SH-mica) HS HS H H H H H (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane MPTS

31 P P P Au P P P Au P P P P P P AuNP konjugované s proteinem se zachycují na podkladní přes můstek tvořený navázaným proteinem

32 Imobilizační postupy 4. Bakterie, spory Některé bakterie přes adhezivní vrstvu poly-l-lysinu: pll sklo Jiné standardním nátěrem na podložní sklo: sklo

33 Imobilizační postupy 5. Eukaryotické buňky Standardní pěstování buněčných kultur v PS miskách Vhodné je použití adhezivním vrstvy pll nebo adhezivních proteinů

34 Použití fixačních činidel Problém s adhezivitou buněk mimo inkubátor (37 o C, 5% C 2 ) Umožňuje studium buněk i dlouho po vyjmutí z inkubátoru Poškozuje skutečnou strukturu buněk, nelze studovat procesy na živých buňkách Příklady: EtH, k. octová, paraformaldehyd, glutardialdehyd