Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin

Transkript

1 KATEDRA SPECIÁLNÍ PRODUKCE ROSTLINNÉ září 2014 prof. Ing. Vladislav Čurn, Ph.D. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích Zemědělská fakulta, Katedra speciální produkce rostlinné Na Sádkách 1780, České Budějovice

2 Cíle a perspektivy šlechtění řepky ve vztahu k RB využití metody androgeneze in vitro pro tvorbu homozygotních (izogenních) linií možnost produkce haploidů androgenezí in vitro podstatné zkrácení šlechtitelského procesu rychlejší získávání výchozího šlechtitelského materiálu pro tvorbu nových odrůd sekundární SE pro rychlé namnožení vybraných genotypů vypracování metod selekce in vitro na buněčné úrovni a manipulace s protoplasty - odolnost chorobám, změna spektra mastných kyselin, barva osemení... možnost indukce vzniku mutantů a využití techniky TILLING fúze protoplastů a technika embryo-rescue - tvorba resyntetizované řepky možnost konstrukce zcela nových genotypů kulturních rostlin GMO technologie

3 Využití metod in vitro ve šlechtění řepky olejná je naší nejdůležitější olejninou, tento druh (resp. taxon, který se pěstuje jako olejnina - Brassica napus subsp. napus) je spontánním amfidiploidem, vzniklým na základě vzdálené hybridizace B. oleracea a B. campestris (B. rapa oleifera).

4 Využití metod in vitro ve šlechtění řepky B. napus (řepka, canola, tuřín) AACC 1200 Mb triangle of U Woo Jang-choon, 1935 (Nagaharu U) Morinaga (1934), U (1935) B. oleracea (brokolice, zelí, květák, růž. kapusta, kai-lan atd.) CC 650 Mb B. rapa (čínské zelí, vodnice atd.) AA 550 Mb B. carinata (brukev kýlnatá/ hořčice habešská) BBCC 1250 Mb B. nigra (brukev černá/ hořčice černá) BB 600 Mb B. juncea (brukev sítinovitá/ hořčice sareptská) AABB 1150 Mb

5 Využití metod in vitro ve šlechtění řepky Trendy ve šlechtění a šlechtitelské cíle: VÝNOS řepkového semene/oleje výnosová stabilita tolerance k abiotickým stresům (chladová/mrazová tolerance, suchovzdornost, využití živin - NUE) rezistence chorobám a škůdcům (Phoma, Cylindrosporium, Verticillium, Plasmodiophora, Sclerotinia) KVALITA oleje/pokrutin 00 kvalita (potravinářské využití oleje) bio-nafta, oleochemie odrůdy se specifickou skladbou MK (High oleic acid Holl, High erucic acid HEAR, HELP...) specifické využití v potravinářství zdravé potraviny (MK, protein), žlutosemennost

6 Význam řepky, šlechtitelské cíle: značný nárůst pěstování řepky a spotřeby/konzumace řepkového oleje v ČR/Evropě od 70. let 20. století

7 Využití metod in vitro ve šlechtění řepky Hlavní šlechtitelskou metodou je kombinační křížení a získání značně široké genetické variability - výběry, hodnocení... Nové 00 řepky mají většinou základ v liniovém šlechtění, tím dochází ale mnohdy k zúžení genetické základny odrůd a značná část výkonných odrůd je si dosti podobných Heterozní šlechtění nesmírně významný trend, produkce hybridů je založena na systémech samčí sterility a autoinkompatibility

8 Využití metod in vitro ve šlechtění řepky Z hlediska biologie kvetení patří B. napus k cizosprašným druhům, u současných odrůd ale většinou již převažuje podíl samosprašných typů. Nicméně jistou cizosprašnost a tím i přítomnost různých genotypů je třeba mít na zřeteli i při odvozování tkáňové kultury - protože mnohé jevy in vitro jsou genotypově podmíněné a ne všechny genotypy dané odrůdy reagují stejně.

9 Hybridní šlechtění: V současné době se pěstitelé řepky stávají svědky nádherného dobrodružství, počátku nové epochy v historii této kultury - zavádění hybridní řepky z laboratoří a pokusných políček na běžné plochy naší zemědělské praxe. P. Baranyk, 1996

10 Hybridní šlechtění: Počátky hybridního šlechtění a systémy používané pro tvorbu hybridů Ogu-INRA ( ) kompozitní hybridy 1994 (v ČR 1998) komplexní a tříliniové hybridy restaurované hybridy 2000 (v ČR 2003) MSL Lembke (1982) první hybridy v r (v ČR 1998) GMS SAFECROSS Syngenta 2007 (v ČR 2008) Prof. Fu Ting-Dong tříliniový hybrid na bázi AI hybrid na bázi Pol CMS 1985 (1972 objevena CMS Pol)

11 Hybridní šlechtění: Předpoklady pro úspěšné šlechtění hybridních odrůd... již na počátcích hybridního šlechtění jako klíčové body byly zmiňovány: existence stabilního genetického systému zabraňujícího samosprášení dostupnost elitních genotypů poskytujících vysokou heterozi účinný přenos pylu mezi rodiči v polních podmínkách Řada teoretických studií, vývoj strategií pro hybridní šlechtění, komerční ověřování produkce osiva v 80. a na počátku 90. let 20.stol.

12 Využití metod in vitro ve šlechtění řepky stabilizace a získání sterilních komponent systému Ogu-INRA = vzdálená hybridizace, fúze protoplastů, SE, resyntéza, embryo-rescue techniky

13 Využití metod in vitro ve šlechtění řepky Vzhledem k biologii kvetení, AI, určitému podílu cizosprašnosti, obtížně geneticky založené rezistenci vůči chorobám, problematické možnosti přenosu CMS lze mnohé cíle jen velmi těžko dosáhnout jen při využití klasických metod šlechtění. Biotehnoologické metody (jak KRE in vitro, tak i metody GI) by měly vhodným způsobem napomoci překonat tyto obtíže a pomoci urychlit a zkvalitnit šlechtitelský proces.

14 Využití metod in vitro ve šlechtění řepky Využití biotechnologických metod lze spatřovat v: rychlém namnožení materiálů cestou mikropropagece in vitro množení elitních rostlin - a získání geneticky uniformního potomstva, které může položit základ nové odrůdě - bez nebezpečí cizího sprášení při množení elitních rostlin nebo rodin, tvorba a množení materiálů pro syntetické odrůdy, množení linií - 00 řepky, množení materiálů pro testy rezistence

15 Využití metod in vitro ve šlechtění řepky získávání homozygotních linií cestou androgeneze in vitro jeví se jako velmi perspektivní metoda tvorby homozygotních linií, mnohem rychlejší než klasickou cestou samosprašování rostlin D.H. rostliny lze namnožit mikropropagací a využít v mutačním šlechtění, rezistentním šlechtění, nebo zařadit do klasikého výběrového postupu, resp. do fáze zkoušení a výběru nejvýkonnějších potomstev

16 Využití metod in vitro ve šlechtění řepky explantátové kultury řepky mají velkou perspektivu v oblasti mutačního šlechtění - relativně jednoduchá identifikace mutantů, možnost namnožení materiálů využití v rezistentním šlechtění - vytvoření selekčního systému in vitro - aplikace toxických látek (herbicidů, filtrátů Phoma, Sclerotinia, černí, plísní) - selekce buněk, které in vitro vykazují odolnost/zvýšenou toleranci problém bývá ale ten, že fenotypová proměnlivost indukovaná v in vitro kultuře je často nestabilní v dalších generacích a na úrovni celistvé rostliny se nemusí projevit

17 Genetický výzkum: TILLING reverzni genetika (od znameho genu k fenotypu)

18 Využití metod in vitro ve šlechtění řepky velmi perspektivní oblastí je využití metod GI u řepky - vnášení cizorodé DNA pomocí A.t. nebo přímo do protoplastů, - geny rezistence glyfosátu a dalším herbicidům, resistence hmyzím škůdcům (gen pro delta-endotoxin B.t.), změněná skladba aminokyselin v proteinu, změna skladby mastných kyselin v oleji

19 Mikropropagace in vitro První práce se týkaly rychého množení řepky pomocí internodálních řízků (růst in vitro - řízkování - kořenění na mediu - převod do půdy). V současné době se využívá regenerace rostlin z meristémů - nejarovizovaných apikálních nebo axilárních meristémů, převod do in vitro podmínek na MS médiu - regenerace rostlin, rostlinky s pak převádí na kořenící médium a do půdy.

20 Mikropropagace in vitro Regenerace rostlin cestou SE -rod Brassica je jeden z mála taxonů, kde se vyskytuje sekundární SE Sekundární somatická embrya (embryoidy) vznikají z epidermálních buněk hypokotylu, z buněk somatických embryí, květních primordií, zygotických embryí. Z % se vyvíjí v normální rostliny. Tuto metodu je možné využít k vegetativnímu množení žádoucích genotypů. Pokud se jedná o přímou SE, bez mezistádia kalusu, např. tvorba embryoidů na mladých hypokotylech nebo zygootických embryích, je zachována genetická identita a uniformita vzniklého potomstva. Zjištěná variabilita mezi regenerovanými rostlinami pak nepřevyšuje variabilitu při klonovém množení.

21 Kalusové a buněčné kultury, regenerace rostlin Při kultivaci kalusů dochází ke zvýšení genetické variability, uvažuje se o využití selekčně - mutačního systému in vitro. K odvození kalusů dochází z listových segmentů, stonků i meristémů, částí kořenů. Regenerace rostlin v kalusové kultuře může probíhat cestou organogeneze nebo SE. I v případě SE se v kalusové kultuře projevuje se větší úroveň genetické variability u regenerovaných rostlin - buňky, ze kterých se embryoidy vyvářely jsou značně heterogenním systémem. Projevují se cytologické, biochemické odchylky u regenerovaných rostlin, nárůst (širší) genetická a epigenetická variabilita.

22 Buněčné a protoplastové kultury Buněčné kultury: roztřepání kalusu v tekutém médiu, lze je použít v selekčním nebo mutačně-selekčním systému in vitro - nutné pro tento postup je ověřený a stabilní regenerační systém, jako nejvhodnější se jeví embryogenní genotyp - embryogenní kalus dává i stabilní embryogenní suspenzní kulturu schopnou regenerace. Protoplastové kultury: úroveň regenerace rostlin z protoplastů je velice nízká, lze provádět různé manipulace s protoplasty - tvorba syntetické řepky - fúze protoplastů původních druhů. Cytoplasmatická hybridizace - do cytoplasmy Raphanus se přenášejí jádra B. campestris, B. napus (přenos CMS).

23 Využití metod in vitro ve šlechtění řepky Embryokultury: opět využití k dopěstování hybridních embryí po vzdálené hybridizaci - B. napus x Raphanus sativus - přenos CMS, resyntéza řepky technika embryo rescue

24 Embryokultury a protoplastové kultury fúze protoplastů a tvorba resyntetizovaných genotypů embryo rescue dopěstování hybridních embryí pro vzdálené hybridizaci

25 Genetický výzkum: hexaploidní řepka Producing inter-specific hybrids between Brassica juncea (L.) Czern & Coss and B. oleracea (L.) to synthesize trigenomic (ABC) Brassica Successful induction of trigenomic hexaploids from triploid hybrid of Brassica napus L. and B. nigra (L.) Koch Breeding Super Brassica cultivars at hexaploid level

26 Androgeneze in vitro Pylová embryogeneze - vytváření haploidních embryí v prašníkové nebo mikrosporové kultuře. Prašníkové kultury jsou jednodušší, pro stimulaci tvorby embryí se využívá kultivace při vyšších teplotách (30-35 C), výběr embryogenních genotypů. Většinou jsou embryoidy - a posléze haploidní rostliny - získávány od jarních řepek, u ozimých je produkce haploidních embryí/rostlin nižší. Druhým způsobem získávání androgenetických haploidních (a po kolchicinaci diploidních - dihaploidních - double haploidních) linií je navození pylové embryogeneze v pylové kultuře, tj. kultuře mikrospor.

27 Androgeneze in vitro

28 Androgeneze in vitro

29 využití biotechnologií indukce tvorby haploidů a získávání dihaploidních rostlin

30 Regenerace in vitro - organogeneze

31 Regenerace in vitro - organogeneze

32 Regenerace in vitro - embryogeneze

33 Regenerace in vitro - embryogeneze

34 Regenerace in vitro embryogeneze a sekundární embryogeneze

35 Androgeneze in vitro Kultury mikrospor. Výhody této metody spočívají zejména ve zvýšení průměrného výnosu embryí/rostlin na prašník (u kultur prašníků 0-8 embryí na nasazený prašník a u kultur mikrospor na prašník), v odstranění interakcí prašníku s mikrosporou (pylovým zrnem), snížení pracnosti, odstranění nebezpečí regenerace rostlin z diploidních pletiv prašníku a nitky. I tak zůstává výtěžnost haploidních rostlin velmi malá - v prašníku je kolem mikrospor.

36 Androgeneze in vitro Kultury mikrospor. Kritickým faktorem ovlivňujícím produkci embryí je kromě genotypu zřejmě i počet prašníků/mikrospor v 1 ml média. Produkce haploidních embryí je závislá i na dalších faktorech - fyziologický stav rostliny, místo odběru prašníků, fáze zralosti pylu (střední až pozdní jednojaderná fáze), chladové předpůsobení. Optimalizací složení kultivačního média lze dosáhnout i masové tvorby sekundárních embryí - množení haploidní linie, regenerace rostlin ze získaných embryí je v % úspěšná.

37 Androgeneze in vitro Kultury mikrospor. Mikrospory lze i uchovávat - metoda kryoprezervace suspenze mikrospor - odstranění sezónnosti práce (pěstování rostlin ve skleníku, pozdní výsevy... a další způsoby roztažení pracovní špičky, kdy řepka kvete nevedou k úspěchu, v případě odběru prašníků v jinou dobu než je obvyklá doba kvetení slně snižuje schopnost regenerace). U regenerovaných rostlin se provádí cytologická kontrola počtu chromozómů - selekce na haploidní počet. Diploidizace haploidních rostlin - máčení mladých květních stonků v kolchicinu, injekce k vrcholovému meristému nyní byly tyto postupy nahrazeny používáním blokátorů tvorby achromatického vřeténka přímo do kultivačního media.

38 Androgeneze in vitro Kultury mikrospor.

39 Biotech canola, GM řepka