A B CICP standardy: položky po 0,75 ml (A = 0, B = 1, C = 2, D = 5, E = 20, F = 80 ng/ml) E konzervační prostředek. F

Transkript

1 E konzervační prostředek. F Enzymový imunologický test pro stanovení koncentrace C-terminal propeptidu kolagenu typu I (CICP) v séru Pouze pro výzkumné účely. Není určeno pro diagnostické použití. RYCHLÝ NÁVOD K PROVEDENÍ STANOVENÍ 1. Přidejte 100 µl standardů, kontrol a vzorků (vzorky zředěné v poměru 1:12). 2. Nechte inkubovat 120 ± 5 minut při teplotě C. 3. Propláchněte 3-krát promývacím pufrem 1X. 4. Přidejte 100 µl králičí protilátky proti CICP. 5. Nechte inkubovat minut při teplotě C. 6. Propláchněte 3-krát promývacím pufrem 1X. 7. Přidejte 100 µl enzymového konjugátu. 8. Nechte inkubovat minut při teplotě C. 9. Propláchněte 3-krát promývacím pufrem 1X. 10. Přidejte 100 µl roztoku pracovního substrátu. 11. Nechte inkubovat minut při teplotě C. 12. Přidejte 50 µl ukončovacího roztoku a odečtěte hodnotu optické hustoty při 405 nm. SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ Kolagen je molekula s trojitou šroubovicí, která tvoří vláknitou strukturu všech pojivových tkání. Kolagen je syntetizován jako prokolagen - větší prekurzorová molekula. Tento se skládá ze zralého kolagenu s vedlejšími peptidovým řetězcem na amino i karboxy koncích. Tyto vedlejší peptidy, nebo-li propeptidy, jsou před začleněním kolagenu do rostoucího kolagenního vlákna vyštěpeny z molekuly kolagenu specifickými proteázami. Uvolnění těchto peptidů do cirkulace poskytuje stechiometrické údaje o tvorbě kolagenu. PRINCIP Metra CICP je sendvičová enzymová imunochemická reakce probíhající ve formátu mikrotitru na proužku, kdy se koncentrace CICP v lidském séru určí pomocí monoklonální protilátky proti CICP nanesené na proužku, králičího antiséra proti CICP, konjugátu kozí protikráličí protilátky a alkalické fosfatázy, a pnpp substrátu. DODANÝ MATERIÁL A REAGENCIE 96 testů ke stanovení koncentrace C-terminal propeptidu kolagenu typu I v séru Souprava Metra CICP EIA obsahuje: A B CICP standardy: položky po 0,75 ml (A = 0, B = 1, C = 2, D = 5, E = 20, F = 80 ng/ml) C D CICP purifikovaný z lidských buněk fibroblast ů v pufrovém roztoku obsahujícím neiontový detergent, stabilizátor a azid sodný (0,05%) jako

2 L Vysoká/nízka kontrola položky 4144, 4145 po 0,75 ml CICP purifikovaný z lidských buněk fibroblastů v pufrovém roztoku H obsahujícím neiontový detergent, stabilizátor a azid sodný (0,05%) jako konzervační prostředek Potažené proužky položka 4672 po 12 ks Purifikovaná myší monoklonální protilátka proti CICP adsorbovaná na proužcích. Ukončovací roztok položka ml 1N NaOH Promývací pufr 10X položka ml Neiontový detergent v pufrovém roztoku obsahující azid sodný (0,05%) jako konzervační prostředek Substrát pro stanovení položka ml Pufrový roztok s obsahem neiontového detergentu, stabilizátoru a azidu sodného (0,05%) jako konzervačního prostředku Substrátový pufr položka ml Roztok dietanolaminu a chloridu horečnatého s obsahem azidu sodného (0,05%) jako konzervačního prostředku Substrátové tablety položka x 20 mg p-nitrofenyl fosfát Enzymový konjugát položka ampulky Lyoflizovaná kozí protikráličí IgG protilátka konjugovaná s alkalickou fosfatázou s obsahem pufrovaných solí a stabilizátorů. Králičí protilátka proti CICP položka ml Králičí polyklonální protilátka proti CICP v pufrovém roztoku obsahujícím neiontový detergent, stabilizátor a azid sodný (0,05%) jako konzervační prostředek MATERIÁL DODÁVANÝ ZVLÁŠŤ Mikropipety na µl Pomůcky vhodné k měření objemu v rozsahu ml Zkumavky na ředění vzorků Nádobka na ředění promývacího pufru Deionizovaná nebo destilovaná voda Snímač proužků schopný snímat optickou hustotu při vlnové délce 405 nm Software pro aproximaci kalibrační křivky se 4 parametry UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ 1. Pouze pro výzkumné účely. Není určeno pro diagnostické použití. 2. Se vzorky nakládejte, jako by byly potenciálně infekční. Při práci se všemi komponenty a vzorky od pacientů se řiďte obecnými pravidly bezpečnosti práce. 3. Nádoby a jejich nepoužitý obsah likvidujte v souladu s federálními, státními a místními předpisy. 4. Dodané reagencie použijte jako ucelenou soupravu před datem expirace vyznačeném na štítku na obalu. 5. Reagencie skladujte v souladu s uvedenými pokyny. 6. V případě že je sáček propíchnutý, potažené proužky nepoužívejte. 7. Každý vzorek stanovte dvojmo. 8. 1N NaOH má korosivní účinek a může způsobit vážné popáleniny. Nepožívejte. Zamezte kontaktu s kůží, očima a oblečením. Zasažené místo opláchněte vodou. Po požití vyhledejte lékaře. 9. Jako konzervační prostředek byl použit azid sodný. Náhodné požití nebo kontakt s pufrem obsahujícím azid sodný může způsobit podráždění kůže, očí a úst. Pufry používejte pouze k určenému účelu a zamezte kontaktu s kyselinami. Azid sodný může reagovat s olovem nebo mědí za vzniku vysoce výbušných azidů kovů. Likvidovaný materiál proto spláchněte větším množstvím vody, aby se zabránilo nahromadění azidu. 10. Vzorky s koncentraci přesahující 80 ng/ml rozřeďte v pufru pro stanovení a stanovení opakujte. 11. K zajištění včasného přísunu reagencií se doporučuje použít pipety s více kanálky nebo opakovací pipetovací přístroj.

3 12. Aby stanovení vzorku proběhlo správně, je třeba přidávat přesné množství vzorku a standardu. Pipetujte pečlivě a používejte pouze kalibrované příslušenství. 13. Při tomto stanovení je možné použít jakoukoliv schválenou metodu promývání. 14. Pokud není možné udržet teplotu místnosti mezi C a absorbance > 2,0 se neshoduje s údajem na vašem snímači, sledujte vývoj substrátu v zásobnících se standardem F. Když optická hustota dosáhne hodnoty 1,2-1,5, reakci ukončete a proužky odečtěte. 15. Standardy, kontroly a vzorky přidejte do zásobníků do 30 minut. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ Před použitím nechte teplotu všech reagencií ustálit na C. Potažené proužky Ze sáčku vyjměte stojánek s proužkovými zásobníky a požadovaný počet potažených proužků (viz tabulka v části POSTUP STANOVENÍ). Sáček obsahující nepoužité proužky poté důkladně uzavřete. Promývací pufr Zředěním koncentrovaného promývacího pufru 10X v poměru 1:10 deionizovanou vodou připravte požadované množství promývacího pufru 1X (viz tabulka). Skladujte při teplotě C. Promývací pufr 1X spotřebujte do 21 dní od přípravy. Enzymový konjugát Enzymový konjugát připravte nejvýše 2 hodiny před použitím. Každou potřebnou ampulku enzymového konjugátu (viz tabulka) rekonstituujte přidáním 7 ml promývacího pufru 1X. Granulku nechte úplně rozpustit. Nepoužitý enzymový konjugát zlikvidujte. Roztok pracovního substrátu Roztok pracovního substrátu připravte nejvýše 1 hodinu před použitím. Do každé lahve se substrátovým pufrem o teplotě C vložte po jedné substrátové tabletě (viz tabulka). Tablety nechte rozpouštět minut. Lahve důkladně protřepejte, aby se obsah dokonale promíchal. Nespotřebovaný roztok pracovního substrátu zlikvidujte. SKLADOVÁNÍ Soupravu skladujte při teplotě 2-8 C. Nepoužité reagencie skladujte při teplotě 2-8 C. Promývací pufr 1X (zřed ěný 10X) skladujte při teplotě C. ODEBÍRÁNÍ A PŘÍPRAVA VZORKŮ Sérum odebírejte standardní venepunkcí. Vzorky odebírejte bez použití činidel proti srážlivosti a takovým způsobem, aby nedošlo k hemolýze. Krev nechte vysrážet a odstřeďte sérum. Sérum lze skladovat 5 dní při teplotě 2 8 C, při delším skladování zmrazte na teplotu -20 C Vzorky opakovaně nerozmrazujte a nezmrazujte více než třikrát. POSTUP STANOVENÍ Před zahájením stanovení si přečtěte celý návod. Před uskutečněním testu si přečtěte PŘÍPRAVU REAGENCIÍ. Podle počtu proužků, které budete používat, stanovte potřebné množství jednotlivých reagencií. Počet proužků Počet vzorků (stanovených dvojmo) Enzymový konjugát (ampulka) 1 1 2* 2* Substrát (láhev) 1 1 2* 2* Promývací pufr 1X (ml) * Při použití více než jedné lahve nebo ampulky smíchejte před použitím jejich obsah a důkladně promíchejte. Ředění a inkubace vzorků 1. Vzorky séra zřeďte pufrem pro stanovení v poměru 1:12 (např. 25 µl séra µl pufru pro stanovení). 2. Před otevřením nechte teplotu sáčku s potaženými proužky ustálit na C. Vyjměte ze sáčku stojánek s proužkovými zásobníky a požadovaný počet potažených proužků (viz tabulka). Sáček s nepoužitými proužky poté důkladně uzavřete. V sáčku musí být pohlcovač vlhkosti. 3. Požadovaný počet potažených proužků vložte do zásobníkového stojánku. Proužky označte, aby při jejich náhodném uvolnění ze stojánku nedošlo k jejich záměně. 4. Do každého zásobníku na potažené proužky přidejte 100 µl standardu, kontroly nebo zředěného vzorku séra.tento krok je třeba ukončit do 30 minut. 5. Nechte inkubovat 120 ± 5 minut při teplotě C. Promývání (1) 6. Zředěním koncentrovaného promývacího pufru 10X v poměru 1:10 deionizovanou vodou připravte požadované množství promývacího pufru 1X (viz tabulka). Skladujte při teplotě C. Promývací pufr 1X spotřebujte do 21 dní od přípravy. 7. Proužky ručně obraťte/vyberte. Do každého zásobníku přidejte Inkubace protilátky 8. Do každého zásobníku přidejte 100 µl králičí protilátky proti CICP. 9. Nechte inkubovat minut při teplotě C. 10. Během inkubace si připravte enzymový konjugát. Každou potřebnou ampulku (viz tabulka) s enzymovým konjugátem rekonstituujte přidáním 7 ml promývacího pufru 1X. Důkladně promíchejte. Spotřebujte do 2 hodin. Promývání (2) 11. Proužky ručně obraťte/vyberte. Do každého zásobníku přidejte Inkubace enzymového konjugátu 12. Do každého zásobníku přidejte 100 µl rekonstituovaného enzymového konjugátu. 13. Nechte inkubovat minut při teplotě C. 14. Během inkubace si připravte roztok pracovního substrátu. Do každé potřebné lahve substrátového pufru o teplotě C (viz tabulka) dejte jednu substrátovou tabletu. Tablety nechte minut rozpouštět. Lahve řádně protřepejte, aby se jejich obsah důkladně promíchal. Spotřebujte do jedné hodiny. Promývání (3) 15. Proužky ručně obraťte/vyberte. Do každého zásobníku přidejte Inkubace substrátu 16. Do každého zásobníku přidejte 100 µl roztoku pracovního substrátu. 17. Nechte inkubovat minut při teplotě C. Pokud teplotu místnosti nelze udržet na uvedené teplotě, přečtěte si bod 14 v části UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ. Ukončení/Odečtení 18. Do každého zásobníku přidejte 50 µl ukončovacího roztoku. 19. Odečtěte optickou hustotu při 405 nm. V zásobnících nesmí být žádné větší bublinky a spodek proužků musí být čistý. Proužky je nutno odečíst do 15 minut od přidání ukončovacího roztoku. 20. Výsledky testu Metra CICP analyzujte pomocí softwaru s rovnicí aproximace kalibrační křivky se 4 parametry (viz níže).

4 Optical Density (405 nm) Rovnice: y = (A-D)/(1+(x/C)^B)+D 21. Z kalibrační křivky odečtete koncentraci vzorků a kontrol. 22. Kontrolní hodnoty se mají nacházet v rámci rozmezí uvedeného v certifikátu analýzy, který je součástí dodávky. KONTROLA KVALITY Certifikát analýzy přiložený k této soupravě je specifický pro danou šarži a slouží k ověření, zda jsou výsledky naměřené ve vaší laboratoři obdobné jako výsledky získané ve společnosti Quidel. Uvedené jsou hodnoty optické hustoty a mají sloužit pouze jako vodítko. Výsledky stanovené vaší laboratoři se mohou lišit. Rozmezí hodnot pro kontrolu kvality jsou rovněž uvedena. Kontrolní hodnoty mají sloužit ke kontrole správnosti křivky a hodnot naměřených ve vzorku. Každá laboratoř si má určit vlastní parametry přijatelného rozmezí výsledků stanovení. Pokud se kontrolní hodnoty nachází MIMO přijatelného rozmezí určeného vaší laboratoří, výsledky stanovení je nutné pokládat za nevěrohodné a stanovení vzorku je třeba opakovat. Pokud je hodnota optické hustoty standardu F testu Metra CICP menší než 0,8, výsledky stanovení je nutné pokládat za nevěrohodné a stanovení vzorku je třeba opakovat. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ U stanovené koncentrace vzorku je třeba zohlednit ředění. Když byl vzorek zředěn v poměru 1:12, vynásobte hodnotu v ng/ml krát 12 a dostanete výslednou koncentraci CICP v séru v ng/ml. Typická kalibrační křivka Standardní koncentrace CICP: 0, 1, 2, 5, 20, 80 ng/ml CICP (ng/ml) PŘÍKLAD NAMĚŘENÝCH HODNOT Provedli jsme stanovení 279 vzorků od dospělých jedinců ve věku od 25 let a výsledky získané pomocí testu Metra CICP se pohybovaly v rozmezí ng/ml. Při stanovení 370 vzorků od dětí ve věku 4-18 let se koncentrace CICP pohybovala od 110 do 966 ng/ml, střední hodnota koncentrace CICP byla 326 ng/ml. Naměř ené hodnoty můžou ovlivňovat faktory jako jsou růst, nedostatečná tvorba estrogenu, nedostatečný přísun vápníku nebo nedostatek pohybu. Nedostatek estrogenu u žen v postmenopauzálním období může vyústit v nadměrnou přestavbu kostí a tvorbu kolagenu. Každá laboratoř by si měla stanovit svoje vlastní normální referenční rozmezí. ZNAKY TESTU Specificita protilátek Protilátky proti CICP byly vypěstovány vůči CICP odvozenému z lidských fibroblastických buněk v kultuře. Tyto protilátky vykazují 100% zkříženou reaktivitu s CICP v lidském séru. Hranice stanovení Minimální množství CICP zjistitelné pomocí testu Metra CICP je 0,2 ng/ml a bylo stanoveno horní hranicí 3 standardních odchylek v studii nulového standardu. Přesnost Přesnost v rámci stanovení a mezi jednotlivými stanoveními byla určena na třech vzorcích séra. Charakteristické výsledky se nachází v následujícíc tabulce. Variační koef. Variační koef. mezi v rámci jednotlivými CICP (ng/ml) stanovení 1 stanoveními 2 (%) (%) 80,8 6,8 7,0 98,1 5,5 7,2 296,7 6,6 5,0 Zpětná výtěžnost - linearita 1 n = 20 replikátů 2 n = 3 v 3 testech Linearita byla určena sériovým řed ěním vzorků a porovnáním naměřených hodnot s hodnotami o čekávanými. Charakteristické výsledky jsou uvedeny v následující tabulce. Vzorek Poměr Naměřená Očekávaná Zpětná ředění hodnota hodnota výtěžnost (ng/ml) (ng/ml) (%) 1 1:12 6, :24 3,50 3, :48 1,74 1, :12 13, :24 6,56 6, :48 3,49 3, :12 20, :24 10,43 10, :48 5,57 5, Zpětná výtěžnost zpětná výtěžnost s přídavkem Zpětná výtěžnost s přídavkem byla stanovena přidáním známého množství purifikovaného CICP do vzorků séra s různým množstvím endogenního CICP. Charakteristické výsledky jsou uvedeny v následující tabulce. Naměřená Zpětná Endogenní Přídavek Vzorek hodnota výtěžnost (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) (%) 1 9,09 13,24 22, ,77 45, ,34 13,10 13, ,71 43, ,43 13,24 22, ,77 41,55 102

5 ODKAZY 1. Centers for Disease Control. Recommendations for prevention of HIV transmission in health-care settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S): Melkko J, Niemi S, Risteli J. Radioimmunoassay of the carboxy terminal propeptide of human type I procollagen. Clin.Chem. 1990;36: Parfitt AM, Simon LS, Villanueva AR, Krane SM. Procollagen type I carboxy-terminal extension peptide in serum as a marker of collagen biosynthesis in bone: Correlation with iliac bone formation rates and comparison with total alkaline phosphatase. J.Bone.Miner.Res. 1987;2: Saggese G, Bertelloni S, Baroncelli GI, Di Nero G. Serum levels of carboxy-terminal propeptide of type I procollagen in healthy children from first year of life to adulthood and in metabolic bone diseases. Eur.J.Pediatr. 1992;151: Simon LS, Krane SM, Wortman PD, Krane IM, Kovitz KL. Serum levels of type I and III procollagen fragments in Paget s disease of bone. J.Clin.Endocrinol.Metab. 1984;58: Trivedi P, Risteli J, Risteli L, Hindmarsh PC, Brook CG, Mowat AP. Serum concentrations of type I and III procollagen propeptides as biochemical markers of growth velocity in healthy infants and children and in children with growth disorders. Pediatr.Res. 1991;30: Winterbottom N, Vernon S, Freeman K, Daniloff GY, Garnero, P, Seyedin S. A serum immunoassay for the C-terminal propeptide of type I collagen. J.Bone.Miner.Res. 1993;8:S341. (abst) TECHNICKÁ PODPORA S objednávkou, nebo žádostí o technickou podporu, se, prosím, obracejte na zástupce firmy Quidel na č ísle nebo , od pondělí do pátku mezi 8:00 a 17:00 (tichomořské časové pásmo). Objednávky lze také faxovat na číslo Mimo území Spojených států Vám služby poskytne Váš místní prodejce. KATALOGOVÉ Č. REF 8003 Metra CICP EIA Kit AUTORIZOVANÝ ZÁSTUPCE Quidel Deutschland GmbH Betrieb Marburg Emil-v.-Behring-Straße 76 Gebäude M Marburg QUIDEL CORPORATION Worldwide Headquarters McKellar Court San Diego, CA USA G (2003/12) BIOVENDOR LABORATORNÍ MEDICÍNA A.S. Karásek 1767/1, Brno, Česká republika Tel: info@biovendor.cz