Rostlinné biotechnologie

Transkript

1 Fyziologie rostlin Letní semestr 2013 Rostlinné biotechnologie Lukáš Fischer

2 klasické šlechtění příprava geneticky modifikovaných rostlin příklady praktického využití GM rostlin využití GM rostlin v exp. biologii rostlin

3 Klasické šlechtění Princip a účel - získání - výběr rostlin s lepšími vlastnostmi (kombinacemi vlastností) - přenos vybraných genů/genotypů do dalších generací (x vazba) Předpoklad - variabilita (přirozená) v rámci druhu (spontánní mutageneze) Zvýšení variability: - indukovaná mutageneze (fyzikální, chemická) - bodové mutace, krátké delece - vzdálená hybridizace - přirozené či asistované mezidruhové či mezirodové křížení Pšenice x Triticale Žito Řepka olejka

4 Vzdálená hybridizace nutnost endoreduplikace (pro fertilitu) 1n = x = 4 1n = x = 7 x endoreduplikace (1n 2n) = zdvojení chromozómů bez rozdělení jádra (S-fáze buněčného cyklu bez následné mitózy) spontánní či indukované zdvojení chr. (endoreduplikace) 2n = 22 allopolyploidie Příklad spontánních allopolyploidních kříženců Brassica sp. Druh Česky Karyotyp Genom B. rapa Brukev řepák 2n = 20 A B. nigra B.černohořčice 2n = 16 B B.oleracea B. zelná 2n = 18 C B. juncea B. sítinovitá 2n = 36 AB B. napus B. řepka 2n = 38 AC B. carinata B. kýlnatá 2n = 34 BC

5 Pokročilé metody klasického šlechtění Somatická hybridizace (fúze protoplastů) - enzymatická degradace buněčné stěny (následná regenerace) - viabilita hybridů je omezená (klesá s fylogenetickou vzdáleností) - bez nutnosti endoreduplikace splynutí 2n protoplastů! Cybrid = cytoplasmatický hybrid (mitochondrie, plastidy) - rozdělení buňky bez splynutí jader či fúze s enukleovaným protoplastem - přenos mimojaderně podmíněné herbicidové rezistence či cytoplasmaticky (mitochondriálně) podmíněné samčí sterility (význam při produkci hybridního F1 osiva, )

6 Tvorba haploidních rostlin - přeprogramováním vývoje buněk samčího či samičího gametofytu in vitro netvoří se gamety, ale dochází k procesu analogickému embryogenezi (ale ne ze zygoty) - zpravidla z prašníkových kultur (nezralých mikrospor) = androgeneze - možno i ze samičího gametofytu = gynogeneze - haploidní rostliny jsou sterilní - spontánní či kolchicinem-indukovanou endoreduplikací vznikají dihaploidní (= kompletně homozygotní) rostliny! androgeneze (pylová embryogeneze) u řepky

7 Limitace klasického šlechtění - požadovaná vlastnost nemusí být v křížitelných druzích dostupná - ne vždy lze snadno sloučit dobré vlastnosti ze dvou jedinců (druhů) do jednoho, resp. oddělit dobré vlastnosti od špatných (např. odolnost vůči patogenu od špatné konzumní kvality plodiny) Příčiny omezené kombinovatelnosti: - geny podmiňující pozitivní a negativní znaky mohou být v genové vazbě (v extrému jde o různé projevy téhož genu) - u allopolyploidních hybridů jsou vlastnosti rodičů na nehomologních chromozómech (takové chromozómy od sebe nelze segregovat)

8 Využití genové vazby - MAS (Marker assisted selection) - využití molekulárních markerů ve vazbě s určitým znakem při šlechtění (marker nahrazuje či doplňuje fenotypový screening) molekulární marker - detekovatelný rozdíl (zpravidla) v sekvenci DNA (např. specifický produkt PCR) Výhody: - často jednodušší než fenotypový screening - možnost selekce už ve stádiu semenáčků - bez vlivu prostředí (!) - možnost (někdy) rozlišit homo- a heterozygoty podmínka: silná vazba markeru se znakem (aby přítomnost molekulárního markeru spolehlivě předpovídala fenotyp) Marker A Marker A 5 cm 5 cm 5 cm MarkerB Spolehlivost při selekci: S jedním markerem: 1 r A = ~95% Se dvěma markery: 1-2 r A r B = ~99.5%

9 Rostlinné kultury in vitro - kultivace na definovaných živných médiích ve sterilních podmínkách ve skle -často lze vypěstovat rostlinu z části listu, stonku či jiného orgánu, či dokonce pouze z jediné buňky

10 Zavedení in vitro kultury Primární explantát (část rostliny zaváděná do i.v.) - semenný materiál - vegetativní orgány (listy, stonky, hlízy, ) - prašníky (nezralá pylová zrna) Sterilizace - povrchové ošetření sterilizačním roztokem - přirozená sterilita (semena v semeníku, ) Složení média - anorganické složky - organický zdroj uhlíku - vitamíny - růstové regulátory!

11 Ozdravování Využití in vitro kultur - meristémové explantáty - viruprosté, bez endofytických baktérií (nejsou diferencována vodivá pletiva) Množení (mikropropagace) - organogeneze (kalus prýt rostlina) - somatická embryogeneze (somatické embryo rostlina) - semeny (orchideje) Genetické modifikace (!)

12 Příprava geneticky modifikovaných rostlin (GMR) klasická Vnesení (či vyjmutí) části genetické informace = úseku DNA - zpravidla (ne vždy) se jedná o vnesení kódující sekvence genu - pro expresi genu (= tvorbu funkčního proteinu) v jiném organismu jsou nutné regulační sekvence, které jsou rozpoznány transkripčním a translačním aparátem v organismu příjemce - jinak není přenos genů teoreticky limitován díky univerzálnosti genetického kódu transgenní organismy (obecné označení GMO či GMO s DNA ze vzdáleného organismu) cisgenní organismy (GMO s DNA z téhož či křížitelného příbuzného druhu)

13 Transformace = genetická modifikace Stabilní - dochází k integraci do genomu = dědičná změna genetické výbavy Transientní - nedochází k integraci vnesené DNA do genomové DNA - vnesený gen se nereplikuje, až posléze vymizí - vnesený gen je ale zpravidla exprimován

14 Exprese genu: 1. krok - transkripce (tvorba mrna) Transkripční faktor vlastní gen TERMINÁTOR transkripce = polya signál PROMOTOR - určuje začátek a směr transkripce - váže transkripční faktory - konstitutivní x inducibilní promotory - původ: rostlinné, či z rostlinných patogenů (virů, agrobaktéria)

15 Transkripce Transkripční faktor RNA polymeráza mrna polya PROMOTOR TERMINÁTOR transkripce = polya signál Schopnost promotoru vázat určité transkripční faktory a přítomnost či nepřítomnost těchto faktorů v buňce spoluurčují, kde a kdy bude gen transkribován

16 Exprese genu: 2. krok translace = syntéza proteinu ATG terminační kodón mrna kódující sekvence - některé skupiny organismů nevyužívají stejně často všechny kodóny - sekvence před iniciačním kodónem je důležitá pro efektivní translaci (nasedání ribozómu) (změny v sekvenci např. cílenou mutagenezí pomocí PCR)

17 Faktory ovlivňující expresi transgenu - promotor, terminátor, okolí ATG, introny, obsah CG - počet kopií transgenu v genomu, jejich vzájemná poloha - místo integrace (náhodné: enhancery, SAR, MAR, stav chromatinu hetero- x euchromatin, )

18 Princip přípravy transgenních rostlin 1. Na začátku je vždy jen jedna transformovaná buňka! (nelze transformovat všechny buňky rostliny naráz) 2. Pomnožení transformovaných buněk na selekčním médiu (!) 3. Indukce organogeneze či somatické embryogeneze (aplikací vhodných regulátorů rostlinného růstu v in vitro podmínkách) vnesení genu selekce organogeneze transformovaná buňka embryogeneze transformovaný kalus či somatické embryo

19 Metody vnášení DNA do rostlinných buněk prostřednictvím agrobaktéria biolistické metody gene gun transformace protoplastů (PEG, elektroporace), mikroinjekce,.

20 Přirozená transformace pomocí agrobaktéria (Agrobacterium tumefaciens) půdní baktérie genetický parazitismus na dvouděložných rostlinách (pro transformaci jednoděložných rostlin je nutné agrobaktérium indukovat ke konjugaci) přenáší několik svých genů do poraněné rostlinné buňky z transformované buňky se tvoří nádor, který produkuje výživné látky (opiny) pro agrobaktérium

21 Přirozená transformace agrobaktériem Úsek plasmidové DNA agrobaktéria (T-DNA) je vnesen do rostlinné buňky, v důsledku exprese vnesených genů se buňka nekontrolovaně dělí za vzniku nádoru (v T-DNA jsou geny enzymů syntézy fytohormonů auxinů a cytokininů)

22 Ochočené (podvedené) agrobaktérium - geny způsobující vznik nádoru a syntézu opinů byly vyměněny za geny našeho zájmu - T-DNA v binárním plasmidu (vir geny, zodpovědné za přenos T- DNA alokovány na druhém plasmidu in trans) využívá se pouze schopnosti agrobaktéria přenášet T-DNA (definovanou pouze krátkými hraničními sekvencemi) do genomu rostlinných buněk

23 Transformace bramboru pomocí agrobaktéria - kokultivace agrobaktérium kokultivace s poraněnými listy vstup agrobaktéria do pletiva v místě poranění

24 Tvorba kalusu a organogeneze 3-4 týdny po transformaci 5-6 týdnů po transformaci

25 Transformace Arabidopsis thaliana pomocí agrobaktéria Ponoření květenství s poupaty do suspenze agrobaktéria

26 Transformace Arabidopsis thaliana pomocí agrobaktéria - cílem transformace je zřejmě vajíčko, z něj se po oplození tvoří transformovaná embrya (semena) a následně rostliny (modře zbarvený produkt enzymové aktivity glukuronidázy, která byla použita jako reportérový gen) pro visualizaci transformovaných vajíček

27 Biolistická (balistická) metoda transformace (Partickle gun, Gene gun) nabalení DNA na zlaté či wolframové kuličky nastřelení na rostlinný orgán, celé rostliny, buněčnou kulturu,... další kroky pro získání transformovaných rostlin podobné jako po transformaci agrobaktériem univerzální použitelnost bez druhových limitací možnost transformace organel (plastidů)

28 Biolistická metoda transformace - nastřelování pomocí přetlaku či podtlaku

29 Umlčování exprese transgenů - vnesené geny bývají často spontánně umlčovány (transkripčně či posttranskripčně) = blokování tvorby příslušného proteinu TGS = Transcriptional Gene Silencing - gen není přepisován - metylace DNA (promotoru) - tvorba heterochromatinu (zamezení přístupu TF) - může být sekvenčně specifické pomocí malých RNA PTGS = PostTranscriptional Gene Silencing - gen je přepisován - transkript není překládán do proteinu - transkript je degradován či je blokována jeho translace - sekvenčně specifické prostřednictvím malých RNA

30 Tvorba a úloha malých RNA? dsrna Jakákoli dsrna v buňce je štěpena enzymem DCL (DICER-like) na krátké dsrna fragmenty nt sirna/mirna Jedno z vláken malé RNA v komplexu s proteinem Argonaut zprostředkuje rozpoznání dalších RNA (na základě komplementarity)

31 Mechanismus účinku malých RNA - specifická degradace transkriptu, komplex RISC (PTGS) - zablokování translace (především mirna, PTGS) - metylace DNA, tvorba heterochromatinu (metylace promotoru = TGS)

32 Šíření umlčujícího signálu rostlinou - symplasticky (plasmodesmy a floémem) - prostřednictvím malých RNA systémová rezistence umlčování exprese GFP podél cévních svazků

33 Možnosti využití RNAi pro epigenetickou modifikaci (ne GM) - inaktivace genu v roubu na GM podnoži produkující malé RNA cílené proti promotoru vybraného genu - infekce modifikovaným virem indukujícím vznik malých RNA proti promotoru vybraného genu, následné odléčení viru Navozená epigenetická změna (= umlčení exprese genu) je často stabilně předávána do potomstva (prostřednictvím modikací chromatinu: metylace cytosinů a specifických cysteinů na histonu H3)

34 Cílená modifikace genů cílené vytvoření dvouvláknového zlomu Štěpení fúzním proteinem - nukleázová doména restriktázy Fok I + - Zn-finger DNA vazebné domény (ZNF nucleases) - DNA vazebná doména transcription activator-like effektorů baktérií rodu Xanthomonas (TAL effector nucleases - TALEN) - reparace (často s lokální delecí = inaktivace) či vnesenými ssdna oligonukleotidy řízená přesná mutageneze alternativně (při současné transformaci) zvýšení integrace transgenu do místa zlomu

35 př. Zn-finger domény sekvenčně specifické rozpoznání DNA: 3(-4) nt/finger - vyznačené konzervované amk - černá kolečka amk interagující s DNA - místně specifické štěpení - využití k cílené modifikaci DNA (integraci transgenu)

36 Praktické využití GM rostlin příklady GM rostlin již pěstovaných či připravovaných - rostliny se zvýšenou odolností vůči: - hmyzím škůdcům (Bt toxin) - herbicidům (Roundup) - virům, hlístům, houbám,bakteriím - abiotickým stresům (sucho, mráz, zasolení) - rostliny se zvýšenou produkcí - plody s prodlouženou trvanlivostí či skladovatelností

37 - plodiny s vylepšenými vlastnostmi, složením, - oleje (vyšší obsah nenasycených mastných kyselin, ) - fruktany, modifikovaný škrob - změny v aminokyselinovém složení (Met, Cys) - zdravější (syntéza karotenu v rýži) - zvýšení obsahu vlákniny - zvýšení stravitelnosti - plodiny s odstraněnými alergeny - jedlé vakcíny (vakcinace na sliznicích při požití)

38 Strategie při přípravě GMR Jak geneticky podmínit různé vlastnosti? Jeden gen jeden výkonný protein: - produkce rekombinantních proteinů (např. pro medicínské účely) - antigenu - jedlá vakcína - navození odolnosti (Bt toxin) - odolnost x herbicidům degradační enzym či necitlivý isozym - zásobní protein (zvýšený obsah esenciálních amk) Ovlivnění hladiny TF či syntézy určitého fytohormonu: - zvýšení odolnosti vůči stresu - zvýšení obsahu určitých metabolitů Více genů - ovlivnění celých biosyntetických drah: - zvýšený obsah určitých metabolitů (ß-karoten) Antisense RNA (RNAi): - snížení obsahu určitého metabolitu (blokování enzymu syntézy) - snížení obsahu alergenního proteinu - prodloužení trvanlivosti antisense PG

39

40

41

42

43 1. USA - 70 mil ha 2. Brazílie Argentina Kanada Indie - 11

44 Odolnost vůči hmyzím škůdcům: Bt toxin toxin baktérie Bacillus thuringiensis (Bt) - insekticidní účinky (na různé čeledi hmyzu) asi 40 typů - ve formě protoxinu (delta endotoxin), který je štěpen v trávicím ústrojí hmyzu - proteázovou aktivitou a alkalickým ph jako biopesticid používán od 60. let zejména bavlník a kukuřice x zavíječi

45 Bt toxin Výhody: - méně insekticidů - zvýšení biodiverzity - zvýšení výnosu - zdravější potraviny (kukuřice, méně sekundárních houbových infekcí a toxinů) Rizika: - pojídání vyprášeného pylu housenkami vzácných motýlů (monarchů) na okolních porostech (prokázáno jen laboratorně) - vytvoření rezistence u škůdce - ponechání refúgií s netransformovanou plodinou

46 Rezistence k herbicidům - syntéza enzymu se stejnou aktivitou, ale necitlivého k herbicidu (např. záměnou 2 aminokyselin) - přímé odbourávání herbicidu v rostlině - glyphosate + glyphosate Výhody: - méně herbicidů (???) - šetrnější, biodegradovatelné látky! - možné použít kdykoli (až když je potřeba) Rizika: - omezení biodiverzity krajiny (!) - spojená s akumulací herbicidu (bezpečné)

47 Rajčata s prodlouženou trvanlivostí Flavr Savr Wild-type fruit PG activity Antisense PG fruit Days from 1st colour change PG = polygalakturonáza Snížení hladiny PG expresí téhož genu v antisense orientaci

48 Zlatá rýže Golden rice vitamin A = retinol (v játrech, mléku, vejcích, ) v některých rostlinách prekurzor - ß-karoten v rozvojových zemích je deficiencience vit. A velkým problémem slepota (xerophthalmie) dětí ročně oslepne nižší účinnost imunitního systému - volná distribuce zemědělcům

49 Zlatá rýže - exprese genů celé metabolické dráhy v endospermu rýže GGPP + GGPP (geranyl geranyl difosfát) fytoen syntasa (1) Zdroje genů: - kukuřice (původně narciska) fytoen lycopen fytoen desaturasa (2) lycopen beta-cyklasa (3) - baktérie (Erwinia uredovora) - narciska ß-karoten (provitamín A)

50 Jedlé vakcíny nebo - transgenní rostliny mohou produkovat antigeny patogenů (např. žloutenky typu B), kterými mohou být při požití imunizováni živočichové úspěšně testováno na myších i lidech plodiny využitelné jako jedlé vakcíny: ovoce a zelenina (poživatelná bez tepelné úpravy)

51 Rizika spojená s GM rostlinami porovnání klasického šlechtění a genetické modifikace Klasické šlechtění Genetické modifikace - silná mutageneze - vzdálená hybridizace - mnoho neznámých změn - pomalý proces - přenos několika přesně definovaných a dobře prozkoumaných genů (na předem neznámá místa genomu ) - důkladný schvalovací proces - relativně rychlé

52 Rizika spojená s GM rostlinami porovnání klasického šlechtění a genetické modifikace

53 Rizika spojená s GM rostlinami Zdravotní rizika pro člověka NE - přenos genů na člověka - vznik rezistentních bakterií Potenciální rizika: - při vnesení genu pro alergenní protein - aktivace endogenních toxinů či alergenů rostlin ALE důkladnější systém kontrol než u klasického šlechtění - i v zájmu producentů Ekologická rizika Bt toxin (necílové organismy např. Monarchové) vznik rezistence Rezistence k herbicidům - horizontální přenos - biodiverzita - potravní řetězce

54 Význam GM rostlin pro výzkum

55 Hledání a izolace genů na základě fenotypového projevu v důsledku začlenění cizorodého úseku DNA do náhodného místa genomu se může změnit fenotyp rostlin - inzerční mutageneze inaktivace genu v důsledku začlenění vnášené DNA - aktivační mutageneze transformace promotorem či enhancerem, které mohou v místě začlenění aktivovat expresi jinak neaktivního genu

56 A nebo naopak = reverzní genetika : Studium funkce vybraných proteinů (genů) zvýšením či snížením jejich exprese - vnesení genu pod kontrolou silného promotoru - vypnutí - navození RNA interference antisense RNA tří genů syntézy sacharózy

57 Výběr rostlin s inzercí v určitém genu - veřejně dostupné kolekce mutantů ve většině genů modelové rostliny Arabidopsis thaliana - snadné získání semen rostlin s inzercí v určitém genu Gen1 Gen2 Gen = číslo linie místa inzerce vnášené DNA v jednotlivých mutantních liniích (znalost sekvence vnášené DNA dovoluje snadné určení místa inzerce)

58 Fúze promotoru studovaného genu s reportérovým genem (glukuronidáza, GFP) reportérový gen P gen T - transkripční fúze - hledání místa exprese genu na úrovni pletiv a orgánů Arabidopsis thaliana Nelze měnit v genomu, vkládá se další kopie genu

59 Tvorba fúzního proteinu s GFP Zrušení stop kodónu studovaného genu a připojení GFP genu ve čtecí fázi

60 Tvorba fúzního proteinu s GFP - studium lokalizace proteinů, proteinových interakcí, - sledování různých pochodů v živé buňce značení buněčných struktur Golgiho komplex chromozómy mikrotubuly

61

62 Měl Mendel štěstí? - žádné dva ze sledovaných znaků nebyly podmíněny geny ležícími na stejném chromosómu (nebyly v genové vazbě) Tedy štěpné poměry v F2 generaci byly 9:3:3:1

63 Segregace v F2 P=XXyy (Xy) x xxyy (xy), F1 = XxYy (XY) četnost gamet dle vazby gamety XY (0.5) Xy xy xy (0.5) XY (0.5) XXYY XY (0.25) XXYy XY (0.5) XxYY XY (0.5) XxYy XY (0.25) Xy XXYy XY (0.5) XXyy Xy XxYy XY Xxyy Xy (0.5) = genotyp fenotyp xy XxYY XY (0.5) XxYy XY xxyy xy xxyy xy (0.5) xy (0.5) XxYy XY (0.25) Xxyy Xy (0. 5) xxyy xy (0. 5) xxyy xy (0.25) Štepení fenotypových kategorií v F2 generaci (XY:Xy:xY:xy): na různých chromozómech: 9:3:3:1 4,75:2:2:0, % xy 2.8 % xy ve vazbě 50 cm: (= 50 % rekombinovaných gamet)

64 Schéma transformace a organogeneze z kalusu Transformace a přenesení na selekční médium indukující tvorbu kalusu Transformovaná buňka Transformovaný kalus Přenesení na médium indukující tvorbu výhonů Transformované výhony Přenesení na médium indukující tvorbu kořenů Převedení rostlin do půdy