inženýrství rostlin U3V

Transkript

1 BIOTECHNOLOGIE a genové inženýrství rostlin U3V Zdeněk OPATRNÝ Katedra experimentální biologie rostlin, Přírodovědecká fakulta UK Praha Letní semestr 2014

2 Teoretické a metodické základy biotechnologického zemědělství - experimentální průkaz hypotézy o funkční totipotenci somatické rostlinné buňky - vývoj technik in vitro kultivace rostliných explantátů - vývoj technik parasexuálního genového přenosu

3 Na počátku bylo slovo aneb buněčná teorie o funkční totipotenci somatických buněk mnohabuněčných organizmů SCHLEIDEN 1838 rostliny SCHWANN 1839 převzal pro živočichy

4 Gottlieb HABERLANDT otec oboru in vitro kultivace rostlinných buněk, pletiv a orgánů realizátor prvých pokusů sběratel prvých zklamání

5 P.R.WHITE bez hormonů to nejde buď vlastní kořenové kultury rajče 1935 hybridi N.glauca x N.langsdorfii, kalus 1938 nebo nutno přidat IAA Gautheret, Noubécourt 1938 dalších dvacet práce jen s auxiny a rostlinnými extrakty či tekutými endospermy

6 České biotechnologie a svět 1 - Petrů, 2 - Street, 3 - Karstens, 4 - Vasil, 5 Reinert (Pensylvania State University 1963)

7 Zřejmě první rostlinně-biotechnologická disertace v Československu Ústav experimentální botaniky ČSAV Praha 1971 To máme téměř 40 let

8 Explantátově metodický dávnověk vesměs vlastní konstrukce

9 TREPKA (Vicia faba L.) Ještě dodnes vlastně unikát kalusové a suspensní kultury Vicia faba 1967 dvouletá tkáňová kultura

10 Od buňky k rostlině či od buňky k buněčné linii a zpět?? brambor tabák buněčná linie tabáku VBI- 0 Opatrný a Opatrná 1976

11 Mutageneze in vitro vliv gama záření na buněčnou linii tabáku VBI-0 vliv N-nitrosometyl močoviny na primární dřeňové explantáty tabáku

12 Explantátové laboratoře Ústav experimentální botaniky AVČR Praha únor 2014

13

14

15

16

17

18

19

20 Objev cytokininů a jejich interakcí s auxiny zásadní rozšíření regenerační kuchařky pro rostlinně biotechnologické využití Ale také zásadní přínos pro obecné studium biologie rostlin od ONTOGENEZE po FOTOSYNTÉZU

21 Buněčná teorie po 100 letech experimentálně potvrzena

22 Folke SKOOG od kokosového mléka po sledí jikry CYTOKININY

23 ORGANOGENEZE AUXIN : CK kořeny AUXIN : CK kalus AUXIN : CK pupeny Skoog a Miller (1965): poměr auxinů a cytokininů určuje morfogenní odpověď

24 Příběh podobný objevu penicilinu náhoda přeje připraveným

25 Regenerace de novo organogeneze Nicotiana tabacum L. odrůdová specifita

26 Následuje rychlý rozvoj aplikací: - explantátové ozdravování - explantátové množení - explantátové šlechtění

27 Zdeněk Landa

28 EXPLANTÁTOVÉ OZDRAVOVÁNÍ (eradikace): prof. Morrel (Francie) 60-tá léta shoot tip cultures jiřiny, brambor izolovaný meristem uniká virové infekci thermoinkubace, RIBAVIRIN bezvirozní satba vegetativně množených plodin v ČR ovocné dřeviny,brambor

29 EXPLANTÁTOVÉ MNOŽENÍ (mikropropagace) základem jsou regenerační protokoly: - organogeneze - somatické a pylové embryogeneze

30 ORGANOGENEZE in vitro Restituce in vitro protokormy Cymbidium Multiplikace preexistujících vzrostných vrcholů Medium jen s auxinem (2,4-D) nebo auxin + cytokinin

31 REGENERACE de novo Stonkový řízek (5mm) bramboru, půda A+CK zřetelná polarita reakce, preferenčně regeneruje baze

32 Protokol regeneračního postupu

33 Odrůdová specifita regenerační kompetence

34 Regenerující pupenové základy brambor

35 DE NOVO regenerace bramboru : možnost vniku žádoucí i nechtěné somaklonální variability 4 týdny 8 týdnů

36 Příčiny vzniku somaklonální variability : spontánní či in vitro kultivací vyvolaná mutageneze a selekce * šance pro šlechtění zejména vegetativně množených plodin? * možnost kvalitativně nových typů genetických odchylek (somatický crossingover aj.)?? Dvacet let práce a nadějí žádný zásadně nový přínos (snad u třtiny cukrové, ananasů) Aplikace mutagenů (šlechtění banánů??)

37 Mikropropagace bramboru somaklony mikrohlízky

38 EMBRYOGENEZE in vitro: * zygotická (zejm. oplození in vitro) * pylová * somatická účel: - překonání bariér nekřižitelnosti - produkce haploidů/dihaploidů - mikropropagace - umělá semena

39 Somatická embryogeneze (SE) od mrkve přes pšenici po smrk * 2,4-D klíčový morfogenní faktor, součinnost s CK, ABA * rychle stoupá počet druhů vykazujících schopnost SE * poměrně nízký výskyt genotypů realizujících jak organogenezi tak i SE. Některé klasické regenerační modely (tabák, brambor) v realizaci SE neúspěšné. * často striktní limit regenerační kompetence souvisí s orgánovou specifitou, stářím

40 Somatická embryogeneze Larix decidua, agarové medium katalog firmy

41 Somatická embryogeneze Picea abies regenerační specifita různých klonů AFO C 111 Vágner, Vondráková, Opatrná 1998

42

43 Schwarzerová et al submitted BMC PB úloha aktinového cytoskeletu v somatické embryogenezi smrku vliv antiaktinových drog

44 Somaticko - embryogenní linie vinné révy Exot nebo budoucnost šlechtění?

45 Grape Line PIXIE Trpasličí, stále plodící mutant vinné révy?? Produkt somaklonální variability v embryogenní kultuře?

46 Somatická embryogeneze Cucumis sativus, tekuté medium katalog firmy

47 ARTICIFIAL SEEDS mrkev modřín

48 Drum Type Automatic Bioreactor, working volume 5000L each, (Republic of South Korea)

49 SERK geny v somatické embryogenezi bramboru?

50 DIHAPLOIDNÍ ŠLECHTĚNÍ regenerace nových jedinců z buněk zárodečné linie : alternativní cesty embryogeneze samičí (různé typy apomixe), samčí

51 Alternativní cesty embryogeneze samičí (různé typy apomixe), Domain: Food & Agriculture The Biological Function of Organisms Human Nutrition and Food Chain Agriculture as a Human Activity Agriculture and Environment

52 Pylová embryogeneze (PE) od durmanu, tabáku po křížaté či obiloviny * přítomnost fytohormonů často není nutná, * vysoce autonomní proces (u tabáku pro úvodní fázi stačí agar, voda, později Fe, Havránek, Vagera 1975) * stres jako indukční faktor * významná role genotypu * klíčový význam má vývojové stadium mikrospor

53 Prašníkové kultury tabák Opatrný et al. 1974

54 Mikrosporové kultury řepka izolace pylových zrn různého vývojového stupně Opatrný et al. 1985

55

56 útvar má dočasně charakter syncytia, přepážky nedokončeny

57 Pozdní fáze pylové embryogeneze: tvorba peridermu dermatogenové stadium? řepka šikmé světlo různé optické roviny Opatrný 1985 pracovní protokol

58

59 PROTOPLASTOVÉ KULTURY a somatická hybridizace cybridizace překonání bariér nekřižitelnosti

60 Od Purkyně-ho ke Cockingovi: protoplasty = rostlinné buňky dočasně zbavené buněčné stěny Cocking umožnily : - tvorbu somatických hybridů - přenášení genoforů (organel) - vnášení samotné cizorodé DNA (jedna z technik přípravy GMO) Lorz Melchers

61 Protoplastová kultura česnek brambor inokulum inokulum 3. den 3. den Opatrný et al. 1976

62 Protoplast - cytoplast fuze Brassica oleracea.

63 TOMOFFEL / POMATO, Melchers 1982

64 Somatičtí hybridi kulturního bramboru a planých lilků přenos resistence vůči patogenům, zejména virům

65 Somatická hybridizace N.plumbaginifolia x N. sylvestris chromosomální přestavby výrazně odlišných genomů

66 Indikace chromosomálních přestaveb somatických hybridů pomocí techniky GISH

67 Asymetrické hybridizace MUTABREEDS a genové přenosy jako nástroj a genové přenosy jako nástroj inzerční mutageneze.

68 Sem stručně obsah článku!!! Supertuberizing insertion mutant D 69 / Lada Transgene : enhancer Insertion: non-coding area Fischer, Lipavska Opatrny, 2010

69 Czech Presidency of EU AIM: to affect existing rigid European biotechnological legislative by official document based mostly on the authentic results of the Czech research Academy of Science Universities Agricultural Research Institutes Agricultural Cooperatives Research,Education, Dissemination

70