METODY PŘÍPRAVY POVRCHU NOSIČŮ PŘI STUDIU BIO-

Transkript

1 METDY PŘÍPRAVY PVRCHU NSIČŮ PŘI STUDIU BI- LGICKÝCH MATERIÁLŮ S VYUŽITÍM METDY AFM Nanobiotechnologie a biosensory při studiu biointerakcí zpřístupnění moderní technologie odborníkům v biologii CZ.1.07/2.3.00/

2 bsah 1 TERETICKÁ ČÁST Povrchy Aktivace povrchů Imobilizace biomolekul Imobilizace dna Imobilizace bílkovin Imobilizace buněk a bakterií Elektrostatická interakce a kovalentní vazba PRAKTICKÁ ČÁST Imobilizace dna na slídu silanizací povrchu pomocí apdmes a tea lanizace Imobilizace dna na slídu Imobilizace dna na slídu pomocí dvojmocných iontů ni 2+ /co Imobilizace igg na slídu Imobilizace bakterií na sklo Imobilizace bakterií na sklo prokřížením pomocí glutaraldehydu Imobilizace bakterií na sklo pomocí protilátky Imobilizace bakterií na zlato

3 1 Teoretická část 1.1 Povrchy Největším problémem při zobrazování biologických materiálů je příprava vzorků, protože každý vzorek vyžaduje jedinečný přístup. Při měření technikou AFM neexistují žádné větší požadavky na druh nebo kvalitu podkladního materiálu (substrát, nosič) a jeho povrchu. Jedinou výjimku tvoří požadavek hladkosti podkladu, který musí být vhodný ke studiu dané biomolekuly. Nejpoužívanějšími materiály jsou slída, křemík, sklo a zlato. Substrát se volí s ohledem na druh vzorku. Slída, nerost patřící mezi hlinitokřemičitany, je jedním z nejvíce využívaných materiálů za tímto účelem. Výhodou je hlavně její nízká cena a při přípravě vzorků snadná štípatelnost jednotlivých vrstev. Slídu lze snadno štípat či loupat pomocí nože nebo dokonce obyčejné lepicí pásky. Výsledkem je čistý, rovný a atomárně hladký povrch. Využívá se k zobrazování buněk, DNA i proteinů. Nevýhodou tohoto substrátu může být jeho záporný náboj, který způsobuje, že se na vzduchu pokrývá tenkou vrstvou vody, čímž může komplikovat měření. Sklo je vhodné k zobrazování větších molekul jakožto chromozomů, buněčných organel nebo buněk. Není vhodný k zobrazování menších objektů (DNA, bílkovina). Nevýhodou je snadná kontaminace tohoto povrchu a relativně vysoká drsnost (nejedná se o krystalický materiál). Zlato je inertní a chemicky velmi odolný materiál. Je vhodný k zobrazování biologických makromolekul vázaných kovalentní vazbou. Problémem však může být pořizovací cena tohoto materiálu. Dalším zajímavým materiálem je tzv. HPG (z angl. Highly rdered Pyrolitic Graphite). Jedná se o poměrně nový druh vysoce čistého uhlíku, jenž má vrstevnatou strukturu. Úhel mezi jednotlivými vrstvami je menší než 1. Vyznačuje se extrémní hladkostí dosahující méně než 0,06 nm. Na rozdíl o slídy je kompletně nepolární a silně hydrofobní. Výhodu HPG jsou výsledky s nevýrazným pozadím. Vykazuje vysokou chemickou netečnost a vysokou tepelnou vodivost. HPG se využívá k zobrazování makromolekul, kdy je vzorek vázán pomocí elektrostatických nebo adsorpčních sil. Stejně jako slída se povrch substrátu čistí lepicí páskou, kdy se odštípnou svrchní vrstvy. 3

4 1.1.1 Aktivace povrchů Aktivace povrchu je důležitou součástí přípravy vzorku, kdy je různými metodami dosaženo stabilnější vazby zobrazovaného objektu. Většinou se jedná o zavedení vhodných reaktivních skupin na povrch podkladního materiálu. Ten musí být před samotnou aktivací očištěný a zbavený všech organických nečistot. lanizace Jedním ze způsobů chemické aktivace povrchu substrátu je silanizace (obr. 1). Tato metoda je vhodná pro povrchy jako sklo, slída, křemík, jelikož všechny zmíněné substráty na svém povrchu obsahují hydroxylovou skupinu. R CH 3 H 3 C CH 3 R trimethoxysilane + H H H H - CH 3 H H lanizovaný povrch br. 1 lanizace lanizace se provádí pomocí alkoxysilanů (obr. 2) a to mono-, di- nebo trialkoxysilanů, které mají hlavní řetězec zakončen vhodnou reaktivní funkční skupinou (např. - NH 2, -CH, -SH). H 2 N 3-(Ethoxydimethylsilyl)propylamine APDMES H 2 N HS (3-Aminopropyl)triethoxysilane APTES br. 2 Struktury nejpoužívanějších silanů (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane MPTS 4

5 Jedním z nejvíce využívaných silanů je 3-aminopropyltriethoxysilan (APTES). Při aktivaci dochází k vytvoření vazby ---- mezi podkladním materiálem a molekulou APTES. Na povrchu je tak vytvořena vrstva zakončená reaktivní aminoskupinou určená k vazbě zobrazované molekuly pomocí kovalentní nebo iontové vazby. Dalším používaným silanem je glycidoxypropyltriethoxysilan (GPS). V tomto případě je reaktivní skupinou, která je zavedena na povrch, oxiranový zbytek. Problémem vzniklým při použití APTES či GPS může být tzv. selfpolymerace, kdy v přítomnosti vody vznikají boční vazby mezi alkoxy- skupinami silanizačního činidla navzájem (br. 3). Riziko lze omezit použitím např. aminopropyldimethylethoxysilanu (APDMES), který má pouze jednu alkoxy-skupinu; na povrchu tak vzniká pouze monovrstva. + H H -R 1 H br. 3 Self-polymerace triethoxy silanů Zajímavou molekulou pro silanizaci je méně reaktivní 1-(3-aminopropyl)silatran (APS). Nepodléhá hydrolýze a polymeraci v neutrálním ph. Příprava APS slídy se provádí za pokojové teploty. Takto připravený substrát je aktivní po dobu jednoho týdne. Nanášení silanizačních činidel probíhá na očištěný povrch substrátu. Lze provádět přímo či odpařováním z organické či vodné fáze. Aktivace povrchu zlata Při aktivaci zlata (obr. 4) se využívá specifické adsorpce thiosloučenin na povrch. Při inkubaci zlatého povrchu s roztokem thiosloučeniny spontánně vzniká velice kompaktní, stabilní a homogenní monovrstva (self-assembled monolayer, SAM). Pokud je adsorbovaná molekula na druhém konci vybavena reaktivní funkční skupinou, je získán povrch vhodný k imobilizaci biomolekul. 5

6 br. 4 Adsorpce thiolů a disulfidů na povrch zlata 1.2 Imobilizace biomolekul Pokud je povrch substrátu dostatečně rovný a pečlivě očištěný od nečistot, může být použit k imobilizaci biomolekul i bez předchozí aktivace. Navázání může probíhat pomocí adsorpce, kdy se uplatňují iontové síly, vodíkové můstky a další nekovalentní interakce. Tento proces je však velice závislý na okolních podmínkách (ph, teplota, iontová síla roztoku atd.). Metoda je často používána díky své jednoduchosti, nicméně výsledná vrstva nevykazuje optimální vlastnosti. Imobilizace za vzniku kovalentní vazby, která zajišťuje dlouhodobější a stabilnější navázání biomolekuly na povrch, je proto většinou vhodnější Imobilizace DNA Materiálů vhodných pro imobilizaci DNA je několik. Nejčastěji je možné se setkat s využitím slídy, AP-slídy (APTES/APDMES modifikovaná slída) nebo HPG. Předpokladem pro úspěšné měření je atomární hladkost, avšak na rozdíl od SPM nemusí být podkladní materiál vodivý. Imobilizace na slídu Charakteristickou vlastností DNA je její záporný náboj při ph 7. Imobilizace na čerstvě naštípanou slídu či sklo může být problematická, neboť oba povrchy díky povrchovým hydroxylovým skupinám nesou také parciální záporný náboj. Komplikace 6

7 s odpuzováním souhlasně nabitých partnerů (povrch biomolekula) lze řešit dvěma možnostmi. a) Využití bivalentních iontů Jelikož shodné náboje komplikují uchycení DNA na substrát, k usnadnění se používají kationty kovů, které jsou přítomny v pufru. Typické je využití Mg 2+, Co 2+, Ni 2+ či Cu 2+. Principem této reakce je výměna iontů, kdy jsou draselné kationty z kostry molekuly DNA a povrchu slídy nahrazeny kationty kovu přítomných v roztoku pufru. Jedná se tedy o výměnu dvojmocného kationtu kovu za jednomocný kationt draselný. Vzniká tak přemostění mezi negativně nabitým povrchem slídy a negativně nabitými fosfátovými skupinami kyseliny deoxyribonukleové. ptimální pro stabilní imobilizaci DNA na těchto površích jsou kobaltnaté a nikelnaté kationty (Mg 2+ poskytuje pouze slabé navázání DNA na povrch). b) Imobilizace pomocí silanů V tomto případě se využívá předem aktivovaný povrch, jenž je za pomoci silanů vybaven aminoskupinami. Povrch substrátu tak má v roztocích o neutrálním ph kladný náboj, který reaguje se záporně nabitou makromolekulou DNA. Jiným způsobem přichycení vzorku na substrát je reakce s navázanou aminoskupinou za použití bifunkčních činidel (obr. 5) za vzniku kovalentní vazby. Jedna reaktivní skupina činidla reaguje právě s aminoskupinou na povrchu a druhá reaktivní skupina je pak volná k interakci s vhodnou skupinou imobilizované biomolekuly. Jedním z vhodných činidel je glutaraldehyd (GA). Výhodou je jeho reaktivita a běžná dostupnost. Prvním krokem je vytvoření Shiffovy báze mezi N atomem aminoskupiny na povrchu a C atomem aldehydové skupiny GA. Stejnou reakcí na opačném konci molekuly GA je přes aminoskupinu připojena biomolekula. Někdy se také provádí redukce Shiffových bazí borohydridem, přičemž vzniklá vazba je stabilnější. 7

8 br. 5 Reakce imobilizace biomolekuly či DNA pomocí silanů a glutaraldehydu za vzniku kovalentní vazby Imobilizace na HPG Na povrch HPG lze DNA imobilizovat pomocí volné adsorpce. Adsorpce je rychlý proces, kdy se molekuly samy sestavují z roztoku do rozsáhlých dvojrozměrných sítí rovnoměrně po celém povrchu substrátu. HPG je vodič, výsledek imobilizace lze tudíž podpořit aplikací elektrického napětí. Negativně nabité fosfátové kostry DNA jsou elektrostaticky přitahovány ke kladně polarizovanému materiálu HPG. Výsledná vrstva DNA vykazuje vyšší pevnost a odolnost proti mechanickému namáhání Imobilizace bílkovin Bílkoviny jsou biopolymery, jejichž kostru tvoří polypeptidový řetězec, obsahující obvykle aminokyselinových zbytků. Protonací volných aminoskupin může molekula bílkoviny získat kladný náboj, naopak deprotonací karboxylů může získat náboj záporný. Tento jev je silně odvislý od ph prostředí. Hodnota ph, při které 8

9 je celkový náboj molekuly roven nule (množství protonovaných, tzn. kladně nabitých aminoskupin odpovídá deprotonovaným karboxylům), se nazývá izoelektrický bod. Elektrické náboje molekul bílkovin hrají důležitou úlohu při stabilizaci konformace, při solvataci bílkovin, ovlivňují interakce v systému bílkovina okolí apod. Při studiu bílkovin pomocí AFM se jako podkladní povrch používá hlavně slída, HPG, méně i sklo. Elektrostatické interakce Adsorpční afinita, maximální množství adsorbované bílkoviny a prostorové uspořádání imobilizovaných molekul drasticky závisí na ph a iontové síle. Elektrostatické interakce jsou řídící silou adsorpce proteinů na hydrofilní substráty. Při ph, které odpovídá isoelektrickému bodu bílkoviny, má makromolekula v polárním prostředí vodných roztoků nejkompaktnější konformaci a minimální vnitřní/vnější náboj. Bílkovina při takovémto ph obvykle dosahuje vysoké strukturní stability. blast, na kterou je molekula navázaná, je pak menší, než by byla při značně odlišném ph od isoelektrického bodu. Vhodné je, aby ph tlumícího roztoku bylo v rozmezí daném hodnotami pk a slídy a pk a bílkoviny. Kovalentní vazba Dalším způsobem imobilizace je využití vzniku kovalentní vazby mezi bílkovinou a substrátem vybaveným reaktivními funkčními skupinami. Typickou reakcí, podobně jako u DNA, je reakce glutaraldehydu s aminoskupinou bílkoviny. Vedle aminoskupiny je k imobilizaci využívána také karboxy skupina. Aktivuje se pomocí karbodiimidů (CDI). Mezi nejpoužívanější patří dicyklohexylkarbodiimid či 1-ethyl-3-(3- dimethylamino-propyl)-karbodiimid (br. 6). Mírnější průběh nám zajišťuje reakce karbodiimidu a N-hydroxysukcinimidu. Připraví se tak méně reaktivní avšak stabilnější N-hydroxysukcinimidový derivát karboxylu, který pak reaguje s aminoskupinou. Vzhledem k tomu, že v povrchových strukturách bílkovin jsou přítomny jak amino tak i karboxy skupiny, lze také povrch aktivovat různými modifikačními činidly. 9

10 R 1 H + H 3 C N C N N + H 3 C CH 3 H EDC R 1 amid NH R 2 R 2 NH 2 H 3 C N C N N + CH H 3 C N C 3 N N + H H H H 3 C br. 6 Aktivace karboxylu pomocí EDC a následná vazba s aminoskupinou Imobilizace buněk a bakterií Buňky i bakterie jsou oproti DNA či bílkovinám rozměrově větším zobrazovaným materiálem (eukaryotické buňky ~ μm). Proto nejsou kladeny tak vysoké požadavky na hladkost povrchu jako je tomu u studia biomolekul. Typickým podkladovým materiálem je sklo. Pomocí AFM lze studovat jak fyziologické procesy buněk tak i jejich složení a povrchové struktury. Je však nezbytné vhodně volit metodu uchycení buňky, aby nedošlo například k narušení fyziologických procesů chemickými interakcemi nebo naopak uvolnění vzorku při skenování v důsledku slabé interakce se substrátem. Metoda sloužící k zachycení životaschopných buněk je především adsorpce na různé materiály. Jindy výhodná a široce použitelná stabilní imobilizace s využitím kovalentní vazby zde není vždy vhodným řešením, protož tento způsob může narušit životaschopnost buněk. Při studiu buněk se často využívá mechanického přichycení v porézních materiálech čili jednoduché fyzikální adsorpce. Díky litografickým metodám je také možné připravit kladně nabité povrchy se soustavou děr, které slouží k uchycení vzorku a zároveň dovolí buňkám pokračovat v jejich životních procesech. H R 1 H 3 C CH 3 H 10

11 1.2.4 Elektrostatická interakce a kovalentní vazba Pokud je povrch substrátu vhodně upraven před samotnou imobilizací, je možné využít zachycení pomocí elektrostatické interakce. Vzniká tak vazba mezi záporně nabitým povrchem buňky a kladně nabitou látkou pokrývající povrch podkladového materiálu. K modifikaci povrchů se používají sloučeniny zakončené NH 2 skupinou směřující do roztoku (APTES pro slídu, dále polyehtylenimin, poly-l-lyzin, želatina). Pro uchycení buněk kovalentní vazbou lze využít spojení předem navázané aminové nebo karboxylové skupiny pomocí činidla. Stejně jako v ostatních případech se běžně provádí spojení dvou aminových skupin pomocí glutaraldehydu (povrch- NH 2 + GA + NH 2 -buňka) či vazby mezi aminovou skupinou jednoho a karboxylovou skupinou druhého partnera za pomoci EDC/NHS chemie. Imobilizace pomocí povrchově vázaných protilátek K imobilizaci buněk lze také využít afinitní specifické interakce mezi povrchovými strukturami buňky a protilátkou imobilizovanou na podkladním materiálu. Imobilizace protilátky se provádí již zmíněnými metodami např. vybavení povrchu NH 2 skupinami, prokřížení s aminoskupinami protilátky glutaraldehydem nebo s využitím variant EDC/NHS chemie atd. Veškeré v textu uvedené možnosti imobilizace biomolekul či aktivace povrchů lze s ohledem na účastnící se funkční skupiny (-NH 2, -CH, -SH, -H atd.) různě kombinovat, přizpůsobovat a měnit. 11

12 2 Praktická část 2.1 IMBILIZACE DNA NA SLÍDU SILANIZACÍ PVRCHU PMCÍ APDMES A TEA lanizace - čerstvě očištěná slída, pomocí oboustranné lepící pásky a stlačeného vzduchu, se vloží na otevřené Petriho misce nad sušidlo do exsikátoru - do exsikátoru se přidají 2 malé Eppendorf zkumavky s 30 µl APDMES v jedné a 30 µl TEA v druhé zkumavce, stejně jako u Petriho misky se nechají otevřené - exsikátor se nechá 10 minut evakuovat, poté se přívod vakua uzavře a po 90 minutách se v digestoři pomalu vypustí Imobilizace DNA na slídu - na čerstvě silanizovanou slídu se nanese 20 µl DNA o koncentraci 0,5 µg/ml (ředěno v 40 mm HEPES, 10 mm MgCl 2 pufru), roztok DNA nesmí přesahovat přes okraj slídy - v Petriho misce se inkubuje 30 minut při 4 C - slída se poté opláchne destilovanou vodou a osuší stlačeným vzduchem 2.2 IMBILIZACE DNA NA SLÍDU PMCÍ DVJMCNÝCH INTŮ Ni 2+ /Co 2+ - na čerstvě očištěnou slídu se nanesou 2 µl roztoku DNA o koncentraci 1 µg/ml (ředěno v 1 mm NiCl 2 nebo CoCl 2 ) - v Petriho misce se inkubuje 10 minut při 4 C - slída se poté opláchne destilovanou vodou a osuší stlačeným vzduchem 2.3 IMBILIZACE IgG NA SLÍDU - na čerstvě očištěnou slídu se nanesou 3 µl roztoku IgG o koncentraci 5 µg/ml v PB (ph 6,9) -v Petriho misce se inkubuje 5 minut při 4 C - slída se poté opláchne destilovanou vodou a osuší stlačeným vzduchem 12

13 2.4 IMBILIZACE BAKTERIÍ NA SKL Imobilizace bakterií na sklo prokřížením pomocí glutaraldehydu - sklíčko se očistí roztokem Piranha (3:1 H 2 S 4 : H 2 2 ) - vodou opláchnuté a acetonem odmaštěné sklíčko se ponoří do 5% APTES v acetonu na 2 h při 25 C ve tmě - sklíčko se opláchne acetonem a následuje zapečení vrstvy při 110 C po dobu 1h - sklíčko se opláchne acetonem a na vychladlý aktivovaný povrch se nanese suspenze spor Bacillus Atrophaeus ( CFU/ml) s 3 % glutaraldehydem - inkubace 1 h při 25 C - sklíčko se opláchne destilovanou vodou a osuší Imobilizace bakterií na sklo pomocí protilátky - sklíčko se očistí a silanizuje jako v sekci sklíčko se opláchne acetonem a na povrch se nanese 3 % roztok glutaraldehydu 1h 25 C - sklíčko se opláchne vodou a inkubuje se s roztokem protilátky (20 μg/ml v PBS) přes noc při 4 C - sklíčko se opláchne vodou a inkubuje se suspenzí spor Bacillus Atrophaeus ( CFU/ml) po dobu 1h při pokojové teplotě - sklíčko se poté opláchne destilovanou vodou a osuší 2.5 IMBILIZACE BAKTERIÍ NA ZLAT - křemíkový čip s napařenou vrstvičkou zlata se odmastí v acetonu (30 min) - po dobu 2h se inkubuje s cysteaminem (20 mg/ml) - opláchne vodou a osuší - aktivovaný povrch se inkubuje s 3% roztokem glutardialdehydu po dobu 1h při lab. teplotě - po oplachu vodou a osušení se přes noc aplikuje protilátka (anti spores B. atrophaeus) v koncentraci 20 g/ml (4 C) - čip se opláchne vodou a osuší 13