Magnetické částice pro detekci nádorových onemocnění, založené na protilátkách Vojtěch Adam

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Magnetické částice pro detekci nádorových onemocnění, založené na protilátkách Vojtěch Adam"

Alžběta Kopecká
před 9 lety
Počet zobrazení:

1 Název: Školitel: Magnetické částice pro detekci nádorových onemocnění, založené na protilátkách Vojtěch Adam Datum: Reg.č.projektu: CZ..07/2.4.00/ Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu

Metodika stanovení MT A. Navázání protilátek B. Přidání vzorku C. Izolace cílové molekuly D. Separace pomocí magnetu E. Promývání F. Ohřev G. Získání cílové molekuly H. Adsorpce na povrch elektrody I.

2 Metodika stanovení MT A. Navázání protilátek B. Přidání vzorku C. Izolace cílové molekuly D. Separace pomocí magnetu E. Promývání F. Ohřev G. Získání cílové molekuly H. Adsorpce na povrch elektrody I. Promytí J. Měření Referenční elektroda Pracovní elektroda Pomocná elektroda Potenciostat/ Galvanostat Polyklonální králičí protilátka, acetátový pufr, inkubace 5 minut při 70 C Elektrochemické stanovení (tzv. Brdičkova reakce-limit detekce 00 pm) Isolation of metallothionein from cells derived from aggressive form of high-grade prostate carcinoma using paramagnetic antibody-modified microbeads off-line coupled with electrochemical and electrophoretic analysis Masařík, M., Gumulec J., Sztalmachová, M., Hlavna, M., Babula, P., Křížková, S., Ryvolová, M., Jurajda, M., Sochor, J., Adam, V., Kizek, R., Electrophoresis 20, 32, 3 2

3 intezita signálu (%) intezita signálu (%) intenzita signálu (%) intenzita signálu (%) Metodika stanovení MT,2,4,2 0,8 0,6 0,4 0,8 0,6 0,4 0,2 0,2 0,2 3,5 4,3 7,4 0,5 ph Teplota ( C),05,00 0,95 0,90,2 0,8 0,6 0,4 0,85 0,2 0,80 myší Protilátka králičí Čas (min) 3

4 Brdičkova reakce Adsorptivní přenosová technika ve spojení s diferenční pulzní voltametrií Brdičkova reakce Vylučování vodíku ze základního elektrolytu (Brdičkova soluce mm Co(NH 3 ) 6 Cl 3 a M amonný pufr (NH 3 (aq) + NH 4 Cl, ph = 9.6) v přítomnosti proteinů obsahujících SH skupinu Sledujeme katalytický signál Cat2 Co(II) Metallothionein + [Co(NH 3 ) 6 ]Cl 3+ [Co(NH 3 ) 6 ]Cl 2+ + e - Co Potenciál Potential -0.8 V RS 2 Co 250 na Cat Metallothionein R(SH) 2 [Co(H 2 O) 6 ] 2+ RS2Co + 2H + + 2H + Co + R(S - ) 2 + 2H + + 2e - + 2e - + 2e - RS 2 Co Cat Cat V -.35 V -.5 V Cat2 Co Potenciál (V) Převzato z J. Petrlova, et al. Attomole voltammetric determination of metallothionein, Electrochim. Acta 5 (2006) V. Adam et al. Metallothionein Electrochemical Fingerprints JACS (20), in preparation

5 Relativní násobek Hodnota MT (µg/ng proteinu) Stanovení MT Exprese MTA/MT2A Stanovení proteinu 0 0, 22Rv PC-3 PNTA MTA p < 0.00 MT2A p < MTA MT2A 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 0,00 p < 0.05 p < ,0 0,00 PC-3 22Rv PNTA Determination of metalothioneins and alpha-methylacyl-coa recemase in tumor prostate diseases Masařík, M., Gumulec, J., Sztalmachová, M., Hlavna, M., Kuchtíčková, Š., Rovný, A., Hrabec, R., Eckschlager, T., Křížková, S., Adam V., Kizek, R., 7.Symposium a workshop molekulární patologie a histo-cyto-chemie. 20.ISBN

6 Metodika stanovení Caveolinu- ELISA (imunologická metoda založena na specifické reakci antigenu s protilátkou) Byl použit set pro stanovení caveolin- od firmy USCN Life Science Inc. Monoklonální protilátka proti caveolinu- Testovaný vzorek (antigen), na který se naváže polyklonální protilátka konjugovaná s biotinem Avidin konjugovaný s peroxidázou TMB substrát (3,3,5,5 -tetramethylbenzidine) dochází k barevné změně Stop reagencie (H 2 SO 4 ) Fotometrická detekce při 450 nm 6

7 Relativní násobek Intenzita signálu Stanovení Caveolinu- 0 Exprese Caveolinu- Cav p < ,00 Stanovení proteinu p < 0.05 p < Rv PC-3 PNTA,00 PC-3 PNTA 22Rv 0, 0,0 0,0 0,0 Apoptický proliferační expresní profil u nádorových prostatických buněk Gumulec, J., Hlavna, M., Sztalmachová, M., Pávková Goldbergová, M., Křížková, S., Adam, V., Kizek, R., Masaříková, M., Masařík, M., XXXV. Brněnské onkologické dny. 20, ISBN

8 Metodika stanovení PSA Pro analýzu PSA byla použita ELISA metoda. Stanovení se provádělo pomoci automatického analyzátoru AIA 600 II Myší monoklonální protilátka proti PSA testovaný vzorek (antigen) Sekundární monoklonální protilátka konjugovaná s hovězí alkalickou fosfatázou Přidán fluorogenní substrát (4- methylumbelliferyl fosfát) Pomocí fluorescenční intenzity změřena aktivita enzymu 8

9 Relativní násobek Hodnota PSA (ng/ml) Stanovení PSA 682 krát zvýšeno oproti PNTA 0 Exprese PSA Stanovení proteinu p < 0.00 PSA p < p = 0. 22Rv PC-3 PNTA 0 22RV PC-3 PNTA 9

10 Výsledky PNTA PC-3 22RV Caveolin- kontrola,6x snížená 50x snížená MT kontrola,2x zvýšená,2x snížená Na úrovni proteinu PSA kontrola nezměněná 682x zvýšená Caveolin- kontrola 2,9x zvýšená 7,5x snížená MTA kontrola 4,3x snížená 8,3x snížená MT2A kontrola 2,5x zvýšená,7x snížená Na úrovni RNA PSA kontrola 2,7x zvýšená 2x zvýšená Výsledky byly vyhodnoceny v softwaru Statistica 9 K porovnání hladiny mezi kontrolní a nádorovými liniemi bylo použito t-testů 0

11 Děkuji Vám za pozornost Reg.č.projektu: CZ..07/2.4.00/ Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu

Podobné dokumenty

Monitorování hladiny metalothioneinu a thiolových sloučenin u biologických organismů vystavených působení kovových prvků a sloučenin

Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Monitorování hladiny metalothioneinu a thiolových sloučenin u biologických organismů vystavených působení kovových prvků a sloučenin Ing. Kateřina Tmejová, Ph. D.,