3 CHROMATOGRAFIE V ANALÝZE PALIV Kapalinová chromatografie

Transkript

1 Obsah 3 Chromatografie v analýze paliv Kapalinová chromatografie Princip kapalinové chromatografie Přístrojové vybavení v kapalinové chromatografii Uspořádání mobilní a stacionární fáze v kapalinové chromatografii Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Aplikace kapalinové chromatografie v analýze paliv Literatura... 34

2 1 2 3 CHROMATOGRAFIE V ANALÝZE PALIV Kapalinová chromatografie Princip kapalinové chromatografie Kapalinová chromatografie přichází ke slovu často tam, kde již plynová chromatografie neposkytne dostatečné výsledky. V porovnání s plynovou chromatografií síla kapalinové chromatografie tkví především v její schopnosti rozpouštět vzorky včetně vzorků, které nelze převést do plynné fáze analyzovatelné plynovou chromatografií. Díky tomu lze analyzovat i těžké ropné frakce, které jsou pro plynovou chromatografii nepřekonatelným problémem. Na druhou stranu míra rozdělení dosažitelná pomocí kapalinové chromatografie je nižší než u chromatografie plynové. Účinnost dělení souvisí s počtem teoretických pater, který nedosahuje takových úrovní jako u plynové chromatografie. Uspořádání kapalinové chromatografie se dělí podle skupenství mobilní a stacionární fáze. Rozdělení, včetně používaných zkratek pro jednotlivé kombinace jsou popsána ve skriptech Analytické chemie [1] na straně 135. Tamtéž jsou popsány interakce mezi stacionární fází a analytem. Kapalinová chromatografie má v analýze paliv dvě hlavní skupiny využití, které se od sebe liší hlavně množstvím analyzovaného vzorku. Analytické využití První skupinou je analytické využití, při kterém jsou analyzovány mg vzorku. Příklady technik využívaných pro analytické účely jsou uvedeny dále. Pro detailní analýzu vzorku, která dá informaci o látkách nacházejících se ve vzorku lze použít například HPLC. Pro skupinovou analýzu, která dává informaci o skupinách sloučenin se stejnými vlastnostmi lze použít HPLC nebo LSC. Pro získání finger printu neboli otisku prstu lze použít HPLC nebo GPC. Pro stanovení distribuce molekulových hmotností vzorku lze využít GPC. Preparativní využití Druhou skupinou jsou metody pro preparativní využití. Pro separaci jsou používány desetiny až desítky gramů vzorku a výsledkem jsou získané skupiny látek oddělených na základě svých interakcí se stacionární fází. Pro předseparaci vzorku lze použít LSC, HPLC nebo GPC. Pro zkoncentrování vzorku pro účely jeho další analýzy se používají LSC, HPLC nebo SFE. 2

3 3.3.2 Přístrojové vybavení v kapalinové chromatografii Uspořádání chromatografů je do značné míry modulární. Musí být zachováno základní schéma chromatografu, ale jednotlivé části se liší podle konkrétních požadavků na provedenou separaci. Zde budou uvedeny jednotlivé části, ze kterých se může chromatograf skládat s konkrétními příklady, jak mohou být realizovány. Zdroj tlakového gradientu Zdroj tlakového gradientu zajišťuje pohyb mobilní fáze přes fázi stacionární a kompenzuje tlakovou ztrátu. Pokud by nebyl tlakový gradient dostatečně silný, mobilní fáze by se nemohla pohybovat a k separaci by nedošlo. Jako zdroj tlakového gradientu mohou sloužit různé typy čerpadel, například čerpadla výtlačná (lineární dávkovač) nebo průtočná (pístové čerpadlo). Výhodou výtlačných čerpadel je plynulý průtok mobilní fáze bez pulzů, nevýhodou je omezená kapacita mobilní fáze daná vnitřním objemem zásobníku a nemožnost jednoduché výměny nebo doplnění mobilní fáze bez přerušení jejího toku. Výhodou průtočných čerpadel je neomezená kapacita mobilní fáze a její průběžná změna během separace. Nevýhodou jsou tlakové pulzy způsobované činností pístů. Tyto pulzy lze u lepších čerpadel tlumit, ale nedaří se je zcela odstranit. Dále lze využít gravitace, kdy mobilní fáze protéká samovolně kolonou jen působením vlastní váhy. Výhodou tohoto způsobu je jednoduchá instrumentace, kdy jako zásobník může sloužit například jen rozšířená část kolony. Nevýhodou je nízký výsledný tlak, který není dostačující pro velké sloupce sorbentu nebo sorbenty s malým zrněním a vysokou účinností dělení a také jen minimální možnost ovlivnit hodnotu průtoku. Jednou z možností je natlakování zásobníku mobilní fáze pomocným plynem, který bude vytlačovat mobilní fázi do kolony. Takto lze zvýšit průtok mobilní fáze, ale možnost regulace je jen velmi omezená. Dávkovač vzorku Dávkovač vzorku slouží pro zavedení vzorku na stacionární fázi. Vzorek může být naředěn ve vhodném rozpouštědle (nejčastěji v mobilní fázi) nebo může být dávkován bez naředění. Nejčastěji se manipulace se vzorkem odehrává pomocí stříkačky vhodného objemu. Stříkačkou lze vzorek nastříknout na povrch sorbentu v otevřené koloně nebo na povrch desky v tenkovrstvé chromatografii nebo do nástřikového členu ve vysokotlakých aplikacích. Další možností jak dostat vzorek na stacionární fázi je jeho načerpání pomocí čerpadla do uzavřené kolony. V tomto případě se stejné čerpadlo obvykle používá pro čerpání mobilní fáze. Zde hrozí riziko u viskózních vzorků, které mohou způsobit nedovírání ventilů čerpadla a tím ovlivnit průtok mobilní fáze nebo dokonce vyřadit píst z činnosti. Aby se předešlo této možné komplikaci, používá se někdy mezi čerpadlem a uzavřenou kolonou vložený nástřikový člen. Nástřikový člen kombinuje ventil a nástřikovou smyčku. Ventil je obvykle vícecestný a dvoupolohový. Do smyčky se vzorek dostává buď manuálně, nebo automaticky (v automatickém dávkovači) pomocí stříkačky. Smyčka může být naplněna úplně nebo částečně, přičemž při částečném naplnění je zbylý objem smyčky vyplněn mobilní fází. Vzduch se do kolony nemá dostat. Po naplnění smyčky se ventil přepne do nástřikové pozice, ve které mobilní fáze protéká smyčkou a unáší vzorek do kolony. 3

4 Kolona Pod pojmem kolona se obvykle myslí trubicové těleso naplněné stacionární fází, ve kterém probíhá separace. V případě kapalinové chromatografie to také většinou platí, ale kromě tohoto uspořádání je také možné jiné uspořádání, ve kterém je stacionární fáze nanesena na povrch vhodné nosné struktury a následně separace probíhá v tenké vrstvě. Trubkové kolony jsou nejčastěji vyráběny z odolného, chemicky inertního materiálu. Pro nízkotlaké aplikace se běžně používá sklo, pro vysokotlaké aplikace je častější nerezová ocel. Do kolon se plní stacionární fáze popsané v kapitole Pro tenkovrstvé uspořádání se jako nosné struktury používají desky z hliníku nebo křemenné tyčinky. Kolonový termostat Kolony v kapalinové chromatografii mohou, ale nemusí být umístěny v termostatu. Termostat je zařízení, které má za úkol udržovat svůj obsah při nastavené teplotě. Termostat musí umět udržet teplotu nad i pod úrovní teploty okolí. Ohřev se provádí obvykle elektricky odporovým topením, pro chlazení se využívají nejčastěji Peltierovy články. V případě nízkotlakých aplikací, kdy je nutno zachovat přístup ke koloně i během separace se kolona opatřuje temperačním pláštěm připojeným k externímu ohřevu nebo chlazení a jako temperační médium slouží voda nebo ethanol pro teploty nižší než 0 C. Při kapalinové chromatografie nemá teplota zásadní vliv na účinnost separace, ale může pomoci v případě viskózních vzorků, u kterých vyšší teplota sníží viskozitu a usnadní separaci. Další důvod pro použití zvýšené teploty může být přítomnost vysokomolekulárních n-alkanů, které se špatně rozpouští v mobilních fázích a mají špatnou mobilitu během pohybu kolonou. Zvýšení teploty v tomto případě pomáhá zvýšit jejich mobilitu a mohou tak eluovat se skupinou nasycených uhlovodíků. Příkladem využití snížené teploty ve srovnání s okolím je používání nízkovroucích mobilních fází jako je například pentan či diethylether, která zvláště v letních měsících mohou výrazně těkat a v koloně vytvářet bubliny parní fáze. To se negativně projevuje na účinnosti dělení a může to zcela znehodnotit výsledky separace. Jako důležitá část chromatografického systému je termostat v případě jeho použití v HPLC chromatografii, pokud za kolonou následuje refraktometrický detektor, který je citlivý na změny teplot mobilní fáze. Spojovací kapiláry Pro propojení jednotlivých prvků chromatografu ve vysokotlakých aplikacích slouží tlustostěnné kapiláry. Tlustá stěna kapilár plní dvojí funkci. První a nejdůležitější funkcí je udržení tlaku v celém systému, kdy silná stěna umožňuje dosáhnout vysokých tlaků před vstupem do kolony. Druhou funkcí je udržení minimálního objemu mobilní fáze v systému. Kapiláry jsou vyráběny z mechanicky pevných a chemicky odolných materiálů. Nejčastějšími materiály jsou teflon, PEEK (polyetereterketon) a nerezová ocel. Teflon je ve srovnání s ostatními materiály poměrně měkký, takže i přes jeho inertnost není zcela vhodný pro vysoké tlaky. Nerezová ocel je vhodný materiál v případě, že není třeba často měnit propojení. Její výhodou je udržení nastaveného tvaru kapiláry, ale nevýhodou je zakusování ferulí, které již není možné znovu použít ani sundat bez destrukce. PEEK je výhodný díky své znovu použitelnosti, ale kapiláry z něj vyrobené nedrží tvar. 4

5 Detektory Fluorescenční detektor (FLU) Pracuje na principu měření emisní fluorescence látky vyvolané vhodným excitační zářením. Pojem fluorescence může být někdy zaměněn s pojmem fosforescence. Oba tyto jevy se řadí k fotoluminiscenci a mají stejný princip vzniku, ale liší se dobou dosvitu. V případě fluorescence je doba dosvitu v rozsahu 10-6 s až 10-9 s. V případě fosforescence je doba dosvitu 10-6 s až 10 2 s. Pro použití v detektoru je vhodná fluorescence, protože fosforescence je příliš pomalá. Tento detektor je velmi citlivý a selektivní, 10x až 1000x citlivější než UV detektor pro aromatické látky. Kombinace excitační a emisní vlnové délky je charakteristická pro jednotlivé skupiny látek. Přibližně 15 % organických látek vykazuje přirozenou fluorescenci, která je dána přítomností konjugovaných π elektronů nejlépe v kondenzovaném aromatickém systému. Při organické analýze jsou tedy nejlépe detekovatelné polyaromatické látky. Při stanovení polyaromatických uhlovodíků je detekční limit % hm. Nastavení vhodné pro polyaromatické uhlovodíky je excitační vlnová délka v rozsahu nm a emisní vlnová délka v rozsahu nm s tím, že je třeba při nastavení konkrétních vlnových délek zachovat nejmenší rozdíl mezi excitační a emisní vlnovou délkou 20 nm. Tento detektor není schopen detekovat látky, které nemají fluorescenci v rozsahu vlnových délek, se kterými daný přístroj operuje. Schéma fluorescenčního detektoru můžete vidět na obr. 1. Obr. 1: Schéma fluorescenčního detektoru Detektor absorpce záření v ultrafialové a viditelné oblasti (UV/VIS, UV-DAD) Pracuje na principu měření absorbance v UV oblasti (obvykle nm) někdy také pokračující v oblasti viditelného záření ( nm). Zdrojem UV záření bývá deuteriová výbojka, zdrojem VIS záření je obvykle wolframová lampa. Má jednu průtočnou měrnou celu. Jednodušší přístroje zaznamenávají jednu či několik vybraných vlnových délek. V tomto případě do měrné cely vstupuje pouze vybraná část spektra. Schéma UV/VIS detektoru s jednou nastavitelnou vlnovou délkou je na obr. 2. zdroj monochromátor cela fotonásobič Obr. 2: Schéma UV/VIS detektoru s jednou vlnovou délkou 5

6 Složitější přístroje mohou zobrazovat spektrum v celém měřeném rozsahu. Toto zvládá tzv. DAD (Diode Array Detector). V tomto případě vstupuje do měrné cely záření v plném měřícím rozsahu. Schéma UV/VIS detektoru s DAD je na obr. 3. zdroj cela optický prvek diodové pole Obr. 3: Schéma UV/VIS-DAD detektoru Tento detektor je schopen detekovat látky schopné absorbovat záření v rozsahu použitých vlnových délek. Nejčastější nastavení pro analýzu paliv je 254 nm jako neselektivní nastavení pro všechny aromatické látky. Další možností nastavení je oblast nm pro látky s dvojnými vazbami či obsahující heteroatomy nebo oblast nm pro polyaromatické uhlovodíky. Není schopen detekovat látky, které neabsorbují v použitém rozsahu vlnových délek, což obvykle znamená nasycené uhlovodíky. Je citlivější než RID, ale méně citlivý než FLU. Je použitelný lépe pro izokratickou eluci. Hmotnostní spektrometr (MS) Hmotnostní spektrometr zaujímá speciální pozici mezi ostatními detektory. Je to samostatný analytický přístroj, který může provést analýzu složení vzorku. Ale zároveň při vhodném zapojení může využít separačních technik ke zjednodušení analyzované směsi, díky čemuž může dodat lepší výsledky. Pokud je analyzována směs látek, získaná hmotnostní spektra mohou být příliš složitá, pokud je množství složek směsi veliké a není tedy možné zrekonstruovat původní složení. Pokud však dojde k rozdělení směsi na jednotlivé složky, pak hmotnostní spektrometr může přinést informaci o chemické struktuře jednotlivých složek a jejich obsah ve směsi. Hmotnostní spektrometr může analyzovat pouze látky, které je možné převést do plynného skupenství a ze kterých je možné vyrobit ionty. Prvním krokem analýzy v hmotnostním spektrometru je vytvoření iontů z původně elektricky neutrálních molekul. Toho se dosahuje v iontových zdrojích. Následuje separace získaných iontů v iontových separátorech, kde dojde k rozdělení iontů podle velikosti jejich poměru m/z. Poté jsou ionty a jejich fragmenty vedeny na detektor, který umožňuje vyhodnocení intenzity signálu příslušející určitému m/z. Podrobnější popis konstrukce a činnosti hmotnostních spektrometrů najdete v kapitole o hmotnostní spektrometrii. Pro použití hmotnostního spektrometru jako detektoru v kapalinové chromatografii je klíčové napojení výstupu z kolony ke vstupu do hmotnostního spektrometru. Uvnitř hmotnostního spektrometru je hluboké vakuum. Pokud se do tohoto prostředí dostane kapalná mobilní fáze, dojde k jejímu velice rychlému odpaření s uvolněním velkého množství par a tím se vakuum uvnitř hmotnostního chromatogramu naruší. Může dokonce dojít k poškození přístroje. Proto je velmi důležité odstranit naprostou většinu mobilní fáze a zároveň zachovat veškerý analyt před vstupem do iontového zdroje. K tomu slouží některé speciální techniky. Příkladem může být elektrosprej, ve kterém je mobilní fáze odpařována proudem inertního plynu. Výstup z kolony je rozprašován a zároveň je povrch vznikajících kapiček nabit elektrickým nábojem. Při dosažení kritické velikosti kapiček je hustota náboje natolik vysoká, že výsledné síly překonají povrchové napětí a rozdělí 6

7 kapičku do několika menších kapiček. Tento proces se opakuje, dokud se veškerá mobilní fáze neodpaří a nezůstanou pouze ionizované molekuly analytu. Tyto molekuly ve vznosu jsou následně nasávány kapilárou do iontového zdroje hmotnostního spektrometru. Tento způsob propojení kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie lze použít pouze pro snadno ionizovatelné látky, v případě analýzy ropných frakcí jsou to například molekuly obsahující heteroatomy. Pro nasycené uhlovodíky a většinu aromatických uhlovodíků je tedy takováto analýza nepoužitelná. Refraktometrický detektor (RI) Měří a vyhodnocuje rozdíl indexu lomu mezi měrnou a referentní celou. V referentní cele je čistá mobilní fáze, v měrné cele je výstup z kolony. Detektor musí být temperován na svoji pracovní teplotu. Je velmi citlivý na změny teploty a tlaku mobilní fáze, které způsobují drift (postupnou změnu) základní linie. Sledování indexu lomu probíhá prostřednictvím průchodu paprsku světla dopadajícího na pole světlocitlivých prvků. Schéma RID detektoru je na obr. 4. Obr. 4: Schéma RID detektoru Je schopen detekovat skoro všechny látky. Není schopen detekovat látky se stejným indexem lomu jako má použitá mobilní fáze. Je relativně málo citlivý v porovnání s dalšími zde uvedenými detektory. Je použitelný jen pro izokratickou eluci, protože není vyřešena výměna mobilní fáze v referentní cele během měření. Je normováno jeho použití při stanovení aromatických uhlovodíků ve středních ropných destilátech v normě ČSN EN Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) Tento detektor rozprašuje výstup z kolony ve vyhřívané trubici (tzv. nebulizer) v proudu inertního plynu. Díky tomu se odpaří mobilní fáze a vytvoří se drobné kapičky analytu. Díky dobrému rozprášení mají mít kapky stejnou velikost. Tyto kapky jsou v proudu nebulizačního plynu vedeny do detekční části, kde na ně svítí laser. Laserové světlo se na kapičkách rozptyluje, čím více je kapek. Rozptýlené světlo je detekováno fotodetektorem umístěným mimo původní paprsek světla. Nejčastějším případem je umístění v pravém úhlu k původnímu směru paprsků. Ke správné funkci je nezbytné, aby použitá mobilní fáze měla výrazně vyšší těkavost než analyt. Odezva jednotlivých látek by měla být stejná a měla by odpovídat počtu kapiček. V praxi dělají detektoru problémy chromofory, barevné látky, které mohou část laserového záření pohlcovat místo rozptýlení a detektor tak udává nesprávné výsledky. V ostatních případech je odezva detektoru univerzální na všechny typy sloučenin. Při správné funkci je limit detekce 1 50 ng absolutně. Schéma ELSD detektoru je na obr. 5. 7

8 Obr. 5: Schéma ELSD detektoru Gravimetrie Gravimetrií se rozumí zjištění kvantity analytu pouze na základě přírůstku hmotnosti. Nejedná se tedy o detektor v pravém slova smyslu. Pro gravimetrii je nezbytné použití přesných analytických vah vážících s přesností na 0,0001 g nebo na 0,00001 g. Gravimetrická kvantifikace se nejčastěji používá při semipreparativním či preparativním uspořádání, kdy je možné nabrat dostatečné množství analytu, aby bylo možné ho zvážit s rozumnou mírou chyby měření. Postup uplatnění gravimetrie je následující: Pro každou separovanou látku či skupinu látek, které je plánováno získat je třeba mít odpovídající baňku, ve které je plánováno vážení. Jednotlivé látky či frakce jsou zachytávány do odměrných válců. Není zde tedy přímá kontrola nad tím, co v době odběru opouští kolonu. Z odměrných válců jsou zachycené frakce kvantitativně převedeny do zvážených baněk, ze kterých je odpařena mobilní fáze. Pro úspěšné použití gravimetrie je tedy nezbytné, aby bylo možné úplně odpařit mobilní fázi bez ztráty analytu či jeho degradace. K odpařování mobilních fází jsou s výhodou používány rotační vakuové odparky. Následuje zvážení baňky s analytem a výpočet hmotnostního zlomku analytu v původním vzorku. Obrovskou výhodou této techniky je její instrumentální nenáročnost a dostupnost, dále je to získání absolutní informace o kvantitě bez nezbytnosti kalibrace. Naopak velkou nevýhodou je nutnost kvalitního pracovníka, provádějícího měřící činnost. Nepozornost či nejistota při provedení práce zde znamená nesprávné výsledky. Chyby měření jsou často způsobeny nesprávným odstraněním mobilní fáze, buď je ponechán v analytu zbytek mobilní fáze a výsledky jsou nadhodnoceny nebo je naopak spolu s mobilní fází odpařen a analyt a výsledky jsou pak podhodnoceny. Gravimetrii je možné využít také při HPLC analýze pokud je analýza mnohokrát opakována a na výstupu HPLC systému je zařazen sběrač frakcí, který jednotlivé frakce sbírá do předem zvážených nádobek. Tyto nádobky mohou, ale nemusí být umístěny do koncentrátoru, ve kterém dochází k odpařování mobilní fáze proudem dusíku při mírně zvýšené teplotě. Vyhodnocení výsledků Vyhodnocení výsledků analýzy závisí na způsobu sběru výstupních dat a na použitém detektoru. V případě gravimetrie k vyhodnocení postačí zápisník a kalkulátor. V případě zpracování dat z detektorů je dnes vhodné připojit je k řídícímu počítači. 8

9 Pokud není počítač k dispozici, je možné obvykle analogový výstup detektoru připojit k lineárnímu zapisovači. Ten zajišťuje zápis závislosti časového průběhu signálu detektoru na papír. Takovýto zápis je možné vyhodnotit například počítáním čtverečků milimetrového papíru, což je značně nepřesné. Dnes je tento způsob téměř opuštěn. Pokud je výstup z detektoru připojen k řídícímu počítači, pak není počítačem zpracováván celý analogový signál. Mezi detektorem a zpracovaných chromatogramem je obvykle umístěn analogově digitální převodník, který provádí podle nastavených kritérií vzorkování signálu. To znamená, že z původního signálu jsou dále zpracovávány jen izolované body, které reprezentují celý průběh signálu. Pokud je špatně nastavené vzorkování, může způsobovat chyby ve vyhodnocení analýzy. V počítači ke zpracování signálu a někdy také přímo k řízení chromatografu slouží specializovaný software, který umožňuje záznam integrovat, přiřazovat jednotlivé píky známým látkám, měnit úroveň základní linie a další operace nezbytné pro získání údajů z chromatogramů. Hlavními údaji takto získanými jsou retenční časy píků a plochy těchto píků. Pokud je do software vložena také kalibrační křivka pro vybraný pík, je možné rovnou provést výpočet složení analyzovaného vzorku Uspořádání mobilní a stacionární fáze v kapalinové chromatografii Pro analýzu v kapalinové chromatografii je velice důležitý správný výběr stacionární a mobilní fáze. Ten určuje, které složky analyzovaného vzorku budou interagovat se stacionární fází a jak silně. Obvyklé je vždy kombinovat opačné polarity stacionární a mobilní fáze. V tzv. normálním uspořádání (Normal Phase - NP) je stacionární fáze polární (alumina, silikagel, NH 2- silikagel) a mobilní fáze je nepolární (C 5 C 7 uhlov., chlor. rozp., aromáty, alkoholy, ketony). Toto uspořádání je vhodné pro analýzy, kde analyt má složky s různou polaritou a kde je vhodné, aby složky s vyšší polaritou měly vyšší retenční časy než složky s nižší polaritou. Příkladem analýzy s tímto uspořádáním může být preparativní LSC nebo stanovení aromátů ve středních destilátech. V tzv. obráceném uspořádání (Reverse Phase - RP) je stacionární fáze nepolární (C 8- a C 18 silikagel, CN-silikagel, fenyl-silikagel) a mobilní fáze polární (voda, metanol, acetonitril, THF). Toto uspořádání je vhodné pro analýzy, kde analyt má složky s různou polaritou a kde je vhodné, aby složky s nižší polaritou měly vyšší retenční časy než složky s vyšší polaritou. Příkladem analýzy s tímto uspořádáním může být stanovení polyaromatických uhlovodíků. V předchozích dvou odstavcích uvedené rozdělení kombinací stacionární a mobilní fáze je používáno nejčastěji v případě vysokoúčinné kapalinové chromatografie. V jiných případech platí stejné obecné principy, ale zvláště v případě postupné eluce, kdy jsou střídány mobilní fáze s různou polaritou, toto rozdělení neplatí striktně. Sorbenty pro LC Pro účely preparativní nebo semi-preparativní kapalinové chromatografie jsou jako stacionární fáze využívány vhodné sorbenty. Každý ze sorbentů má své výhody a nevýhody. Vlastnosti nejčastěji používaných sorbentů jsou uvedeny dále: Silikagel je práškový oxid křemičitý. Má vysokou sorpční kapacitu, ale nižší dělící schopnosti než další sorbenty. Jako aktivní centra zodpovědná za interakce s analytem zde slouží hydroxylové OH, respektive silanolové Si-OH skupiny. Povrch silikagelu je mírně kyselý. 9

10 Alumina je práškový oxid hlinitý. Má nižší sorpční kapacitu než silikagel, ale vyšší dělící schopnosti. Například umožňuje rozdělit jednotlivé skupiny aromátů podle počtu aromatických jader. Jako aktivní centra na povrchu aluminy kromě hydroxylových skupin působí také Lewisovy báze (centra s elektron-akceptorovými vlastnostmi). Z toho vyplývá, že má tím silnější interakce a aromatickými sloučeninami, čím více mají v molekule aromatický jader. Povrch aluminy může být zásaditý, kyselý i neutrální, ale z praktických důvodů se nejčastěji používá alumina neutrální. Florisil je práškový křemičitan hořečnatý. Svými vlastnostmi se nachází mezi silikagelem a aluminou. Může sloužit například pro separaci PCB. Sorbenty jsou obvykle citlivé na obsah vody. Pokud jsou ponechány delší dobu na vzduchu, vodu adsorbují. Proto před jejich použitím pro chromatografické účely je nutné nejprve provést jejich aktivaci. Aktivace sorbentů znamená odstranění vody z jejich struktury, ale bez změny jejich krystalické modifikace. Obvykle se pro aktivaci volí vhodná teplota a čas. Alumina se často aktivuje 6-8 h při 400 C. Silikagel se obvykle aktivuje 3 16 h při C, podobně florisil se aktivuje například při 140 C po dobu 16 hod. Důležitou vlastností sorbentů je velikost jejich částic. Čím menší je velikost částic, tím větší mají měrný povrch a jsou schopny dosáhnout lepšího dělení, ale zároveň menší částice způsobují nárůst tlakové ztráty v koloně a pro její překonání je třeba vyvinout vyšší tlak, aby mobilní fáze kolonou procházela. Proto je třeba dosáhnout rozumného kompromisu, kdy je velikost částic co nejmenší, ale zároveň způsobuje jen minimální tlakovou ztrátu. Za optimální velikost částic se považuje μm. Při praktickém použití jsou různé sorbenty nezřídka kombinovány pro dosažení lepších dělících schopností. Příkladem může být kombinace silikagelu v horní části kolony a aluminy ve spodní části. Silikagel zde zabrání deaktivaci aluminy polárními látkami a také sorbuje eventuálně ve vzorku přítomnou vodu. Důležitým parametrem promlouvajícím do účinnosti dělení na chromatografické koloně je její maximální možné zatížení. Běžným zatížením je 0,1 g vzorku na 10 cm 3 sorbentu. Při optimálním zatížení dojde k dostatečné separaci složek a zároveň je množství jednotlivých frakcí dostatečné pro jejich spolehlivou detekci. U středních a vysokovroucích ropných frakcí se provádí separace uhlovodíkových skupin podle jejich vzrůstající polarity na nasycené uhlovodíky, mono-, di- a polyaromáty. Separace nepolárních uhlovodíků a polárních heterosloučenin probíhá bez komplikací, ale thiofeny a furany eluují společně s aromatickými uhlovodíky. Nedojde tedy k úplnému rozdělení frakcí a jednotlivé frakce tak mohou být kontaminovány. Další komplikací, které je třeba čelit, přináší velmi polární sloučeniny (např. aminy, fenoly, organické kyseliny). Ty mohou zůstat nevratně sorbované na koloně, a tedy nedojde k úplné eluci vzorku z kolony. Kromě čistých sorbentů se někdy používá také jejich modifikace, která má za cíl pozměnit jejich vlastnosti pro separaci specifických skupin. Častěji je modifikován silikagel. Silikagel modifikovaný AgNO 3 slouží k separaci alkenů z nasycených uhlovodíků. Silikagel modifikovaný PdCl2 lze použít pro separaci sirných sloučenin a silikagel modifikovaný H 2SO 4 lze použít pro separaci bazických sloučenin nebo pro sulfonaci aromátů. Modifikované sorbenty pro LC Sorbenty, probrané v předchozích odstavcích, mají své vlastnosti a dělící schopnost dánu svými chemickými vlastnostmi. Postupem času začala být pociťována nezbytnost změny vlastností sorbentů a jejich selektivity. Proto byly hledány nové sorbenty nebo byly nosiče pokrývány vrstvou jiných látek. 10

11 Tyto přístupy měly svá velká omezení, konkrétně kapalinou pokryté nosiče měly velmi krátkou životnost a kvůli jejich vymývání z kolony rychle měnily své vlastnosti i během analýzy. Proto byla k životu přivedena myšlenka vrstvu aktivní látky na povrchu nosiče chemicky ukotvit. Praktickým řešením tohoto problému se ukázala být chemická modifikace povrchu vhodného sorbentu, nejčastěji silikagelu. Díky chemické vazbě mezi nosičem a funkční skupinou téměř nedochází k vymývání aktivních center z kolony, která má díky tomu dlouhou životnost. Díky používání různých funkčních skupin se dramaticky mohou měnit vlastnosti původního nosiče a byly tak umožněny separace, které do té doby nebylo možné provést. Vzhledově se modifikované sorbenty od nemodifikovaných dramaticky neliší. Je to stále bílý prášek o vhodném zrnění. Při prohlížení pod mikroskopem jsou vidět částice v podobě drobných kuliček, u nejlepších sorbentů je distribuce velikostí kuliček velmi úzká a tvary jsou opravdu kulovité jak je vidět na obr. 6. U sorbentů horší kvality mohou být částice nepravidelné a distribuce může být širší, což zhoršuje dělící schopnosti kolony. Pro HPLC se používají mikropartikulární sorbenty o velikosti zrn menší než 10 μm. Obr. 6: Zrnka modifikovaných sorbentů pod mikroskopem Příklady polárních modifikovaných silikagelů pro normální uspořádání jsou na obr. 7. Silikagel modifikovaný nitrilovou skupinou lze použít jak v normálním tak i v reversním uspořádání. -CN (nitril) -NH2 (amino) -NO2 (nitro) -diol Obr. 7: Modifikované silikagely pro normální uspořádání HPLC Příklady nepolárních modifikovaných silikagelů pro reverzní uspořádání v HPLC jsou na obr. 8. -C 8 (oktyl) -C 18 (oktadecyl) -C 18/Phe (oktadecyl/fenyl) -Phe (fenyl) Obr. 8: Modifikované silikagely pro reversní uspořádání HPLC Zajímavé je chování silikagelu modifikovaného oktadecylem. Jako mobilní fáze se často používá voda nebo směs vody a acetonitrilu. Hydrofobní řetězce C 18 mají vyšší afinitu k nepolárním sloučeninám než k polárním. Proto při separaci z kolony odcházejí nejprve polární sloučeniny (např. polyaromáty) a teprve později odchází nepolární sloučeniny (např. nasycené uhlovodíky). 11

12 Pokud kolem sorbentu prochází polární sloučeniny, téměř neinteragují s povrchem sorbentu. Řetězce C18 jsou shluklé a blízko povrchu sorbentu. Výsledkem je malá interakce a krátké retenční časy jak je vidět na obr. 9. Obr. 9: Chování -C18 modifikovaného silikagelu v přítomnosti polárních sloučenin. Pokud kolem sorbentu procházejí nepolární sloučeniny, začnou interagovat s C18 řetězci. Ty se napřímí a rozestoupí a významně tak zvětší povrch sorbentu. Dramaticky tak stoupne síla interakce a výsledkem jsou dlouhé retenční časy jak je vidět na obr. 10. Vliv modifikace sorbentu na separaci aromátů Retenční chování uhlovodíků lze významným způsobem ovlivnit volbou vhodné modifikace silikagelového nosiče. To je také jeden z důvodů, proč se provádí modifikace stacionárních fází. Na je vidět, že distribuční konstanta k se u stejných látek dramaticky odlišuje v závislosti na použité modifikaci. Pojmem NUCLEOSIL je zde označen nemodifikovaný silikagel. V některých případech ale nejvyšší retenční časy nejsou vždy ty nejlepší, protože to prodlužuje celkovou dobu separace. Obr. 10: Chování -C18 modifikovaného silikagelu v přítomnosti nepolárních sloučenin. Gely pro gelovou permeační chromatografii (GPC) 12 Obr. 11: Distribuční konstanty aromátů pro různě modifikované silikagely Někdy je GPC též označována jako SEC (Size Exclusion Chromatography). Tento typ chromatografie využívá fyzikální interakci mezi analytem a stacionární fází. Je zde použit sítový efekt některých látek, které mají ve své struktuře drobné póry. Do těchto pórů se zachycují molekuly analytu, přičemž menší molekuly pronikají do pórů hlouběji než větší molekuly a díky tomu během průchodu kolonou je jejich dráha výrazně delší a trvá delší dobu. Mezi molekulami analytu a povrchem stacionární fáze

13 nevznikají žádné vazby. Díky tomuto vzájemnému působení se separovaný vzorek dělí podle velikosti molekul. Je zde záměrně napsáno podle velikosti, protože záleží na celkové velikosti a tvaru molekuly jak hluboko do pórů bude pronikat. Tato velikost má souvislost s molekulovou hmotností, ale nemusí jí přímo odpovídat. Pro určení molekulových hmotností touto metodou je tedy nezbytná kalibrace látkami o známé molekulové hmotnosti a tvary, které odpovídají tvarům analytu. Například nelze kalibrovat aromatické uhlovodíky pomocí dlouhých lineárních řetězců (např. poly-α-olefiny), protože v gelu pronikají různě hluboko do pórů, i když by měly podobnou molekulovou hmotnost. Schéma funkce gelů v gelové permeační chromatografii je na obr. 12. Obr. 12: Schéma separace pomocí gelové permeační chromatografie Jako náplň kolon v gelové permeační chromatografii se používají dva typy gelů. Prvním typem gelů jsou gely měkké. Nejčastěji jsou tvořeny částicemi kopolymeru polystyrenu a divinylbenzenu, označované například jako Bio-Beads SX-12). Tyto gely během přípravy kolony v mobilní fázi bobtnají a plnění kolony tak musí počítat se změnou objemu stacionární fáze. Mají malou mechanickou odolnost, a pokud by došlo během bobtnání k výraznému zvětšení objemu bez prostoru pro jeho kompenzaci, mohlo by dojít k mechanické destrukci částic gelu a ten by již nedělil. Měkké gely bobtnají v různých mobilních fázích různě, proto po naplnění kolony již nelze měnit mobilní fázi, protože by došlo buď k destrukci gelu, nebo ke smrštění náplně kolony a otevření mrtvého prostoru. Měkké gely se obvykle plní do skleněných kolon pro preparativní separace. Druhým typem gelů jsou gely tvrdé. Tyto gely jsou tvořeny zesíťovaným dextranem, označují se například jako Sephadex LH-20 a, jak název napovídá, jsou mechanicky odolné. Také nebobtnají v mobilní fázi a pro účely různých analýz je možné měnit mobilní fázi. Tvrdé gely se obvykle plní do kovových kolon pro analytické separace a mohou být použity i jako součást HPLC systémů. Vlastnosti rozpouštědel používaných pro LC Vlastnosti rozpouštědel používaných jako mobilní fáze jsou poměrně různorodé. Hlavním parametrem, který určuje vhodnost určitého rozpouštědla je index polarity. Tato bezrozměrná veličina charakterizuje polaritu, afinitu daného rozpouštědla k silikagelu a pro praktické použití určuje, jak silně bude dané rozpouštědlo soutěžit s analytem o aktivní místa sorbentu. Index polarity 13

14 Viskozita při 20 C (cp) se pohybuje od 0,0 u n-pentanu po 9,0 u vody. Rozpouštědla s malým indexem polarity jsou vhodná pro eluci málo polární sloučenin, které navazují se stacionární fází slabší vazby. Naopak rozpouštědla s vysokou hodnotou indexu polarity budou silně soutěžit o aktivní centra a mohou je někdy i nevratně obsadit. To je například případ vody, která zcela zruší aktivní centra silikagelu a měla by vytěsnit veškeré sorbované látky. O použitelnosti daného rozpouštědla a jeho případné kombinaci s dalšími rozpouštědly rozhodují i další parametry. Důležitými parametry jsou viskozita, rozpustnost ve vodě a bod varu. Při každé aplikaci je tedy třeba nejprve zhodnotit vzájemnou kompatibilitu rozpouštědla s použitou stacionární fází, s dalšími případnými rozpouštědly a také s analytem. Pokud by došlo k uvolnění analytu do rozpouštědla, ve kterém je nerozpustné, dojde ke shlukování analytu do drobných kapiček a nedochází již k další separaci a celá analýza tak může být ztracena. Viskozita se uplatňuje především při tlakové ztrátě na koloně. Čím vyšší je viskozita mobilní fáze, tím vyšší tlak je v dané koloně nutno překonat, aby mobilní fáze protékala. Je nutno si také uvědomit, že dochází ke změně viskozity i v případě míchání mobilních fází. K výrazným změnám viskozity dochází například při míchání organických rozpouštědel a vody při gradientové eluci během míchání může viskozita vzrůst natolik, že bude překročena možnost čerpadla a další analýza se zastaví. Obvyklé hodnoty tlaku, které jsou HPLC kolony schopny zvládnout, se pohybují kolem 25 MPa. Dále jsou vidět příklady takového míchání. Na obr. 13 je graf závislosti viskozity na obsahu organického rozpouštědla ve vodě. Běžně používaný acetonitril má jen malé změny viskozity, ale také často používaný methanol již má změnu výraznou a u ethanolu je ještě vyšší. 3 2,5 2 ethanol 1,5 1 0,5 0 methanol acetonitril Obsah organiky v m.f. (% hm.) Obr. 13: Závislost dynamické viskozity na obsahu organické složky ve vodě V tab. 1 je uvedeno několik příkladů směsí mobilních fází, které jsou také uvedeny na obr. 13. Zatímco v případě směsi acetonitrilu a vody není mezní tlak kolony překročen, v případě směsi methanolu a vody již musí být zabráněno překročení mezního tlaku kolony zvýšením teploty mobilní fáze. 14

15 Tab. 1: Tlak v koloně SiO2-C18 při různém složení mobilní fáze CH 3CN / H 2O CH 3OH/ H 2O Složení m.f. Teplota ( C) Tlak (MPa) 25 : : : : : Pokud je v chromatografickém systému využit UV detektor, pak je také klíčovou vlastností použité mobilní fáze jeho absorbance v UV oblasti. Pro tyto účely je u mobilních fází uváděna hodnota tzv. UV cut off. Tento pojem označuje hraniční vlnovou délku, pod níž mobilní fáze vykazuje absorbanci v UV oblasti a je tedy pod ní již nepoužitelné pro detekci v dané oblasti UV spektra. Příklady UV cut off často používaných mobilních fází jsou uvedeny v tab. 2. Je vidět, že mobilní fáze v pravé části tabulky jsou pro UV detekci použitelné jen s velkými omezeními nebo zcela nepoužitelné. Tab. 2: UV cut off hodnoty vybraných mobilních fází Rozpouštědlo UV cut off (nm) Rozpouštědlo UV cut off (nm) n-pentan 190 Dichlormethan 233 Acetonitril 190 Chloroform 245 Cyklohexan 200 Ethylacetát 256 Isopropanol 205 Benzen 280 Methanol 206 Toluen 285 Ethanol 210 Xylen 290 n-propanol 210 Aceton 330 Ethylenglykol 210 MEK 330 Diethyleter 220 Nitromethan 380 Tetrahydrofuran 230 Sirouhlík Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (dále HPLC) je varianta kapalinové chromatografie využívající stacionární fáze s malým zrněním a velkým povrchem k dosažení vysoké účinnosti dělení složek směsí. Díky tomu mají HPLC kolony malé rozměry. Kvůli vysoké tlakové ztrátě na takovéto koloně je nezbytné celý systém provozovat s vysokými tlaky a tomu přizpůsobit veškeré části chromatografického systému. Ne každá firma dokáže vyrobit součásti, které lze použít pro HPLC. Hlavní výrobci HPLC přístrojů jsou: Thermo Electron Corporation (USA) Agilent (USA) Varian (USA) Shimadzu (Japonsko) Waters (USA) Knauer (Německo) 15

16 Uspořádání HPLC systému Základní schéma HPLC je stejné jako u všech ostatních chromatografických systémů. Příklad chromatografického systému můžete vidět na obr. 14. Obr. 14:Možné schéma HPLC systému [2] Zásobník mobilní fáze Jako zásobník mobilní fáze obvykle slouží lahev s rozpouštědlem dimenzované podle očekávané spotřeby. Někdy může být doplněna degaserem, což je zařízení sloužící k odstranění vzduchu rozpuštěného v mobilní fázi. V zásobníku mobilní fáze je degaser realizován často jako kapilára, kterou probublává helium. Odplynění mobilní fáze je velmi důležité. Pokud není provedeno, může v systému docházet ke tvorbě drobných bublinek, které zhoršují dělící schopnosti kolony a pokud se dostanou do detektoru, způsobují vznik falešných signálů. Sací kapilára ponořená do mobilní fáze je obvykle opatřena filtrem, který má zabránit vniknutí částic do čerpadla, kde by mohly způsobit zhoršení či zastavení funkce ventilu. Čerpadlo Vysokotlaké čerpadlo, obvykle pístové s dvojicí pístů, je dnes řízeno elektronicky, aby byly co nejvíce potlačeny pulzy. Tlakové pulzy způsobují rozmývání píků a proto je velmi důležité je potlačit pro zachování dělících schopností kolony. Kromě režimu práce čerpadla je možné také použít tlumič pulzů, který bývá zařazen za čerpadlem. Čerpadla musí být schopna trvale pracovat při tlacích až 40 MPa. Tlakové spoje Pro zajištění spojení jednotlivých prvků HPLC systému jsou používány speciální spoje. Ty musí odolávat vysokým tlakům, být inertní vůči použitým mobilním fázím i vůči analyzovaným látkám a pokud možno se mají jednoduše montovat i demontovat. Používají se pouze spoje šroubovací, což sebou přináší nekompatibilitu, kterou je nutné hlídat. Vzhledem k tomu, že HPLC systémy se vyrábí jak v USA, tak v Evropě, jsou na závity používány metrické i palcové rozměry, které jsou spolu nekompatibilní. Proto je třeba vždy dát pozor a kombinovat pouze kompatibilní závity a rozměry. 16

17 Tlaková odolnost spojů je zajištěna pomocí tzv. ferule, kónického prvku, který je šroubkem zamáčknut do kónického otvoru a sevře vloženou kapiláru. Jako materiály jsou používány nerez či PEEK (polyetereterketon), které splňují požadavky popsané výše. Pokud je použita nerezová ferule na nerezovou kapiláru, vytvoří se nerozebíratelný spoj a v případě potřeby změny zapojení je nutno tento spoj odříznout pilníkem na kapiláry. V případě použití PEEK ferule na PEEK nebo nerezovou kapiláru je spoj obvykle bez velkých problémů opakovaně rozebíratelný. V případě PEEK je často možné spoj dotáhnout pouze rukou pro dostatečnou nepropustnost. Příklad tlakového spoje pro HPLC v řezu je na obr. 15. Obr. 15: Řez tlakovým spojem v HPLC Nástřikový člen Zatímco při chromatografiích s nízkými tlaky v koloně je nadávkování vzorku do kolony poměrně snadnou záležitostí, v případě HPLC je to poměrně komplikované. Během dávkování vzorku je totiž třeba kvantitativně přenést vzorek z atmosférického tlaku do vysokého tlaku v koloně, aniž by unikla mobilní fáze. Jednou možností je načerpání vzorku pomocí čerpadla, jak se to někdy dělá u nízko a středotlakých aplikací. V případě HPLC to ale představuje komplikaci, protože při změně nasávaného média (mobilní fáze vzorek mobilní fáze) by pravděpodobně došlo k nasátí bublinek vzduchu do systému, což může způsobit velké komplikace při analýze až její znemožnění. Řešení představuje nástřikový člen. Je to speciální šesticestný ventil, který má vstup pro stříkačkovou jehlu a výměnnou nástřikovou smyčku. Smyčky mohou mít vnitřní objem 5 μl 5 ml, ale obvyklejší jsou spíše menší smyčky s objemem do 20 μl. Do nástřikového členu se používají výhradně stříkačky s tupou jehlou, ostrá jehla by mohla člen poškodit. Důležitý je také správný vnější průměr jehly. Příliš silná jehla se nevejde do otvoru pro nástřik a příliš slabá jehla neumožní utěsnění jehly a může dojít k úniku vzorku mimo smyčku. Nástřikové členy jsou dvoupolohové. V jedné poloze je smyčka odpojena od zbytku systému a je přístupná z portu stříkačky (poloha LOAD). V této poloze je vzorek nastříknut do smyčky. S jehlu ponechanou uvnitř nástřikového členu dojde k přepnutí členu do druhé polohy (poloha INJECT), ve které je smyčka zařazena do HPLC systému a vzorek uvnitř smyčky je mobilní fází unášen do kolony. Příkladem výrobců nástřikových členů mohou být firmy Rheodyne (USA) nebo Valco (USA). Příklad schématu nástřikového členu a zapojení HPLC systému v obou polohách členu je na obr

18 Obr. 16: Schéma nástřikového členu. Vlevo naplnění smyčky, vpravo nástřik do systému Přepínací ventily Kromě nástřikového členu mohou být v HPLC systému použity také další typy přepínacích ventilů. Ty mají z úkol přepínat zapojení jednotlivých částí systému nebo přepínat směr proudění mobilní fáze. Každý přepínací ventil je vždy dvoupolohový, což znamená, že funkci zajišťují vždy jen dvě krajní polohy, mezi kterými se přepíná. Obvykle se funkce přepínacích ventilů odvíjí od počtu přepínaných cest. Příklady vícecestných přepínacích ventilů a jejich využití najdete na následujících obrázcích. Poloha A Poloha B Obr. 17: 4-cestný přepínací ventil, příklad využití pro přepínání výstupu z kolony mezi dvěma detektory. Do detektoru 1 v poloze A a do detektoru 2 v poloze B. 18

19 Poloha A Poloha B Obr. 18: 6-cestný přepínací ventil, příklad využití pro přepínání toku mobilní fáze mezi dvěma kolonami. Do kolony 1 v poloze A a do kolony 2 v poloze B. Poloha A - analýza přes předkolonu a kolonu Poloha B - výplach předkolony Obr. 19: 6-cestný přepínací ventil, příklad využití pro analýzu vzorku s využitím předkolony v poloze A a následně výplach předkolony v poloze B. Poloha A Poloha B Obr. 20: 8-cestný přepínací ventil, příklad využití pro nástřik stejného vzorku pomocí dvou rozdílných dávkovacích smyček. Nástřik smyčky 1 a plnění smyčky 2 v poloze A a nástřik smyčky 2 a plnění smyčky 1 v poloze B. 19

20 Poloha A - analýza na 1. koloně + záchyt vzorku Poloha B - analýza na 2. koloně Obr. 21: 10-cestný přepínací ventil, příklad využití pro postupnou analýzu vzorku na dvou. kolonách s využitím záchytové smyčky. Do kolony 1 v poloze A a do obou kolon v poloze B. Mísící člen Zajišťuje lepší míchání mobilních fází v případě gradientové eluce nebo průběžného vytváření mobilní fáze mícháním ze složek. Rozlišují se mísiče statické a dynamické. Statické mísiče jsou drobné vestavby, které lze často přimontovat na čerpadlo, mají několik vstupů a jeden výstup. Tělo mísiče je obvykle z nerezové oceli nebo PEEK. Samotné míchání zajišťuje vyměnitelná mísící patrona, která má vnitřní objem dimenzovaný podle využití buď jako analytický nebo jako mikro. Dynamické mísiče jsou obvykle rozšířením statického mísiče o pohyblivý člen, který aktivně míchá mobilní fáze motorem. Míchání může být uskutečňováno mechanickými míchadly nebo kolmým vírem (vortex sheer). a) b) c) Obr. 22: Mísiče firmy ASI: a) statický nerezový, b) statický PEEK, c) dynamický nerezový Míchání mobilní fáze v HPLC pro gradientovou eluci S instrumentací úzce souvisí i některé otázky, které je třeba pro HPLC analýzu řešit. Zde se budeme zabývat otázkou míchání mobilních fází pro gradientovou eluci. Při gradientové eluci se postupně mění složení mobilní fáze. Důležité je tady právě dosáhnout postupnosti změny složení mobilních fází, kdy se plynule mění vlastnosti mobilní fáze a jsou tak řízeně eluovány jednotlivé složky směsi. K míchání mobilních fází v HPLC se obvykle přistupuje dvěma způsoby. Buď je realizován vysokotlaký gradient, nebo nízkotlaký gradient. 20

21 Vysokotlaký gradient je dosahován v části HPLC systému, který je již pod vysokým tlakem. Toto uspořádání využívá tolika vysokotlakých čerpadel mobilních fází, kolik je žádáno mísených složek. Řídící člen řídí jednotlivá čerpadla a pomocí nastavování jejich průtoků je dosahováno přísunu žádaného množství jednotlivých složek výsledné mobilní fáze. Ke smísení dojde ve vysokotlakém mísícím členu a výsledná mobilní fáze putuje do kolony. Výhodou tohoto uspořádání je malý mrtvý objem chromatografického systému a menší zpoždění tvorby gradientu. Nevýhodou uspořádání vysokotlakového gradientu je výrazně vyšší cena a také náročnější údržba vícero čerpadel. Schéma vysokotlakého gradientu je na obr. 23. Zásobník mobilní fáze 1 Zásobník mobilní fáze 2 Zásobník mobilní fáze 3 Řídící jednotka Pumpa 1 Pumpa 2 Pumpa 3 Mísící člen Do nástřikového členu Obr. 23: Schéma vysokotlakého gradientu HPLC Nízkotlaký gradient je dosahován v části HPLC systému, která ještě není pod vysokým tlakem. Množství složek je zde ovlivňováno přepínáním mísícího členu. Teprve po smíchání jde výsledná mobilní fáze do vysokotlakého čerpadla a dosáhne tlaku v systému. Výhodou tohoto uspořádání je nižší cena, protože stačí použít jen jedno čerpadlo. Zároveň je zde dosaženo vyšší reprodukovatelnosti při tvorbě gradientu. Nevýhodou je větší mrtvý objem chromatografického systému. Schéma nízkotlakého gradientu v HPLC je na obr. 24. Zásobník mobilní fáze 1 Zásobník mobilní fáze 2 Zásobník mobilní fáze 3 Řídící jednotka Ventil 1 Ventil 2 Ventil 3 Mísící člen Pumpa Do nástřikového členu Obr. 24: Schéma nízkotlakého gradientu HPLC Volba optimální velikosti HPLC systému Velikost vnitřního objemu HPLC systému ovlivňuje jednak rychlost separace, jednak kvalitu píků a jednak spotřebu mobilní fáze. Technické požadavky na dosažení co nejmenšího vnitřního objemu systému jsou vyvažovány náročností provedení analýzy a citlivostí použitých detektorů. Menší kolona unese menší zátěž vzorku a tedy je při analýze nižší spotřeba vzorku, ale o to citlivější detektor musí být, aby zachytil menší množství jednotlivých separovaných složek. Hlavní částí systému, který určuje velikost vnitřního objemu HPLC systému, je kolona. Se zmenšující se kolonou klesá průtok mobilní fáze, roste úspora mobilní fáze a stoupá nárok na citlivost použitého detektoru. Příklad vzájemné závislosti najdete v tab

22 Tab. 3: Závislost Průtoku a úspory mobilní fáze a nároku na citlivost detektoru na průměru kolony HPLC systému Průměr kolony ID (mm) Průtok (ml/min) Úspora mobilní fáze (%) 4,6 1,3 0 1x ,3x 3 0, ,5x 2 0, x 1 0, x Nároky na citlivost detektoru Druhou částí, která se významně podílí na vnitřním objemu HPLC systému jsou propojovací kapiláry. Kapiláry slouží pouze k propojení jednotlivých funkčních částí chromatografického systému, ale mohou způsobovat rozšíření šířky píku a zhoršovat dělící schopnost systému. Proto je nanejvýš žádoucí omezit délku a vnitřní průměr kapilár pro dosažení funkčního minima jejich vnitřního objemu. Vnitřní průměr kapilár je vhodné volit podle potřebného průtoku mobilní fáze, která zase souvisí s vnitřním průměrem chromatografické kolony. Příklad vhodné volby vnitřního průměru kapilár podle vnitřního průměru kolony je v tab. 4. Tab. 4: Výběr ID kapilár podle ID kolony Kolona ID Kapilára ID 2 mm 0,13 mm (0,005 ) 3 mm 0,18 mm (0,007 ) 4,6 mm 0,25 mm (0,010 ) 8 mm 0,25 mm (0,010 ) 10 mm 0,75 mm (0,030 ) 21 mm 0,75 mm (0,030 ) Na velikosti kolony a tedy i průtoku mobilní fáze závisí i doporučená velikost měřící cely detektoru. Pro kolony s vnitřním průměrem větším než 3 mm je doporučený vnitřní prostor detektoru 5 10 μl. Pro kolony s vnitřním průměrem menším než 3 mm je doporučený vnitřní prostor detektoru 1 5 μl. Také množství analyzovaného vzorku záleží na velikosti kolony. Pokud by množství analyzovaného vzorku přesáhlo kapacitu kolony, nemůže dojít k separaci a analýza se nepovede. Pro kolony s vnitřním průměrem 4,6 mm je doporučené množství nastřikovaného vzorku μl. Pro kolony s vnitřním průměrem mezi 3 a 4 mm je doporučené množství nastřikovaného vzorku 5 20 μl. A pro kolony s vnitřním průměrem mezi 1 a 2 mm je doporučené množství nastřikovaného vzorku 0,5 5 μl Problémy při HPLC analýze Poruchy baseline Baseline neboli základní čára je základem každého píku. Ideální baseline má být rovná, rovnoběžná s časovou osou a bez šumu. Při měřeních se však analytici nezřídka potýkají s problémy, které způsobují odchylky od ideálního stavu. Kvalita základní linie je důležitá pro kvalitu analýzy a hlavně pro kvantifikaci jednotlivých složek. Nekvalitní základní linie se podílí na zvýraznění šumu, zhoršení poměru signál/šum a tím i snižuje citlivost stanovení. Následně bude probráno několik příčin poruch základní linie. 22

23 Nepravidelné poruchy spojené s průtokem mobilní fáze jsou na obr. 25. Tyto poruchy mohou být způsobeny nestabilitou chromatografického systému, bublinami vzduchu v měřící cele detektoru a únikem eluentu z měřící cely detektoru. Pokud je chromatografický systém dlouhodobě nestabilní, může být příčinou špatná činnost čerpadla. Při bublinách v měřící cele je nutno zkontrolovat těsnění před měřící celou, jestli nepřisává vzduch, ale častěji se jedná spíše o přisávání vzduchu na vstupu do čerpadla. V případě úniku z měřící cely je nutno přetěsnit spoje uvnitř detektoru, někdy může být prasklá i samotná cela, pak je nutno ji vyměnit. a) b) c) Obr. 25: Nepravidelné poruchy spojené s průtokem mobilní fáze: a) nestabilita systému, b) bubliny v měřící cele, c) únik z měřící cely Cyklicky se opakující poruchy spojené s průtokem mobilní fáze mohou mít někdy podobnou příčinu jako v předchozím případě, ale s různou intenzitou se stále opakují. Příkladem může být výskyt bublin v chromatografickém systému například kvůli průběžnému přisávání na vstupu do čerpadla nebo do jednoho z pístů v případě pístových čerpadel (obr. 26 a). Dále to může být nedostatečné promíchávání mobilních fází buď kvůli špatné funkci mísícího členu (obr. 26 b) nebo kvůli špatné mísitelnosti mobilních fází za daných podmínek (obr. 26 c) a) b) c) Obr. 26: Cyklicky se opakující poruchy spojené s průtokem mobilní fáze: a) bubliny v měřící cele, b) c) nedostatečně promíchané mobilní fáze Poruchy způsobené chybnou funkcí detektoru v sobě zahrnují například vadu lampy u detektorů využívajících zdrojů záření (obr. 27 a) nebo měření při nadměrně nastavené citlivosti (obr. 27 b). Nežádoucí změny teploty kolony se odrážejí v nepravidelném rozložení retenčních časů a u teplotně citlivých detektorů také ovlivňují citlivost měření (obr. 27 c). Obr. 27: Poruchy způsobené chybnou funkcí detektoru: a) vadná lampa, b) příliš vysoká citlivost; c) Nežádoucí změny teploty kolony 23

24 Poruchy způsobené nevhodným určení začátku či konce měřícího cyklu se objevují obvykle na začátku měření. Pokud je po zapnutí chromatografu zanedbáno dostatečné ustálení systému, lze pozorovat poruchu na obr. 28 a. Pokud je na konci analýzy nedostatečně vypláchnuta kolona, eluují z ní látky obvykle během další analýzy a objevují se píky tam, kde by žádné být neměly nebo se kontaminace postupně uvolňuje a pozvolna zvyšuje hodnotu základní linie jako je to na obr. 28 b. a) b) Obr. 28: Poruchy způsobené nevhodným určení začátku či konce měřícího cyklu: a) krátká stabilizace, b) nedostatečné vymytí Nestandardní píky Pro kvalitní vyhodnocení chromatogramů je důležité, jaká je kvalita chromatografického signálu. Měřítkem kvality signálu obvykle bývá poměr mezi hodnotou šumu a signálu, někdy se píše jako S/N, v angličtině noise to signal ratio. Minimální velikost píku, aby byl identifikován jako, pík musí být S/N = 2. Pro kvalitativní analýzu je nezbytný minimální S/N o hodnotě 3 a pro kvantitativní analýzu musí být S/N minimálně 10. Kromě toho se také často uvádí parametr Drift, který udává, jak moc se mění základní linie během měření. Ideální hodnota driftu je 0. Ideálním tvarem chromatografických píků by měla být Gaussova křivka. Při měření se však často projevují vlivy, které tvar píku více či méně deformují. Při určování toho, co je nestandardní je třeba mít nejdříve představu, jaká je normální podoba píků a poté srovnávat s naměřeným stavem. Při následujícím probírání případů nestandardního vykreslování píků proto budou vždy uvedeny normální tvary píků a poté jejich nestandardní podoba. Správný tvar, ale nesprávná velikost píků může nastat ve dvou případech. V prvním případě se píky neobjeví vůbec. V tomto případě může jít o nefunkční měřící část detektoru (např. vypnutý zdroj záření) nebo o zastavený průtok mobilní fáze, kdy se vzorek do kolony vůbec nedostane nebo se vzorek nedostal do kolony, protože se nepovedl nástřik (vzorek unikl ze stříkačky, vzorek protekl ven z nástřikového členu, ). V druhém případě se sice píky objeví, ale jejich velikost je výrazně menší než je běžné. V tomto případě může jít o citlivost detektoru nastavenou na příliš nízkou hodnotu nebo netěsnost chromatografického systému, kdy část vzorku unikne spolu s unikající mobilní fází. Oba uvedené případy můžete vidět na obr. 29. a) b) c) Obr. 29: Správný tvar, ale nesprávná velikost píků: a) normální píky, b) žádné píky, c) menší píky 24

25 Ztráta rozlišení může nastat v případě, že poklesne dělící schopnost kolony. K tomu může dojít například, pokud je použita mobilní fáze kontaminovaná jinou mobilní fází nebo pokud je mobilní fáze vyčerpaná. Také k tomu může dojít, pokud dojde k mechanickému zanesení kolony či předkolony a je tak omezena jejich průchodnost. Příklad chromatogramu při ztrátě rozlišení je na obr. 30. a) b) Obr. 30: Ztráta rozlišení chromatografických píků: a) normální píky, b) ztráta rozlišení Proměnné retenční časy jsou dobře pozorovatelné po delší době používání chromatografického systému. Je-li analyzován stejný standard, jsou veškeré změny v retenčních časech krásně pozorovatelné. Mohou být způsobeny například netěsnostmi v systému nebo změnami v složení mobilních fází (neplatí pro izokratickou eluci). Dále může být příčinou změna teplot v koloně, přetížení kolony, které zkrátí retenční čas pozdějších složek nebo rozpouštědlo vzorku, které je nekompatibilní s použitou mobilní fází. V tomto případě je vzorek unášen s kapičkami rozpouštědla a k jeho přechodu do mobilní fáze dojde jen v omezené míře. V dlouhodobém horizontu je častou příčinou změny retenčních časů pozvolná deaktivace stacionární fáze, která vyřazuje část kolony z činnosti nebo způsobuje slabší interakce eluentu se stacionární fází. Retenční časy se tehdy zkrátí. Příklady změn retenčních časů jsou na obr. 31. a) b) c) Obr. 31: Proměnné retenční časy: a) normální píky, b) zkrácené retenční časy, c) prodloužené retenční časy Dělené píky se mohou v chromatogramu objevit, pokud je v systému výrazný mrtvý prostor, tj. prostor, kde dochází k pozastavení toku mobilní fáze a ta tam po určitou dobu setrvává a může působit jako past na analyt. Další možnou příčinou je blokovaný vstup do kolony nebo nekompatibilita rozpouštědla vzorku s mobilní fází, kdy se analyt jen postupně dostává z jedné fáze do druhé. Příklady dělených píků jsou na obr. 32. a) b) Obr. 32: Rozdělení píků stejné látky: a) normální píky, b) rozdělené píky 25

26 Chvostující píky jsou častým úkazem indikujícím opotřebenou částečně deaktivovanou kolonu. Dalšími důvody, proč se mohou objevit, jsou nevhodná kombinace stacionární a mobilní fáze, vzorek reagující s aktivními centry stacionární fáze, mrtvý prostor na vstupu do kolony nebo nevhodné rozpouštědlo pro naředění vzorku. Příklad chvostujícících píků je na obr. 33. Pokud je příčinou opotřebená kolona, lze ji někdy vyčistit a reaktivovat vhodnou kombinací mobilních fází. Pokud takový postup nezabere, je nutná její výměna. Všimněte si, že chvost deformuje sestupnou část píku. a) b) Obr. 33: Chvostující píky: a) normální píky, b) píky s chvostem Deformované čelo píku indikuje přetíženou kolonu, rozpouštědlo vzorku nekompatibilní s mobilní fází nebo přítomnost dalšího píku v eluovaném píku. Poslední jmenovaná příčina může být zaměněna i za jiné nestandardní píky jako třeba za ztrátu rozlišení nebo chvostující píky, ale zatímco při ztrátě rozlišení jsou píky pravidelně tvarované, u chvostujících píků je deformována sestupná část píku, u deformovaného čela jde právě o deformaci vzestupné části píku. Příklad deformovaného čela píku můžete vidět na obr. 34. a) b) Obr. 34: Deformované čelo píku: a) normální píky, b) píky s deformovaným čelem Zaoblené píky vypadají jako zakrslí a obloustlí příbuzní normálních píků. Obvykle postrádají špičku ve vrcholu píku, ale jejich tvar je souměrný. Důvodem pro vznik takovýchto píků může být činnost detektoru mimo jeho lineární dynamický rozsah, nastavení nízkého zesílení signálu detektoru, přetížení kolony nebo nevhodně nastavené parametry detektoru, což se může projevit na příliš vysoké časové konstantě. Příklad zaoblených píků je na obr. 35. a) b) Obr. 35: Zaoblené píky: a) normální píky, b) zaoblené píky 26

27 Píky duchové se objevují, pokud se do analýzy dostane nečistota původem j předchozích analýz. To se může stát pokuj je nástřikový člen nebo kolona znečištěny látkami, které při předchozích analýzách neeluovaly. Změnou podmínek může dojít k jejich uvolnění. Dalším možným zdrojem znečištění jsou zbytky po předchozí analýze, které kvůli předčasnému ukončení předchozí analýzy neopustily kolonu a eluují tak spolu s dalším vzorkem. Jedno z možností jak identifikovat znečištěný nástřikový člen je nástřik čistého rozpouštědla jak je to na obr. 36. a) b) c) Obr. 36: Píky duchové : a) předchozí vzorek, b) nástřik čistého rozpouštědla normální průběh, c) nástřik čistého rozpouštědla znečištěný nástřikový člen Negativní píky se objevují, pokud se do detektoru dostane něco, s čím se původně nepočítalo. Pojmem negativní pík je myšlen pík, který se nenachází nad úrovní základní linie, jak je to běžné, ale naopak pod úrovní základní linie. Příkladem může být analyt s indexem lomu menším, než je index lomu použité mobilní fáze v RI detektoru. Dalším příkladem je analyt s UV absorbancí menší, než je absorbance použité mobilní fáze v UV detektoru. V těchto případech je možné provést analýzu včetně kvantifikace a negativní píky nemusí být vnímány jako problém. V jiných případech jsou však negativní píky způsobeny chybou v měřícím systému a rozhodně nemohou být součástí analýzy. Příkladem zde může být nekompatibilita rozpouštědla vzorku s mobilní fází, kdy kapičky rozpouštědla se chovají v detektoru jako analyt s jinými vlastnostmi než mobilní fáze a jsou detektorem zaznamenány. Dalším příkladem mohou být mikroskopické bublinky vzduchu, které se mohou do systému dostat s nástřikem a proputují chromatografickým systémem až do detektoru obvykle těsně před vzorkem. V RI detektoru pak způsobují tvorbu negativních píků. Příklad negativního píku je na obr. 37. a) b) Obr. 37: Negativní píky: a) normální píky, b) negativní pík Aplikace kapalinové chromatografie v analýze paliv V této kapitole budou představeny některé analytické metody využívající techniky kapalinové chromatografie a přímo či nepřímo používané pro analýzu paliv. U metod, které jsou popsány v normách, bude tato norma uvedena. 27

28 Skupinové složení středních destilátů preparativní LSC Touto metodou je možné poměrně jednoduše a s malými náklady stanovit skupinové složení středních ropných frakcí neobsahujících biosložky. Tento typ separací má velkou výhodu v jednoduchosti provedení a nenáročností na vybavení laboratoře. Na druhou stranu správné provedení vyžaduje zkušenou a svědomitou obsluhu. Velkou nevýhodou je také poměrně dlouhá doba celé analýzy. Chromatografie je prováděna ve skleněné koloně přibližné délky 80 cm a vnitřního průměru 1 cm naplněné aktivovanou aluminou, která je vidět na obr. 38. Chromatografie je postupná a je charakterizována svým elučním schématem, což znamená složením a množstvím jednotlivých mobilních fází. Na vrchní část sloupce sorbentu se nastřikuje 1 g vzorku, který se nechá vsáknout a následuje eluce. Eluční schéma pro uvedenou kolonu je v tab. 5. Pro urychlení toku mobilní fáze se může mírně tlačit dusíkem. Eluované frakce jsou na výstupu z kolony jímány do odměrného válce a přelity do baniček. Po separaci je nutné z baniček odpařit mobilní fázi a zvážit jednotlivé frakce. Obr. 38: Kolona pro preparativní LSC Tab. 5: Eluční schéma preparativní LSC pro skupinové složení středních destilátů Složení mobilní fáze Množství mobilní Charakter eluované fáze (cm 3 ) skupiny n-pentan 50 Nasycené uhlovodíky n-pentan:dichlormethan (93:7 obj.) 60 Monoaromáty n-pentan:dichlormethan (88:12 obj.) 60 Diaromáty dichlormethan 50 Polyaromáty 28