COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Qualitative Test, version 2.0

Transkript

1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Qualitative Test, version 2.0 PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV HCVQLV2 72 Tests P/N: Qualitative Test, v2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: Wash Reagent Obsah ÚČEL POUŽITÍ... 1 SOUHRN A VÝKLAD TESTU... 2 PRINCIPY POSTUPU... 2 ČINIDLA... 4 VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ... 6 POŽADAVKY NA SKLADOVÁNÍ A MANIPULACI... 8 DODÁVANÝ MATERIÁL... 8 POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY... 9 ODBĚR, PŘEPRAVA A SKLADOVÁNÍ VZORKŮ NÁVOD K POUŽITÍ KONTROLA KVALITY VÝSLEDKY PROCEDURÁLNÍ OMEZENÍ INTERFERUJÍCÍ LÁTKY HODNOCENÍ NEKLINICKÝCH FUNKČNÍCH PARAMETRŮ LITERATURA ÚČEL POUŽITÍ Kvalitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 je in vitro amplifikační test nukleové kyseliny pro detekci RNA viru hepatitidy typu C (HCV) genotypu 1 až 6 v lidské EDTA plazmě nebo séru za použití zařízení COBAS AmpliPrep pro automatizované zpracování vzorku a analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48 pro automatizovanou amplifikaci a detekci. Kvalitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 je indikován pro pacienty s klinickými resp. biochemickými projevy jaterní choroby a průkazem protilátek proti infekci HCV a těch, u kterých je podezření na aktivní infekci HCV. Test lze použít pro potvrzení přítomnosti protilátek ve vzorcích. Detekce HCV RNA znamená, že se virus replikuje, což je důkazem aktivní infekce. Kvalitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 není určen k plošnému vyšetřování krve či krevních derivátů na přítomnost HCV. Oddíl s informacemi o revizi dokumentu se nachází na konci tohoto dokumentu CS 1 Doc Rev. 2.1

2 SOUHRN A VÝKLAD TESTU Virus hepatitidy C je považován z % za hlavního původce potransfúzní hepatitidy 1-4. HCV je virus s jednořetězcovou pozitivně orientovanou RNA s genomem obsahujícím zhruba nukleotidů kódujících aminokyselin. HCV se vyskytuje v krvi, a proto se může krví a krevními deriváty přenášet. Rozsáhlým plošným vyšetřováním krve na přítomnost viru HCV se nebezpečí onemocnění hepatitidou spojené s krevní transfuzí výrazně snížilo. Incidence infekce virem HCV je nejvyšší v souvislosti s nitrožilním zneužíváním drog a v menší míře i s ostatními perkutánními aplikacemi 4. Globální prevalence infekce virem HCV, stanovená imunosérologickými testy, se pohybuje v rozmezí od 0,6 % v Kanadě až po 1,5 % v Japonsku 3. Hodnoty spontánní clearance viru u exponovaných jedinců se značně liší; byly nahlášeny hodnoty mezi 10 a 60 % dle klinického testování po normalizaci jaterních enzymů a clearance HCV RNA v plazmě 5. Virové částice HCV nelze kultivovat z infikovaných vzorků krve, takže přítomnost anti-hcv protilátek v organismu pacientů infikovaných virem HCV vedla k vývoji imunosérologických testů, které jsou pro tyto protilátky specifické. Přítomnost protilátek anti-hcv je sice ukazatelem předchozí expozice infekci virem HCV, nelze ji však považovat za marker současné infekce. Hladina alaninaminotransferázy (ALT) se sice považuje za hrubý indikátor infekce virem HCV, není však přímou mírou virémie. Alternativně může doklady o stávající infekci poskytnout detekce HCV RNA pomocí testů na nukleovou kyselinu. Testem využívajícím nukleové kyseliny je možné detekovat HCV viremii dříve, než dojde k imunologické sérokonverzi 6,7. Protože testem postaveným na nukleových kyselinách lze prokázat přítomnost HCV RNA přímo, t.j. bez ohledu na stávající imunologický status pacienta, je tento test cenný při zjišťování HCV RNA u pacientů s oslabeným imunitním systémem 8. PRINCIPY POSTUPU Kvalitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 je amplifikační test nukleové kyseliny pro detekci RNA viru hepatitidy C (HCV) v lidské EDTA plazmě nebo séru. Příprava vzorku je automatizována pomocí zařízení COBAS AmpliPrep s amplifikací a detekcí automatizovanou pomocí analyzátoru COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48. Kvalitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 je založen na třech základních procesech: (1) izolace HCV RNA pomocí přípravy vzorku, (2) reverzní transkripce cílové RNA k vytvoření komplementární DNA (cdna) a (3) simultánní PCR amplifikace cílové cdna a detekce rozštěpené, dvojitě značené oligonukleotidové detekční sondy specifické pro cíl. Příprava vzorku Kvalitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 využívá automatizovanou přípravu vzorku na zařízení COBAS AmpliPrep pomocí generické vychytávací technologie založené na křemičitém sklu. Vstupní objem vzorku je 650 µl a pracovní postup zpracovává 500 µl EDTA plazmy nebo séra. HCV virové částice jsou rozloženy inkubací při zvýšené teplotě s proteázou a chaotropním lytickým/vazebným pufrem, který uvolňuje nukleové kyseliny a chrání uvolněnou HCV RNA před působením RNáz v séru nebo EDTA plazmě. Proteáza a známý počet molekul HCV RNA vnitřní kontroly (IC) jsou přidány do každého vzorku spolu s lytickým činidlem a magnetickými skleněnými částicemi. Následně je směs inkubována a HCV RNA a HCV IC RNA jsou navázány na povrch magnetických skleněných částic. Nenavázané substance, jako soli, bílkoviny a ostatní buněčné nečistoty, jsou odstraněny propláchnutím magnetických skleněných částic. Po separaci kuliček a dokončení oplachování jsou absorbované nukleové kyseliny eluovány při zvýšené teplotě pomocí vodného roztoku. Zpracovaný vzorek obsahující uvolněnou HCV RNA a HCV IC RNA je přidán do amplifikační směsi a přemístěn do analyzátoru COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan CS 2 Doc Rev. 2.1

3 Reverzní transkripce a PCR amplifikace Kvalitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 používá reverzní transkripci HCV RNA na komplementární DNA (cdna) a PCR amplifikaci cdna pomocí primerů, které definují sekvenci ve vysoce konzervované oblasti 5'-nepřeložené oblasti genomu HCV 9. Nukleotidová sekvence primerů je optimalizována tak, aby poskytovala srovnatelnou amplifikaci genotypů HCV 1-6. Reverzní transkripce a PCR amplifikace se provádí pomocí optimalizované směsi termostabilních rekombinantních enzymů: polymerázy DNA Z05 a Z05D. Za přítomnosti manganu (Mn 2+ ) a při vhodných pufrovacích podmínkách vykazuje Z05 a Z05D aktivitu jak reverzní transkriptázy, tak polymerázy DNA. To umožňuje reverzní transkripci a PCR amplifikaci spolu s detekcí amplikonu v reálném čase. Zpracované vzorky se přidávají do amplifikační směsi v amplifikačních zkumavkách (K-zkumavkách), kde probíhá jak reverzní transkripce, tak PCR amplifikace. Reakční směs se zahřívá, aby se downstream primer napojil specificky na cílovou HCV RNA a na HCV IC RNA. Za přítomnosti Mn 2+ a nadbytku deoxynukleotid-trifosfátů (dntp), mezi něž patří deoxyadenozin-, deoxyguanozin-, deoxycytidina deoxyuridin-trifosfáty, polymerizují polymerázy Z05 a Z05D hybridizované primery za vzniku vlákna DNA komplementárního k cílové RNA. Amplifikace cíle Po reverzní transkripci cílové HCV RNA a HCV IC RNA zahřeje termocykler v analyzátoru COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 reakční směs tak, aby došlo k denaturaci hybridů RNA:cDNA a expozici specifických primerových cílových sekvencí. Při chladnutí směsi se primery připojí k cílové cdna. Termostabilní polymeráza DNA (Z05 a Z05D) za přítomnosti Mn 2+ a nadbytku deoxynukleotid trifosfátů (dntp) prodlužuje napojené primery podél cílových templátů a vytváří molekulu dvouřetězcové DNA, která se nazývá amplikon. Analyzátor COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 opakuje automaticky tento proces po určený počet cyklů, kdy při každém cyklu dojde ke zdvojení množství amplikonové DNA. Požadovaný počet cyklů je předem naprogramován v analyzátoru COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48. Amplifikace probíhá pouze v oblasti genomu HCV mezi primery, celý genom HCV amplifikován není. Selektivní amplifikace Selektivní amplifikace cílové nukleové kyseliny z klinického vzorku se dosahuje ve kvalitativním testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 použitím enzymu AmpErase (uracil-n-glykosylázy) a deoxyuridin-trifosfátu (dutp). Enzym AmpErase rozpoznává a katalyzuje destrukci vláken DNA obsahujících deoxyuridin 10, ale přitom vynechává DNA obsahující deoxythymidin. Deoxyuridin se v přirozené DNA nevyskytuje, je však vždy přítomen v amplikonu, díky použití deoxyuridin-trifosfátu jako jednoho z dntp v činidle Master Mix, takže deoxyuridin obsahuje pouze amplikon. V důsledku přítomnosti deoxyuridinu je kontaminovaný amplikon citlivý vůči destrukci enzymem AmpErase před amplifikací cílové DNA. Nespecifický produkt vytvořený po iniciální aktivaci Master Mix manganem je rovněž zničen enzymem AmpErase. Enzym AmpErase, který je obsažen v činidle Master Mix, katalyzuje rozštěpení DNA obsahující deoxyuridin v místě deoxyuridinového zbytku rozevřením deoxyribozového řetězce v pozici C1. Když je řetězec amplikonové DNA v prvním tepelně cyklizačním kroku zahříván, štěpí se v poloze deoxyuridinu, čímž se DNA stává neamplifikovatelnou. Enzym AmpErase zůstává neaktivní po delší dobu, jakmile je vystaven teplotám nad 55 C, tzn. v průběhu tepelně cyklizačního kroku, a proto nerozkládá cílový amplikon vzniklý během PCR reakce. Detekce rozštěpených, dvojitě značených sond a HCV RNA Kvalitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 využívá v reálném čase běžící 16,17 PCR technologii. Použití dvojitě značených fluorescenčních sond umožňuje detekci akumulace PCR produktů v reálném čase monitorováním intenzity emise fluorescenčního barviva uvolněného během amplifikačního procesu. Sondy se skládají z HCV a HCV IC-specifických oligonukleotidových sond s oznamovacím a tlumícím barvivem. Ve kvalitativním testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0, jsou HCV a HCV IC sondy značeny různými fluorescenčními oznamovacími barvivy. Jsou-li tyto sondy intaktní, je fluorescence oznamovacího barviva potlačena blízkostí tlumícího barviva kvůli vlivu Försterova přenosu energie. Při PCR hybridizuje sonda s cílovou sekvencí a je rozštěpena 5' 3' nukleázovou aktivitou termostabilních polymeráz Z05 a Z05D DNA. Jakmile je oznamovací a tlumící barvivo uvolněno a odděleno, nedochází nadále k útlumu a fluorescenční aktivita oznamovacího barviva se zvýší. Amplifikace HCV RNA a HCV IC RNA je měřena nezávisle při různých vlnových délkách. Tento proces je opakován po předem určený počet cyklů, přičemž každý cyklus efektivně zvyšuje emisní intenzitu jednotlivého oznamovacího barviva a umožňuje nezávislou identifikaci HCV RNA a HCV IC RNA CS 3 Doc Rev. 2.1

4 V amplifikačních procesech nukleové kyseliny může dojít k omezení účinnosti reakce vlivem inhibitorů přítomných ve vzorku. Ke kvalitativnímu testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 byla přidána HCV IC, což umožňuje identifikaci zpracovaných vzorků obsahujících látky, jež mohou interferovat s PCR amplifikací. HCV IC je neinfekční armored RNA (arna) konstrukce, která obsahuje fragmenty HCV sekvencí s identickými vazebnými místy pro primer jako cílovou HCV RNA a unikátní vazebnou oblast pro sondu, která umožňuje odlišení HCV IC amplikonu od HCV cílového amplikonu. Pro každý jednotlivý zpracovaný vzorek slouží jako extrakční a amplifikační kontrola. Při polymerizační fázi PCR reakce v analyzátoru COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 jsou vzorky osvětleny a excitovány filtrovaným světlem a filtrovaná emisní fluorescenční data jsou shromažďována pro každý vzorek. Hodnoty pro každý vzorek jsou poté korigovány na kolísání hodnot zařízení. Tyto hodnoty fluorescence jsou odeslány zařízením do softwaru AMPLILINK a uloženy v databázi. Pre-Checks (kontroly) se používají pro stanovení, zda-li HCV RNA a HCV IC RNA data reprezentují sady, které jsou platné a příznaky jsou generovány v případě, že data leží mimo nastavené limity. Po dokončení a splnění všech kontrol jsou odečety fluorescence zpracovány pro generování Ct hodnot pro HCV RNA a HCV IC RNA. Výsledky jsou nahlášeny jako pozitivní nebo negativní. ČINIDLA COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Qualitative Test, v2.0 (P/N: ) HCV QL v2.0 CS1 (HCV kazeta s činidly pro magnetické skleněné částice) Magnetické skleněné částice Tris pufr 0,09 % azid sodný 0,1 % Methylparaben HCV QL v2.0 CS2 (HCV kazeta s lytickým činidlem) Dihydrát citrátu sodného 42,5 % Guanidinthiokyanát < 6 % Polydokanol 0,9 % Dithiothreitol Xn 42,5 % hm. guanidinthiokyanát HCVQLV2 72 testů 1 x 72 testů 1 x 72 testů Zdraví škodlivý R20/21/22-R52/53-R32: Zdraví škodlivý při vdechování, styku s kůží a při požití. Škodlivý pro vodní organismy, může vyvolat dlouhodobé nepříznivé účinky ve vodním prostředí. Uvolňuje vysoce toxický plyn při styku s kyselinami. S13-S61: Uchovávejte odděleně od potravin, nápojů a krmiv. Zabraňte uvolnění do životního prostředí. Viz speciální pokyny nebo bezpečnostní listy. Xn < 6 % Polydokanol Zdraví škodlivý R22-R41-R50: Zdraví škodlivý při požití. Nebezpečí vážného poškození očí. Vysoce toxický pro vodní organismy. S26-S39-S61: Při zasažení očí okamžitě důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc. Používejte osobní ochranné prostředky pro oči a obličej. Zabraňte uvolnění do životního prostředí. Viz speciální pokyny nebo bezpečnostní listy CS 4 Doc Rev. 2.1

5 HCV QL v2.0 CS3 HCV multičinidlová kazeta obsahuje: Pase (Roztok proteinázy) Tris pufr < 0,05 % EDTA Chlorid vápenatý Octan vápenatý 7,8% proteináza Glycerol Xn 7,8% (hm.) proteináza 1 x 72 testů 1 x 3,8 ml Zdraví škodlivý R37/38-R41-R42: Dráždí dýchací orgány a kůži. Nebezpečí vážného poškození očí. Může vyvolat senzibilizaci při vdechování. S22-S24-S26-S36/37/39: Nevdechujte prach. Zamezte styku s kůží. Při zasažení očí okamžitě důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc. Používejte vhodný ochranný oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle nebo obličejový štít. EB (Eluční pufr) Tříbázový pufr 0,09 % azid sodný HCV QL v2.0 CS4 HCV kazeta na činidla specifická pro test obsahuje: IC (Vnitřní kontrola HCV) Tris pufr EDTA < 0,002 % Poly ra RNA (syntetická) < 0,001 % Armored HCV RNA konstrukce obsahující HCV vazebné sekvence primeru a unikátní vazebnou oblast sondy (neinfekční RNA v bakteriofágu MS2) 0,05 % azid sodný MMX (HCV Master Mix) Tricinový pufr Octan draselný Hydroxid draselný < 20 % dimethyl sulfoxid Glycerol < 0,004 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,002 % upstream a downstream HCV primery pro 5' UTR oblast HCV < 0,001 % fluorescenčně značené oligonukleotidové sondy specifické pro HCV a vnitřní kontrolu HCV < 0,001 % oligonukleotidový aptamer < 0,05 % polymerázy DNA Z05 a Z05D (mikrobiální) < 0,1 % enzym AmpErase (uracil-n-glykosyláza) (mikrobiální) 0,09 % azid sodný Mn 2+ (CAP/CTM roztok manganu) < 0,5 % octan manganatý Ledová kyselina octová 0,09 % azid sodný 1 x 8,1 ml 1 x 72 testů 1 x 3,6 ml 1 x 3,5 ml 1 x 19,8 ml CS 5 Doc Rev. 2.1

6 HCV (+) C, v2.0 (HCV Pozitivní kontrola) < 0,001 % Armored HCV RNA konstrukce obsahující HCV sekvence (neinfekční RNA v MS2 bakteriofágu) Negativní lidská plazma, nereagující podle testů na protilátky proti HCV, protilátky proti HIV-1/2, HIV p24 antigenu a HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA a HBV DNA nedetekovatelné PCR metodami 0,1 % konzervant ProClin 300 Xi (3:1) Směs 5-chloro-2-metyl-2H-izotiazolin-3-on a 2-metyl-2H-izotiazolin-3-on 6 x 0,85 ml Dráždivý R36/38: Dráždí oči a kůži. R43: Může vyvolat senzibilizaci při styku s kůží. CTM ( ) C [Negativní kontrola COBAS TaqMan (lidská plazma)] Negativní lidská plazma, nereagující podle testů na protilátky proti HCV, protilátky proti HIV-1/2, HIV p24 antigenu a HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA a HBV DNA nedetekovatelné PCR metodami 0,1 % konzervant ProClin 300 Xi (3:1) Směs 5-chloro-2-metyl-2H-izotiazolin-3-on a 2-metyl-2H-izotiazolin-3-on 6 x 1,0 ml Dráždivý R36/38: Dráždí oči a kůži. R43: Může vyvolat senzibilizaci při styku s kůží. HCV (+) C, v2.0 Clip (HCV klipy s čárovým kódem pro pozitivní kontrolu) HCV ( ) C, v2.0 Clip (HCV klipy s čárovým kódem pro negativní kontrolu) 1 x 6 klipů 1 x 6 klipů COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent PG WR 1 x 5,1 l Promývací činidlo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: ) PG WR (Promývací činidlo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) Dihydrát citrátu sodného < 0,1 % N-Methylisothiazolon-HCl VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Jak je tomu při každém testovacím postupu, je pro správné fungování tohoto testu zásadním požadavkem dodržovat principy správné laboratorní praxe. Vzhledem k vysoké citlivosti testu je třeba dbát opatrnosti, aby mezi činidly a amplifikačními směsmi nedošlo ke kontaminaci. A. PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO. B. Test se používá s lidským sérem nebo plazmou odebranou do EDTA antikoagulačního činidla. C. Nepipetujte ústy. D. V pracovních laboratorních prostorách nejezte, nepijte a nekuřte. Při manipulaci se vzorky a s činidly ze soupravy noste ochranné rukavice na jedno použití, laboratorní pláště a prostředek pro ochranu očí. Po práci se vzorky a činidly si důkladně umyjte ruce CS 6 Doc Rev. 2.1

7 E. Při odebírání alikvotních podílů z kontrolních lahviček dbejte na to, aby nedošlo k mikrobiální nebo ribonukleázové kontaminaci. F. Doporučuje se používat sterilní pipety na jedno použití a špičky na pipety bez RNázy. G. Nemíchejte dohromady kontroly z různých šarží, ani z různých lahviček téže šarže. H. Nesmíchávejte kazety na činidla ani kontroly z různých souprav. I. Neotevírejte kazety COBAS AmpliPrep ani nevyměňujte, nemíchejte, neodstraňujte ani nepřidávejte láhve. J. Nespotřebovaná činidla, odpad a vzorky likvidujte v souladu s celostátními a místními předpisy. K. Po uplynutí data expirace již soupravu nepoužívejte. L. Bezpečnostní listy pro materiály (MSDS) zašle na vyžádání Vaše místní pobočka společnosti Roche. M. Manipulace se vzorky a kontrolami se musí řídit pravidly pro zacházení s infekčním materiálem. Musí být používány bezpečné laboratorní postupy, např. postupy uvedené v publikaci Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 11 a v dokumentu CLSI č. M29-A3 12. Všechny plochy důkladně očistěte a vydezinfikujte čerstvě připraveným 0,5% roztokem chlornanu sodného v deionizované nebo destilované vodě. N. CTM ( ) C a HCV (+) C, v2.0 obsahují lidskou plazmu pocházející z lidské krve. Zdrojový materiál byl testován a byl shledán nereaktivním na přítomnost povrchového antigenu hepatitidy B (HBsAg), protilátek proti HIV-1/2 a HCV a antigenu HIV p24. Testování negativní lidské plazmy metodami PCR neprokázalo žádné detekovatelné HIV-1 RNA, HCV RNA ani HBV DNA. Nicméně žádná známá testovací metoda nepředstavuje dokonalou záruku, že se s deriváty z lidské krve nepřenesou nějaká infekční agens. Proto je třeba považovat všechen materiál včetně CTM ( ) C a HCV (+) C, v2.0 za potenciálně infekční. O. EB, IC, Mn 2+ a MMX obsahují azid sodný. Ten může reagovat s olověným nebo měděným potrubím a vytvářet vysoce explozivní kovové azidy. Při likvidaci roztoků obsahujících azid sodný do laboratorního umyvadla propláchněte odtok velkým množstvím vody, abyste tak zabránili vytváření azidů. P. Při práci s jakýmkoliv činidlem používejte rukavice na jedno použití, pracovní oděv a ochranné brýle. Dbejte na to, aby se tyto materiály nedostaly do styku s pokožkou, očima nebo sliznicemi. Pokud ke styku dojde, okamžitě postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody. Pokud by byla tato opatření zanedbána, může dojít k popáleninám. Jestliže se některé činidlo rozlije nebo rozsype, před vytřením dosucha je zřeďte vodou. Q. Dbejte na to, aby HCV QL v2.0 CS2 a tekutý odpad včetně použitých jednotek na zpracování vzorků (SPU) COBAS AmpliPrep v zařízení COBAS AmpliPrep, které obsahují guanidin thiokyanát, nepřišly do styku s roztokem chlornanu sodného (bělidlo). Ze směsi by se mohl uvolňovat vysoce toxický plyn CS 7 Doc Rev. 2.1

8 POŽADAVKY NA SKLADOVÁNÍ A MANIPULACI A. HCV QL v2.0 CS1, HCV QL v2.0 CS2, HCV QL v2.0 CS3 a HCV QL v2.0 CS4 skladujte při 2-8 C. Pokud jsou nepoužitá, jsou tato činidla stabilní až do vyznačeného data expirace. Po použití jsou při teplotě 2 8 C stálá ještě 70 dní nebo do data expirace, je-li tato doba kratší. HCV QL v2.0 CS1, HCV QL v2.0 CS2, HCV QL v2.0 CS3 a HCV QL v2.0 CS4 je možné v zařízení COBAS AmpliPrep použít maximálně po celkovou dobu 96 hodin. Činidla musí být mezi jednotlivými použitími uchovávána při teplotě 2-8 C. B. HCV (+) C, v2.0 a CTM ( ) C uchovávejte při teplotě 2-8 C. Tyto kontroly jsou stálé do vyznačeného data expirace. Po otevření je nutné nespotřebovanou část zlikvidovat. C. Klipy s čárovým kódem [HCV (+) C, v2.0 klip a HCV ( ) C, v2.0 klip] skladujte při teplotě 2-30 C. D. PG WR skladujte při teplotách 2-30 C. PG WR je stálý do vyznačeného data expirace. Po otevření se uchovává při teplotě 2 30 C a za těchto okolností je stálý 28 dní (resp. do data expirace, je-li tato doba kratší). DODÁVANÝ MATERIÁL COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Qualitative Test, v2.0 HCVQLV2 HCV QL v2.0 CS1 (kazeta s činidly pro magnetické skleněné částice pro test HCV) HCV QL v2.0 CS2 (kazeta s lytickým činidlem pro test HCV) HCV QL v2.0 CS3 (multičinidlová kazeta pro test HCV) HCV QL v2.0 CS4 (kazeta s činidly specifickými pro test HCV) HCV (+) C, v2.0 (pozitivní kontrola pro test HCV) CTM ( ) C [COBAS TaqMan negativní kontrola (lidská plazma)] HCV (+) C, v2.0 Clip (klip s čárovým kódem pro pozitivní kontrolu pro test HCV) HCV ( ) C, v2.0 Clip (klip s čárovým kódem pro negativní kontrolu pro test HCV) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Promývací činidlo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR PG WR (Promývací činidlo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) CS 8 Doc Rev. 2.1

9 POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Vybavení a software Zařízení COBAS AmpliPrep Analyzátor COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 Dokovací stanice (volitelně) Zařízení cobas p 630 (volitelně) Software AMPLILINK, verze 3.3 Datová stanice pro software AMPLILINK s tiskárnou Příručky k zařízení a softwaru: Aplikační příručka softwaru AMPLILINK verze 3.3 pro použití se zařízením COBAS AmpliPrep, analyzátorem COBAS TaqMan, analyzátorem COBAS TaqMan 48, analyzátorem COBAS AMPLICOR a zařízením cobas p 630 Příručka k přístroji pro zařízení COBAS AmpliPrep pro použití s analyzátorem COBAS TaqMan, analyzátorem COBAS TaqMan 48, analyzátorem COBAS AMPLICOR nebo zařízením cobas p 630 a softwarem AMPLILINK, verze 3.2 a 3.3 Příručka k přístroji pro analyzátor COBAS TaqMan (plus volitelná dokovací stanice) pro použití s provozní příručkou pro software AMPLILINK, verze 3.2 a 3.3 Příručka k přístroji pro analyzátor COBAS TaqMan 48 pro použití s provozní příručkou pro software AMPLILINK, verze 3.2 a 3.3 Příručka obsluhy cobas p 630, verze softwaru 2.2 (volitelně) Další potřebný materiál Stojan na vzorky (stojan SK24) Stojan na činidla Stojan SPU K-nosič Přemísťovač K-nosičů Stojan na K-nosiče Pipetory s aerosolovou bariérou nebo špičkami bez DNázy s přímým vypuzováním (objem 1000 µl); pipetory musí být přesné na 3 % jmenovitého objemu. Musí být použity špičky s aerosolovou bariérou nebo s přímým vypuzováním bez RNázy, aby se zabránilo vzájemné kontaminaci vzorku a amplikonu. Rukavice na jedno použití bez pudru Vířivý mixér Spotřební materiál Jednotky pro zpracování vzorku (SPU) Vstupní zkumavky pro vzorek (S-zkumavky) s klipy s čárovým kódem Stojan s K-špičkami Krabice s K-zkumavkami v počtu 12 x CS 9 Doc Rev. 2.1

10 ODBĚR, PŘEPRAVA A SKLADOVÁNÍ VZORKŮ POZN.: Zacházejte se vzorky a kontrolami jako s potenciálně infekčním materiálem. Odběr a skladování vzorků Kvalitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 je určen pro použití se vzorky séra nebo EDTA plazmy. Krev se odebírá do zkumavek SST (sérové separační zkumavky), do zkumavek pro přípravu plazmy BD Vacutainer PPT pro diagnostické testovací metody nebo do sterilních zkumavek za použití EDTA (uzávěr levandulové barvy) jako antikoagulantu. Při manipulaci s odběrovými zkumavkami se řiďte pokyny příslušného výrobce. Čerstvě odebrané vzorky (plná krev) je možné před odstředěním skladovat při 2-25 C až 24 hodin. Sérum nebo EDTA plazmu přesuňte po centrifugaci do sterilní polypropylenové zkumavky. Doporučuje se vzorky uchovávat v alikvotních podílech přibližně po µl ve sterilních polypropylenových zkumavkách o objemu 2,0 ml se šroubovacím uzávěrem (například 2ml zkumavka se šroubovacím uzávěrem od společnosti Sarstedt). Vzorky séra nebo EDTA plazmy se mohou uchovávat: Při teplotě 2-8 C až 72 hodin. Při teplotě -20 C až -80 C až 6 týdnů. Vzorky séra a EDTA plazmy mohou být zmraženy a rozmraženy maximálně pětkrát bez ztráty HCV RNA. Přeprava vzorků Při přepravě plné krve, EDTA plazmy nebo séra je třeba dodržovat celostátní resp. místní předpisy o přepravě etiologických látek 13. Plná krev se přepravuje za teplot 2 25 C a musí se odstředit do 24 hodin od odběru. EDTA plazma nebo sérum se může přepravovat při teplotě 2 8 C nebo ve zmrazeném stavu při teplotách -20 C až -80 C. NÁVOD K POUŽITÍ Podrobné provozní pokyny, popis možných konfigurací, výsledky tisku, interpretaci příznaků a poznámek a chybová hlášení naleznete v provozní příručce pro software AMPLILINK, verze 3.3, jak je uvedeno v části Vybavení a software. Velkost dávky a pracovní postup Každá souprava obsahuje dostatek činidel pro 72 testů, které mohou být provedeny v dávkách po 12 až 24 testech. Alespoň jedna z každé kontroly [CTM ( ) C a HCV (+) C, v2.0] musí být zahrnuta do každé dávky (viz část Kontrola kvality ). Cyklus analyzátoru COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 musí být zahájen do 240 minut po dokončení přípravy vzorku a kontroly. Zpracované vzorky a kontroly NEZMRAZUJTE ani NESKLADUJTE při teplotě 2-8 C. Příprava vzorku a kontroly Používáte-li vzorky zmrazené, tak je ponechte při pokojové teplotě, dokud kompletně nerozmrznou a nechte je 3 5 sekund vířit před použitím. Kontroly by měly být před použitím vyjmuty ze skladování při teplotě 2 8 C, vyrovnány na okolní teplotu a před použitím vířeny 3 5 sekund. Nastavení zařízení COBAS AmpliPrep Část A. Údržba a plnění A1. Zařízení COBAS AmpliPrep je připraveno k práci v pohotovostním režimu. A2. Zapněte datovou stanici pro software AMPLILINK (ON). Připravte datovou stanici dle následujícího návodu: a. Přihlaste se k Windows XP. b. Dvakrát klikněte na ikonu softwaru AMPLILINK. c. Přihlaste se k softwaru AMPLILINK zadáním přiděleného uživatelského jména a hesla. A3. Zkontrolujte zásobu PG WR pomocí obrazovky Status a v případě potřeby jej doplňte. A4. Proveďte veškerou údržbu, jak je uvedeno v záložce Due. Zařízení COBAS AmpliPrep automaticky naplní systém CS 10 Doc Rev. 2.1

11 Část B. Plnění kazet s činidly POZN.: Všechny kazety s činidly by měly být vyjmuty ze skladovacího místa s teplotou 2 8 C, okamžitě vloženy do zařízení COBAS AmpliPrep a ponechány pro vyrovnání s okolní teplotou v zařízení po dobu minimálně 30 minut předtím, než bude zpracován první vzorek. Nenechejte kazety s činidly vyrovnat s teplotou mimo zařízení, protože by mohlo dojít ke kondenzaci na štítcích s čárovým kódem. Neotírejte kondenzát v případě, že se objeví na štítcích s čárovým kódem. B1. HCV QL v2.0 CS1 vložte do stojanu na činidla. HCV QL v2.0 CS2, HCV QL v2.0 CS3 a HCV QL v2.0 CS4 vložte do dalšího stojanu na činidla. B2. Stojan na činidla obsahující HCV QL v2.0 CS1 zaveďte do pozice stojanu A zařízení COBAS AmpliPrep. B3. Stojan na činidla obsahující HCV QL v2.0 CS2, HCV QL v2.0 CS3 a HCV QL v2.0 CS4 zaveďte do pozice stojanu B, C, D nebo E zařízení COBAS AmpliPrep (podrobné informace viz příslušné příručky pro zařízení). Část C. Plnění spotřebním materiálem POZN.: Stanovte počet kazet na činidla pro COBAS AmpliPrep, jednotek pro zpracování vzorků (SPU), vstupních zkumavek na vzorky (S-zkumavky), K-špiček a K-zkumavek, které budou potřeba. Jedna SPU, jedna vstupní S-zkumavka, jedna K-špička a jedna K-zkumavka jsou potřeba pro každý vzorek a kontrolu. Při použití zařízení COBAS AmpliPrep s analyzátorem COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 je možné provést více nastavení. Podle použité konfigurace zaveďte příslušný počet stojanů s kazetami na činidla, stojanů se vzorky se vstupními S-zkumavkami, stojanů SPU, stojanů s K-špičkami, stojanů s K-zkumavkami a K-nosiči na stojanech pro K-nosiče do příslušných pozic stojanů zařízení COBAS AmpliPrep. C1. SPU umístěte do stojanu(ů) SPU a stojan(y) zaveďte do pozice stojanu J, K nebo L zařízení COBAS AmpliPrep. C2. Podle použité konfigurace zaveďte plný(é) stojan(y) K-zkumavek do polohy stojanu M, N, O nebo P zařízení COBAS AmpliPrep. C3. Plný(é) stojan(y) zaveďte na K-špičky do polohy stojanu M, N, O nebo P zařízení COBAS AmpliPrep. C4. Podle použité konfigurace zaveďte K-nosiče na stojanech K-nosičů do polohy stojanu M, N, O nebo P zařízení COBAS AmpliPrep. Část D. Objednávání a vkládání vzorků D1. Stojany na vzorky připravte následovně: připevněte klipy s čárovým kódem ke každé pozici stojanu na vzorky, kam je ukládán vzorek (S-zkumavka). Jeden ze specifických klipů s čárovým kódem pro kontroly [CTM ( ) C a HCV (+) C, v2.0] připevněte ke každé pozici stojanu na vzorky, do které budou kontroly (S-zkumavky) uloženy. Klipy s čárovým kódem by měly mít stejné číslo šarže kontroly, jako je číslo šarže na kontrolních lahvičkách v soupravě. Dbejte na to, abyste přiřadili správnou kontrolu k pozici s odpovídajícím kontrolním klipem s čárovým kódem. Vložte jednu vstupní S-zkumavku do každé pozice obsahující klip s čárovým kódem. D2. Pomocí softwaru AMPLILINK vytvořte příkazy pro každý vzorek a kontrolu v okně Orders na záložce Sample. Zvolte příslušný testový soubor a dokončete uložením. D3. Přiřaďte příkazy pro vzorek a kontrolu k pozici stojanu na vzorky v okně Orders a záložce Sample Rack. Číslo stojanu na vzorky musí být pro stojan připravený v kroku D1. D4. Vytiskněte zprávu Sample Rack Order pro použití jako pracovní tabulku CS 11 Doc Rev. 2.1

12 D5. Stojany na vzorky a kontroly připravte na vyhrazeném místě pro vzorky a kontroly následovně: Každý vzorek a každou kontrolu [CTM ( ) C a HCV (+) C, v2.0] protřepejte po dobu 3 až 5 sekund. Při manipulaci se vzorky a kontrolami zabraňte kontaminaci rukavic. D µl každého vzorku a kontroly [CTM ( ) C a HCV (+) C, v2.0] přeneste do odpovídající vstupní S-zkumavky s čárovým kódem pomocí mikropipetoru s aerosolovou bariérou nebo špičkou bez RNázy s pozitivním posuvem. Zabraňte přenosu částic a/nebo fibrinových sraženin z originálního vzorku do vstupní S-zkumavky. Vzorky a kontroly by měly být přemisťovány do pozic na zkumavky, jak bylo určeno a zaznamenáno v pracovní tabulce v kroku D4. Klipy s čárovým kódem by měly mít stejné číslo šarže kontroly, jako je číslo šarže na kontrolních lahvičkách v soupravě. Přiřaďte správnou kontrolu k pozici s odpovídajícím klipem s čárovým kódem kontroly. Zabraňte kontaminaci horní části S-zkumavky vzorkem nebo kontrolami. D7. Jestliže používáte zařízení cobas p 630 pro přípravu vzorků, přečtěte si příručku obsluhy pro zařízení cobas p 630. D8. V závislosti na použité konfiguraci zaveďte stojan(y) na vzorky naplněné vstupními S-zkumavkami do pozic F, G nebo H zařízení COBAS AmpliPrep. D9. V závislosti na použité konfiguraci zaveďte stojan(y) na vzorky se vstupními S-zkumavkami a K-zkumavkami (jedna pro každou vstupní S-zkumavku, zavedené v pozici vpravo vedle vstupních S-zkumavek) do pozic F, G nebo H zařízení COBAS AmpliPrep. Část E. Spuštění cyklu zařízení COBAS AmpliPrep E1. Spusťte zařízení COBAS AmpliPrep pomocí softwaru AMPLILINK. Část F. Konec cyklu zařízení COBAS AmpliPrep a přesun do analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48 (pouze pro manuální přenos) F1. Zkontrolujte příznaky a chybová hlášení. F2. Zpracované vzorky a kontroly vyjměte ze zařízení COBAS AmpliPrep na stojanech na vzorky (pro analyzátor COBAS TaqMan bez dokovací stanice) nebo na stojanech pro K-nosiče (pro analyzátor COBAS TaqMan 48), v závislosti na konfiguraci. F3. Odstraňte odpad ze zařízení COBAS AmpliPrep. POZN.: Žádné zpracované vzorky a kontroly by neměly být vystaveny světlu po dokončení přípravy vzorku a kontroly. Amplifikace a detekce Nastavení analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48 Cyklus analyzátoru COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 musí být zahájen do 240 minut po dokončení přípravy vzorku a kontroly. Zpracované vzorky a kontroly NEZMRAZUJTE ani NESKLADUJTE při teplotě 2-8 C. Část G. Plnění zpracovaných vzorků G1. V závislosti na konfiguraci zařízení proveďte odpovídající kroky pro přemístění K-zkumavek do analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48. Část H. Spuštění cyklu analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48 H1. Spuštění cyklu analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48 v závislosti na použité konfiguraci CS 12 Doc Rev. 2.1

13 Část I. Dokončení cyklu analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48 I1. Po dokončení cyklu analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48 vytiskněte výsledkový protokol. Zkontrolujte příznaky a chybová hlášení ve výsledkovém protokolu. Vzorky s příznaky a komentáři jsou interpretovány podle popisu v části Výsledky. Po odsouhlasení uložte data do archívu. I2. Vyjměte použité K-zkumavky z analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48. KONTROLA KVALITY Do každé testované dávky musí být zahrnuta jedna negativní kontrola a jedna HCV pozitivní kontrola COBAS TaqMan. Dávka je platná v případě, že se neobjeví žádný příznak pro žádnou kontrolu [HCV (+) C, v2.0 a CTM ( ) C]. Není rozhodující, na které pozici ve stojanu na vzorky jsou kontroly umístěny. Na výtisku výsledků zkontrolujte výskyt příznaků a poznámek pro ověření, zda je dávka platná. Negativní kontrola CTM ( ) C musí dát výsledek Negative. Je-li CTM ( ) C označeno jako neplatné, pak je celá dávka neplatná. Celý postup zopakujte (příprava vzorků a kontrol, amplifikace a detekce). Je-li CTM ( ) C trvale neplatná ve více dávkách, kontaktujte vašeho místního zástupce společnosti Roche pro technickou pomoc. Pozitivní kontrola HCV (+) C, v2.0 musí dát výsledek Positive. Je-li HCV (+) C, v2.0 označeno jako neplatné, pak je celá dávka neplatná. Celý postup zopakujte (příprava vzorků a kontrol, amplifikace a detekce). Je-li HCV (+) C, v2.0 trvale neplatná ve více dávkách, kontaktujte vašeho místního zástupce společnosti Roche pro technickou pomoc. VÝSLEDKY Analyzátor COBAS TaqMan nebo analyzátor COBAS TaqMan 48 automaticky stanovuje přítomnost HCV RNA ve vzorcích a kontrolách. Software AMPLILINK: Stanovuje Ct pro HCV RNA a HCV IC RNA. Stanovuje přítomnost HCV RNA a HCV IC RNA na základě hodnot Ct pro HCV RNA a HCV IC RNA. Validace dávky: Zkontrolujte výsledkové okno softwaru AMPLILINK nebo výsledkový výtisk na přítomnost příznaků a komentářů, abyste se ujistili, že je dávka platná. Pro kontrolní objednávky je provedena kontrola, zda-li je hodnota Ct pro danou kontrolu v rámci specifikovaného rozmezí. Je-li hodnota Ct pro danou kontrolu mimo její rozsah, je vytvořen PŘÍZNAK, který ukazuje, že kontrola selhala. Dávka je platná v případě, že se neobjeví žádný příznak pro žádnou kontrolu [HCV (+) C, v2.0 a CTM ( ) C]. Dávka není platná, pokud se u HCV kontrol objeví některý z následujících indikátorů: CS 13 Doc Rev. 2.1

14 Negativní kontrola: Příznak Výsledek Interpretace NC_INVALID Invalid Neplatný výsledek nebo výsledek negativní kontroly není negativní. HCV pozitivní kontrola: Příznak Výsledek Interpretace PC_INVALID Invalid Neplatný výsledek nebo výsledek pozitivní kontroly není pozitivní. Pokud je dávka neplatná, je třeba celou dávku, tj. včetně přípravy vzorků a kontrol, reverzní transkripce, amplifikace a detekce, zopakovat. Interpretace výsledků: Pro platnou dávku zkontrolujte každý jednotlivý vzorek na přítomnost příznaků nebo komentářů ve výtisku výsledku. Platná dávka může zahrnovat platné i neplatné výsledky vzorků podle toho, zda se u jednotlivých vzorků objeví příznaky resp. komentáře nebo ne. Výsledky vzorků se interpretují takto: Výsledek Interpretace Negative Positive Ct hodnota pro HCV je nad hranicí testu nebo nebyla získána žádná Ct hodnota pro HCV. Výsledky nahlaste jako HCV RNA nedetekována. Výsledky nahlaste jako HCV RNA detekována. Pokud je zobrazený výsledek vzorku Failed, Invalid nebo Aborted, prostudujte si aplikační příručku pro software AMPLILINK verze 3.3, jak je uvedeno v části Potřebný materiál, který není součástí dodávky. PROCEDURÁLNÍ OMEZENÍ 1. Tento test byl validován pro používání pouze s lidským sérem nebo plazmou odebranou do EDTA jako antikoagulantu. Testování jiných typů vzorků může vést k nepřesným výsledkům. 2. I když vzácně, mutace ve vysoce konzervovaných oblastech virového genomu pokrytého primery testu a/nebo sondami mohou vést k selhání detekce viru. 3. Detekce HCV RNA závisí na tom, kolik virových částic je ve vzorku přítomno, na což mají vliv metody odběru vzorku, faktory pacienta (např. věk, symptomy) a/nebo stádium infekce. 4. K tomu, aby byly výsledky spolehlivé, musí být dodržovány správné postupy odběru vzorků, jejich přepravy, uchovávání a zpracování. 5. Díky přítomnosti enzymu AmpErase v Master Mixu pro test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV se snižuje riziko kontaminace amplikonu. Kontaminaci od HCV pozitivních kontrol a klinických vzorků lze ovšem zabránit pouze důsledným uplatňováním zásad správné laboratorní praxe a pečlivým dodržováním postupů uvedených v tomto příbalovém letáku. 6. S tímto výrobkem mohou pracovat pouze pracovníci proškolení pro práci se zařízením cobas p 630 (volitelně), zařízením COBAS AmpliPrep a analyzátorem COBAS TaqMan Analyzer nebo analyzátorem COBAS TaqMan 48. Obsluha musí dobře znát aplikace běžící na zařízeních a musí uplatňovat zásady správné laboratorní praxe CS 14 Doc Rev. 2.1

15 7. Tento výrobek se smí používat pouze se zařízením cobas p 630 (volitelně), zařízením COBAS AmpliPrep a analyzátorem COBAS TaqMan nebo analyzátorem COBAS TaqMan Vzhledem k rozdílům mezi technologiemi se doporučuje, aby uživatelé před přechodem od jedné technologie k druhé provedli ve své laboratoři studie pro stanovení rozdílů mezi těmito technologiemi. INTERFERUJÍCÍ LÁTKY Zvýšené hladiny triglyceridů (3 300 mg/dl), konjugovaného bilirubinu (25 mg/dl) a nekonjugovaného bilirubinu (20 mg/dl), albuminu (6 000 mg/dl), hemoglobinu (200 mg/dl) a lidské DNA (40 mg/dl) ve vzorcích a také přítomnost autoimunních onemocnění jako je systémový lupus erythematodes (SLE), revmatoidní artritida (RA) a antinukleární protilátky (ANA) neinterferují s detekcí HCV RNA v kvalitativním testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0. Následující složky léčiv testované při maximální plazmatické hladině (C max ) a při trojnásobné C max nevykázaly interferenci s detekcí HCV RNA pomocí kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0: Nukleotidové inhibitory reverzní transkriptázy a DNA polymerázy Tenofovir Adefovir dipivoxil Inhibitory HIV proteázy Atazanavir Saquinavir Ritonavir Lopinavir/Ritonavir Nelfinavir Darunavir Tipranavir Fosamprenavir Inhibitory HIV fúze Enfuvirtid Látky pro léčbu herpetických virů Gancyklovir Valgancyklovir Acyklovir Inhibitor HIV integrázy Raltegravir Nenukleozidové inhibitory reverzní transkriptázy Efavirenz Nevirapin Nukleozidové inhibitory reverzní transkriptázy Lamivudin Zidovudin Stavudin Abacavir Didanosin Emtricitabin Entekavir Telbivudin Inhibitory vstupu HIV Maraviroc Imunomodulátory Peginterferon alfa-2b Ribavirin Peginterferon alfa-2a CS 15 Doc Rev. 2.1

16 HODNOCENÍ NEKLINICKÝCH FUNKČNÍCH PARAMETRŮ A. Mez detekce Detekční limit kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 byl stanoven analýzou sérií ředění Mezinárodního standardu WHO pro RNA viru hepatitidy C pro analýzy nukleových kyselin pomocí amplifikační technologie, genotyp 1a, získaný od NIBSC, u HCV negativní lidské EDTA plazmy nebo séra. Pro každou základní složku byly analyzovány tři nezávislé série ředění. Celkově až 252 replikátů na hladinu koncentrace bylo testováno pro každý typ matrix. Studie byla provedena s použitím tří šarží činidel kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0. Výsledky pro EDTA plazmu a sérum jsou vyobrazeny v tabulkách 1 a 2 a ukazují, že kvalitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 detekoval HCV RNA při koncentracích 15 IU/ml nebo vyšších s úspěšností detekce 95 %. Rozdíl mezi sérem a EDTA plazmou nebyl statisticky významný. Tabulka 1 Detekční limit v EDTA plazmě stanovený Mezinárodním standardem WHO pro RNA viru hepatitidy C pro analýzy nukleových kyselin pomocí amplifikační technologie Vstupní titr (HCV RNA IU/ml) Počet platných replikátů Počet pozitivních Úspěšnost detekce v % , LOD podle PROBIT při 95% úspěšnosti detekce LOD podle úspěšnosti detekce 12 IU/ml (95% interval spolehlivosti: IU/ml) 15 IU/ml Tabulka 2 Detekční limit v séru stanovený Mezinárodním standardem WHO pro RNA viru hepatitidy C pro analýzy nukleových kyselin pomocí amplifikační technologie Vstupní titr (HCV RNA IU/ml) Počet platných replikátů Počet pozitivních Úspěšnost detekce v % , LOD podle PROBIT při 95% úspěšnosti detekce LOD podle úspěšnosti detekce 11 IU/ml (95% interval spolehlivosti: IU/ml) 15 IU/ml CS 16 Doc Rev. 2.1

17 B. Přesnost Přesnost kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 byla stanovena analýzou sérií ředění Mezinárodního standardu WHO pro RNA viru hepatitidy C pro analýzy nukleových kyselin pomocí amplifikační technologie u HCV negativní lidské EDTA plazmy nebo séra. Byly testovány dvě (5 IU/ml a 50 IU/ml) úrovně koncentrace u až 168 replikátů ve 12 cyklech ve 4 dnech. Každý vzorek prošel celou procedurou kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 zahrnující přípravu vzorku, amplifikaci a detekci. Studie byla provedena s použitím tří šarží činidel kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0. Všechny údaje o přesnosti byly vyhodnoceny výpočtem úspěšnosti detekce v % pro každého člena panelu dle šarže činidla (kombinace obou matric). Kvalitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 prokazuje stálou účinnost při koncentracích 5 IU/ml a 50 IU/m u vzorků EDTA plazmy a séra u všech tří testovaných šarží činidla (tabulka 3). Tabulka 3 Přesnost kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 (spojené vzorky EDTA plazmy a séra) Nominální koncentrace [IU/ml] Úspěšnost detekce v % Šarže 1 Šarže 2 Šarže C. Inkluzivita Účinnost kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 u HCV genotypů byla vyhodnocená ověřením meze detekce u genotypů 1 až 6. Klinické vzorky HCV RNA 8 různých genotypů/subtypů (1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 a 6) byly rozředěny na tři různé hladiny koncentrace v EDTA plazmě nebo séru a u každé hladiny byla stanovena míra úspěšnosti detekce s až 63 replikáty. Studie byla provedena s použitím jedné šarže činidel kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0. Výsledky pro EDTA plazmu a sérum jsou vyobrazeny v tabulkách 4 a 5 a jsou důkazem, že kvalitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 detekoval HCV RNA u 8 různých genotypů/subtypů při koncentracích 15 IU/ml nebo vyšších s úspěšností detekce 95 %. Rozdíl mezi sérem a EDTA plazmou nebyl statisticky významný CS 17 Doc Rev. 2.1

18 Počet platných replikátů Tabulka 4 Verifikace meze detekce u genotypů HCV RNA v EDTA plazmě 5 IU/ml 15 IU/ml 45 IU/ml Úspěšnost Počet detekce pozitivních v % Počet platných replikátů Úspěšnost Počet detekce pozitivních v % Počet Počet platných pozitivních replikátů Úspěšnost detekce v % 1a b a b Genotyp Genotyp Počet platných replikátů Tabulka 5 Verifikace meze detekce u genotypů HCV RNA v séru 5 IU/ml 15 IU/ml 45 IU/ml Úspěšnost Počet detekce pozitivních v % Počet platných replikátů Úspěšnost Počet detekce pozitivních v % Počet Počet platných pozitivních replikátů Úspěšnost detekce v % 1a b a b CS 18 Doc Rev. 2.1

19 D. Diagnostická senzitivita Diagnostická senzitivita kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 byla stanovena analýzou jednotlivých vzorků EDTA plazmy nebo séra pozitivních na HCV RNA (celkem 337 výsledků) pomocí dvou šarží činidel kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0. Všechny vzorky vyšly pozitivně pro HCV RNA. V tomto panelu je diagnostická senzitivita kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v % (jednostranná dolní 95% mez spolehlivosti: 99,1 %). Navíc byla diagnostická senzitivita kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 vyhodnocena během sérokonverze. Členy 10 komerčně dostupných HCV sérokonverzních panelů, kde každý panel byl odebrán od jednoho dárce plazmy během sérokonverze protilátek, byly testovány jednou šarží činidel kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0. Kvalitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 detekoval HCV dříve u 10 z 10 sérokonverzních panelů ve srovnání s referenčním sérologickým testem Abbott HCV EIA (enzymová imunoanalýza) 2.0. Ve srovnání s jiným testem NAT, testem COBAS AMPLICOR HCV, v2.0, kvalitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 detekoval HCV RNA dříve (ve 2 z 10 panelů) nebo ve stejný den po prvním odběru krve (8 z 10 panelů). E. Specificita Specificita kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 byla stanovena analýzou HCV RNA-negativní a séronegativní EDTA plazmy nebo séra od dárců krve. Jednotlivé vzorky EDTA plazmy a séra (celkem 500 výsledků) byly testovány pomocí dvou šarží činidel kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v vzorků vyšlo negativně pro HCV RNA. V tomto panelu je specificita kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 99,8 % (jednostranná dolní 95% mez spolehlivosti: 99,1 %). F. Analytická specificita Analytická specificita kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 byla vyhodnocena ředěním zásobních roztoků různých patogenů o vysokém titru (viz tabulka 6) HCV RNA pozitivními a HCV RNA negativními klinickými vzorky EDTA plazmy. Žádný z patogenů jiných než HCV neinterferoval s účinností kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 ani nevykazoval žádný falešně pozitivní výsledek. Tabulka 6 Analytická specificita vzorků Jiné než HCV Flaviviry Virus Západního Nilu Virus St. Louiské encefalitidy Virus encefalitidy Murray Valley Virus Dengue typy 1, 2, 3 a 4 Virus žluté zimnice Zika virus Virus FSME (kmen HYPR) Baktérie Propionibacterium acnes Staphylococcus aureus Kvasinky Candida albicans Viry Adenovirus typu 5 Cytomegalovirus Epstein-Barr virus Virus hepatitidy B Virus hepatitidy A HIV-1 Lidský T-buněčný lymfotropní virus typ 1 a 2 Lidský herpes virus typ 6 Herpesvirus simplex 1 a 2 Chřipka typu A Lidský papillomavirus Varicella zoster virus CS 19 Doc Rev. 2.1

20 G. Účinnost ve srovnání s testem COBAS AMPLICOR HCV, v2.0 Účinnost kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 a testu COBAS AMPLICOR HCV, v2.0 byla porovnána analýzou vzorků séra a EDTA plazmy získaných od pacientů infikovaných HCV. Celkem bylo v duplikátu testováno 451 EDTA vzorků plazmy a séra genotypů 1 až 5 (genotyp 5 pouze u EDTA plazmy) a byly vykázány dva platné výsledky. Výsledky 432 vzorků EDTA plazmy a séra byly pozitivní a v detekčním rozsahu obou testů, což znamená 100% pozitivní shodu mezi kvalitativním testem COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 a testem COBAS AMPLICOR HCV, v2.0. Výsledky 19 vzorků byly z analýzy dat vyloučeny; 6 vzorků vykázalo neshodné výsledky kvůli vyšší senzitivitě kvalitativního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 ve srovnání s testem COBAS AMPLICOR HCV, v2.0, zbývajících 13 vzorků vykázalo neshodné výsledky mezi 2 replikáty hodnocenými v každém testu. Všechny negativní testované vzorky EDTA plazmy a séra (celkem 200 výsledků) byly platné a vykázaly negativní výsledek, což znamená 100% negativní shodu mezi kvalitativním testem COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 a testem COBAS AMPLICOR HCV, v CS 20 Doc Rev. 2.1

21 LITERATURA 1. Choo Q-L,.Kuo G, Weiner AJ, Overby LR., Bradley DW and Houghton M Isolation of a cdna clone derived from a blood-borne non-a, non-b viral hepatitis viral genome. Science 244: Armstrong GL, Wasley A, Simard EP et al The prevalence of hepatitis C virus infection in the United States, 1999 through Ann Intern Med 144: Rustgi VK The epidemiology of hepatitis C infection in the United States. J Gastroenterol 42: Lauer GM, Walker BD Hepatitis C virus infection. N Engl J Med 345: Caruntu FA, Benea L Acute hepatitis C virus infection: Diagnosis pathogenesis, treatment. JGLD 15: Gretch D, del la Rosa D, Corey L and Carithers R Assessment of Hepatitis C viremia using molecular amplification technologies. Viral Hepat Rev 2: Young KKY, Resnick R and Myers TW Detection of hepatitis C virus RNA by a combined reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. J Clin Microbiol 31: NIH Management of Hepatitis C. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement # Bukh J, Purcell RH and Miller RH Sequence analysis of the 5 noncoding region of hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA 89: Longo MC, Berninger MS and Hartley JL Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93: U.S. Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 5 th Edition, HHS Publication No. (CDC) ; December Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections: Approved Guideline 3 rd Edition. CLSI Document M29-A3. CLSI: Wayne, PA International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 49th Edition CS 21 Doc Rev. 2.1