Mikrobiologické stanovení kvality vody ve studních v obci Brnířov

Transkript

1 TALNET 2009 Mikrobiologické stanovení kvality vody ve studních v obci Brnířov Jana Pilátová Gymnázium J. Š. Baara, Domažlice Konzultant:: RNDr. Blanka Zikánová Katedra mikrobiologie a genetiky Přírodovědecká fakulta UK, Praha

2 Obsah 1 ÚVOD VODA A MIKROORGANISMY MIKROBIOLOGICKÉ ZNEČIŠTĚNÍ ENTEROBAKTERIE KOLIFORMNÍ BAKTERIE Escherichia coli NEKOLIFORMNÍ BAKTERIE METODY PRO IDENTIFIKACI BAKTERIÍ PŘÍMÉ METODY KULTIVAČNÍ A BIOCHEMICKÉ IDENTIFIKAČNÍ METODY MIKROBIOLOGICKÉ UKAZATELE JAKOSTI VOD LIKVIDACE MIKROBIÁLNÍ KONTAMINACE STUDNIČNÍCH VOD CÍLE PRÁCE MATERIÁL A METODIKA MATERIÁL POPIS LOKALITY A VZORKY VOD KULTIVAČNÍ MÉDIA DALŠÍ POUŽITÝ MATERIÁL METODIKA STERILIZACE SKLENIČEK POUŽITÝCH PRO TRANSPORT VZORKŮ PŘÍPRAVA MIKROSKOPICKÉHO PREPARÁTU MEMBRÁNOVÁ FILTRACE STANOVENÍ POČTU BAKTERIÍ VÝSEVEM NA PEVNÁ KULTIVAČNÍ MÉDIA POČÍTÁNÍ KOLONIÍ IZOLACE A ŘEDĚNÍ ČISTÉ KULTURY NA MISCE IDENTIFIKACE BAKTERIÍ LIKVIDACE ODPADŮ VÝSLEDKY SBĚR DAT PRO VÝBĚR LOKALITY ODBĚRU VZORKŮ STUDNIČNÍCH VOD MIKROBIOLOGICKÁ ANALÝZA ODEBRANÝCH VZORKŮ ORIENTAČNÍ STANOVENÍ POČTU MIKROORGANISMŮ STANOVENÍ CHEMOORGANOTROFNÍCH BAKTERIÍ STANOVENÍ ENTEROBAKTERIÍ A KOLIFORMNÍCH BAKTERIÍ STANOVENÍ KOLIFORMNÍCH BAKTERIÍ METODOU MEMBRÁNOVÉ FILTRACE STANOVENÍ TERMOTOLERANTNÍCH KOLIFORMNÍCH BAKTERIÍ SOUHRNNÝ PŘEHLED VÝSLEDKŮ KVANTIFIKACE BAKTERIÍ VÝBĚR KOLONIÍ A JEJICH IDENTIFIKACE DISKUSE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY A INTERNETOVÝCH ADRES PŘÍLOHA

3 1 Úvod Nejednou jsem se zamýšlela nad tím, proč naše domácnost neodebírá vodu ze studně, kterou máme nedaleko domu, ale pijeme vodu z vodovodu. Šla jsem na obecní úřad, kde jsem zjistila, že většina občanů Brnířova pije rovněž vodu z vodovodu, ale pak tu jsou i tací, kteří vůbec nejsou na vodovod připojeni a jako zdroj pitné vody používají své studny, nebo jiní, kteří sice k vodovodu připojeni jsou, ale stále čerpají vodu k pití ze studny a mohou přepínat mezi studniční vodou a vodou z vodovodu. Používání vody ze studny má bezesporu své finanční výhody, lidé nemusí platit vodné a stočné, v podstatě je studniční voda nic nestojí krom elektrické energie čerpadla. Za vodu odebíranou ze studně by museli platit, přesáhl-li by jejich odběr 500 m 3 za měsíc, ale tato cena by stále byla podstatně nižší než cena vody z vodovodu (osobní sdělení V. Valečka). A navíc odběr vody ze studny nikdo neměří a také není nikdo, kdo by to kontroloval, jak říká starosta obce Václav Valečka. Ale závislost na studniční vodě má i své nevýhody. Jen sám majitel může nechat kontrolovat její kvalitu, rozbor vody je poměrně drahý (přibližně tisíc korun, ale kompletní rozbor může stát i deset tisíc a více), je to jednorázová zkouška jakosti vody, která dokáže zhodnotit pouze současný stav. Vyhláškou č. 252/2004 Sb. je stanoveno povinné vyšetření jakosti vody jednou ročně, ale většina lidí to buď neví, nebo to ignoruje, rozbor vody se jim zdá příliš drahý. Pokud se voda ve studni nějakým způsobem znečistí (biologicky nebo chemicky), nastává velký problém, protože dotyčný majitel ztratil zdroj pitné vody. Tento problém nastává rovněž, klesne-li hladina spodní vody natolik, že se voda ze studny ztratí. Proto je dobré mít v záloze vždy nějaké alternativní řešení. Zajímal mě stav vody tak, jak je odebírána a konzumována, proto jsem její vzorky odebírala z kohoutku nebo přímo ze studny. Pro posuzování kvality vody jsem si vybrala mikrobiologické hledisko. Fyzikální znečištění je pozorovatelné okem, je vidět, že voda je zakalená. Biologické znečištění je také docela dobře patrné, ve vodě rostou řasy, plavou tam drobní živočichové apod. Voda, která nevyhovuje po své chemické stránce, může divně chutnat, v člověku se může projevit otravou apod. Nejzajímavější je však voda pozorovaná mikrobiologickým prizmatem. Mikroorganismy, které přirozeně žijí ve vodě, můžou leckdy ohrožovat lidské zdraví. Bakterie nejsou pouhým okem viditelné, o to jsou však nebezpečnější. Je to skrytá hrozba, nikdy si nemůžeme být jisti tím, co pijeme, pokud neurčíme jakost vody po mikrobiologické stránce. 1.1 Voda a mikroorganismy Voda je přirozeným životním prostředím pro mnoho druhů organismů a samozřejmě i mikroorganismů a bakterií. Řada mikroorganismů nepředstavuje pro člověka významné zdravotní riziko. Naopak výskyt některých druhů mikroorganismů a bakterií ve vodě může mít velice neblahé dopady na zdraví. 1.2 Mikrobiologické znečištění Enterobakterie Zástupci čeledi Enterobacteriaceae jsou rozšířeni po celém světě ve vodě, v půdě, na rostlinách a v živočiších. Jsou to peritrichální tyčinky tzn., že mají bičíky po celém povrchu buňky. Enterobakterie jsou z 50 % zodpovědné za nozokomiální (nemocniční) infekce, většinou způsobené Escherichia coli, a zástupci některých dalších rodů. (Rosypal, 2003) Koliformní bakterie Koliformní bakterie jsou gramnegativní nesporulující aerobní nebo fakultativně anaerobní tyčinky, které mají schopnost fermentovat laktózu při teplotě C za vzniku plynů, kyselin a aldehydů během hodin. WHO (Světová zdravotnická organizace) uvádí negativní reakci koliformních bakterií na cytochromoxidázu. Po zjištění, že na Endově půdě rostou 3

4 i jiné bakterie než E. coli, které ale mají podobný habitus jako např. Enterobacter aerogaenes, začaly se další bakterie podobné E. coli nazývat coli-aerogenes, což dalo vzniknout dnes používanému označení coliform neboli česky koliformní. Za koliformní se v současnosti považují rody z čeledi Enterobacteriaceae, jsou to Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. (Říhová Ambrožová, 2007) Např. Klebsiella pneumoniae příležitostně způsobuje pneumonii (zánět plic) a infekci močových cest. Enterobacter aerogenes je tzv. oportunním patogenem 1, který se vyskytuje v půdě, vodě a zažívacím ústrojí a může vyvolat infekci močových cest nebo meningitidu. (Rosypal, 2003) Escherichia coli E. coli se vyskytuje jako běžný komenzál 2 v tlustém střevě člověka a jiných savců. Jedná se o skupinu koliformních bakterií se schopností tvořit indol z tryptofanu (důležitá schopnost pro konfirmační testy). V lidských a zvířecích exkrementech představuje E. coli podíl 90 až 100 % celkových izolovaných bakterií. Ve splaškách a znečištěné vodě klesá podíl na 59 %. E. coli dokáže ve vodě přežívat řadu týdnů. Od roku 1993 jsou dle směrnic WHO presumptivní E. coli jediným správným a vyhovujícím indikátorem fekálního znečištění vody, i když jiné patogeny mohou ve vodě přežívat i mnohem déle. Některé kmeny E. coli vyvolávají onemocnění močových cest, hnisavá onemocnění ran a průjmy, produkují enterotoxiny nebo mají i jiné faktory virulence, např. kapsulární antigen, adherence k střevnímu epitelu. (Rosypal, 2003; Bednář, 1996) Nekoliformní bakterie Druhů koliformních bakterií není mnoho, o to více je zástupců nekoliformních druhů čeledi Enterobacteriaceae. Patří sem např. velmi nebezpečné bakterie rodů Shigella, Salmonella, Yersinia, Providentia a další. Jejich společným fyziologickým znakem je neschopnost fermentace laktózy. Nebezpečnost některých z nich spočívá také ve schopnosti dlouhodobého přežívání ve vodě, např. Salmonella dokáže za příhodných podmínek přežívat ve vodě měsíce i roky. (Bednář, 1996) Řada druhů způsobuje u člověka průjmová onemocnění včetně tyfu vyvolaného Salmonellou typhi a bacilární dyzenterie (střevní úplavice) způsobené Shigellou dysenteriae. Druhy Salmonella typhimurium a Salmonella enteritidis způsobují entrokolitidy (akutní zánět tenkého a tlustého střeva), gastroenteritidy označované jako salmonelózy, které se často přenášejí z infikované osoby přes znečištěné potraviny nebo kontaminovanou vodou. (Rosypal, 2003) 1.3 Metody pro identifikaci bakterií Metody používané pro identifikaci bakterií jsou spolu se způsobem zpracování výsledků a jejich limitními hodnotami předepsané v normách. V praxi se provádějí dva typy rozborů, a to krácený a úplný. Krácený rozbor z mikrobiologického hlediska sestává minimálně z těchto ukazatelů: E. coli, koliformní bakterie, Clostridium perfringens (stanovuje se pouze u pitných vod upravovaných přímo z vod povrchových nebo u podzemních vod ovlivněných povrchovými vodami), počty kolonií při 22 C a 36 C, Pseudomonas aeruginosa (platí jen pro balenou pitnou vodu), mikroskopický obraz abioseston (viz níže), počet organismů, živé organismy. (Ambrožová, 2008) Přímé metody Mezi přímé metody identifikace bakterií patří mikroskopická analýza vzorku prostá jakékoli kultivace mikroorganismů. Tato metoda pracuje s nativním preparátem, může nám poskytnout informace o tvaru a uspořádání buněk, jejich pohyblivosti apod. 1 Mikroorganismus, který je součástí normální mikroflóry, v níž se neprojevuje jako patogen; vyvolává onemocnění jen za určitých podmínek (např. oslabí-li se imunita hostitelského organismu). 2 Mikroorganismus, který žije v hostiteli, aniž by mu způsoboval škodu. 4

5 1.3.2 Kultivační a biochemické identifikační metody Tato metoda pracuje s různými více či méně selektivními médii, která jsou vybírána podle výskytu bakterií a jejich předpokládaných růstových požadavků. Podle vzhledu bakteriálních kolonií lze usuzovat, do jakého rodu nebo čeledi by bakterie mohla teoreticky patřit, ale nelze to říct s naprostou jistotou, natož spekulovat o druhu. (Horáková, 2008) Kultivační půdy se dělí podle jejich likvidity na tekuté (pomnožovací), polotuhé a pevné (absorpční podložky). Tekuté kultivační půdy jsou ve zkumavkách, jejich výhodou je dobrá difúze živin. Běžná pomnožovací půda je např. játrový bujón (vývar z hovězího masa, pepton, NaCl, kostky jater). Pevná média standardně na Petriho miskách obsahují agar, díky němuž jsou pevná, a další látky sloužící jako výživa pro kultivované mikroorganismy (např. pepton, masový vývar, NaCl atd.). (Horáková, 2008) Biochemické identifikační metody jsou založeny na detekci bakteriálních metabolických produktů. Z definice koliformních bakterií vyplývá, že jejich společnou vlastností je zkvašování laktózy a tvorba indolu z tryptofanu. Pomocí souboru biochemických testů lze zařadit izolované bakterie s určitou pravděpodobností až do druhu. (Ambrožová, 2008) 1.4 Mikrobiologické ukazatele jakosti vod Pitná voda je v zákoně č. 274/2003 Sb., o předcházení vzniku a šíření infekčních onemocnění, definována jako zdravotně nezávadná voda, která ani při trvalém požívání nevyvolá onemocnění nebo poruchy zdraví přítomností mikroorganismů nebo látek ovlivňujících akutním, chronickým či pozdním působením zdraví fyzických osob a jejich potomstva, jejíž smyslově postižitelné vlastnosti a jakost nebrání jejímu požívání a užívání pro hygienické potřeby fyzických osob. Hygienické požadavky na pitnou a teplou vodu (viz tabulka č. 1) a četnost a rozsah kontroly pitné vody, tj. dodržení hygienických limitů mikrobiologických, biologických, fyzikálních a chemických ukazatelů pitné vody jsou stanoveny Vyhl. č. 252/2004 Sb. Tabulka č. 1: Mikrobiologické a biologické ukazatele pitné vody a jejich hygienické limity (Ambrožová, 2008) Ukazatel Jednotka Limit Typ limitu Escherichia coli KTJ/100 ml 0 NMH Koliformní bakterie KTJ/100 ml 0 MH Intestinální enterokoky KTJ/100 ml 0 NMH Počty kolonií při 22 C KTJ/ml 200 MH Počty kolonií při 36 C KTJ/ml 20 MH Clostridium perfringens KTJ/100 ml 0 MH Mikroskopický obraz abioseston 3 % 10 MH Mikroskopický obraz počet organismů Jedinci/ml 50 MH Mikroskopický obraz živé organismy Jedinci/ml 0 MH Vysvětlivky: NMH nejvyšší mezní hodnota; MH mezní hodnota 1.5 Likvidace mikrobiální kontaminace studničních vod Likvidace mikrobiální kontaminace a hygienické zabezpečení domácích studní se provádí aplikací přípravku Sagen (ČSN JK), který vzniká smísením stříbrné soli (oligodynamické působení sůl je jedovatá pro mikroorganismy, ale je neškodná pro člověka) s nadbytkem chloridu sodného. Ve vodě se rozpustí za vzniku bílého zákalu, který časem zfialoví. Dodává se ve skleněných rourách uzavřených zátkou s obsahem 10 g látky, ve které je minimálně 0,8 % obsahu stříbra. Používá se v koncentraci 1: Jedna ampulka stačí k zabezpečení 1 m 3 vody. Účinnost dezinfekce přípravkem lze zjistit na základě zkoušky biologické účinnosti při použití kontrolního kmene E. coli. (Ambrožová, 2003) 3 Abiosestonem je (dle normy ČSN ) míněn tzv. neživý materiál, který se stanovuje při mikroskopické analýze (např. částice anorganického původu, pozůstatky těl různých organismů). (Říhová Ambrožová, 2007) 5

6 1.6 Cíle práce Cílem mé práce bylo vyšetřit mikrobiologickou kvalitu vody ve studních v obci Brnířov, kde někteří lidé pijí vodu ze studní, jiní ji odebírají pouze sporadicky na zavlažování a zbylí ji neodebírají vůbec. Porovnat získané výsledky, jak se kvantitativně a kvalitativně liší jednotlivé vzorky v závislosti na míře využití studny, na vzdálenosti studny od septiku nebo její vzdálenosti od chovu domácích zvířat a v neposlední řadě konfrontovat získané výsledky s platnou legislativou, tj. zjistit, zda vyšetřené vzorky splňují limitní hodnoty Vyhl. č. 252/2004 Sb. pro počet životaschopných bakterií indikujících kvalitu pitné vody. 2 Materiál a metodika 2.1 Materiál Popis lokality a vzorky vod Brnířov je malá obec nacházející se v západních Čechách v okrese Domažlice (GPS lokace: N, E) v nadmořské výšce 460 m. Nyní v Brnířově žije kolem 335 obyvatel. Do připojení na vodovod v roce 1986 byli obyvatelé závislí na vodě ze svých studní, které byly budovány u každého stavení. Někteří z nich stále věří svému zdroji vody natolik, že se na obecní vodovod ještě nenapojili. Jiní se napojili, ale i tak stále pijí vodu ze své studně. Další čerpají vodu pouze na zalévání, používají ji jako užitkovou anebo i přes to, že studnu vlastní, ji vůbec nepoužívají. Bylo odebráno dvanáct vzorků vod (odběrová místa jsou vyznačena v Katastrální mapě obce Brnířov, viz příloha) ze studní v obci Brnířov v takové formě, v jaké ji majitelé nemovitostí používají. Voda využívaná jako pitná byla odebrána z kohoutku, voda užitková ze studně. K odběru vzorků přímo ze studně byla použita sklenice přivázaná na provaze, která byla mezi jednotlivými odběry vymývána sterilní vodou Kultivační média MacConkey agar č. 3 (code: CM0115; Oxoid Ltd, Basingstoke, UK) MacConkey agar (viz obr. č. 1, dále jen MC) má ph rovno 7,1±0,2. Je určený pro izolaci a diferenciaci gramnegativních střevních tyčinkovitých bakterií. Selektivita média spočívá v tom, že jsou částečně potlačeny grampozitivní bakterie (žlučové kyseliny, krystalová violeť), zvláště pak enterokoky a stafylokoky. Tato půda je doporučena American Public Health Assossiation pro přímý výsev vodních vzorků, např. E. coli. Bakterie kultivované na této půdě zkvašují laktózu jako zdroj uhlíku. Díky přítomnosti neutrální červeně a laktózy lze odlišit laktózu fermentující bakterie (tj. koliformní bakterie, např. E. coli, Citrobacter), jejichž kolonie vnímáme jako červené nebo růžové. Naproti tomu laktózu nefermentující bakterie (např. Salmonella, Shigella) tvoří bezbarvé kolonie. Charakteristické složení v 1000 ml vody Pepton pro bakteriologii Laktóza Žlučové soli Chlorid sodný Neutrální červeň Krystalová violeť Agar 20,0 g 10,0 g 1,5 g 5,0 g 30,0 mg 1 mg 15,0 g Živný agar č. 2 (IMUNA PHARM, a. s., Šarišské Michal any) Obr. č. 1: MacConkey agar Živný agar (viz obr. č. 2, dále jen ŽA) má neutrální ph, které se pohybuje kolem hodnoty 7,3 s odchylkou ±0,2. Toto médium je vhodné pro kultivaci nenáročných mikroorganis- 6

7 mů, hlavně pro bakterie vyšetřené z pitné nebo odpadní vody. Masový extrakt je zdroj dusíku, uhlíku a minerálních solí. Charakteristické složení v 1000 ml vody Masový extrakt (sušina) Pepton pro bakteriologii NaCl Agar 10,0 g 10,0 g 5,0 g 15,0 g Další použitý materiál Obr. č. 2: Živný agar Bylo použito běžné laboratorní mikrobiologické vybavení: bakteriologická klička, popisovače, kahan, automatické mikropipety, sterilní špičky, sterilní párátka, mikrozkumavky, zkumavky, Petriho misky, pinzeta, kleště, centrifuga, očkovací box, chladnička, termostat, koncentrovaný ethanol, sterilní destilovaná voda. Pro membránovou filtraci byly použity membránové filtry (Whatman) z celulózy acetátu s velikostí pórů 0,2 μm, o poloměru 25 mm a filtrační aparatura s vodní vývěvou. Obrazová dokumentace byla pořízena digitální kamerou Leica a digitálním fotoaparátem Olympus μ700. Vzorky byly zpracovány (viz níže) do 24 hodin od doby odběru. Bakterie byly inkubovány v termostatech při stálých teplotách 20, 37 a 44 C, kde jsou zároveň chráněny před světlem. To jsou standardní podmínky pro mikrobiologické stanovování indikátorů fekálního a organického znečištění vody. Escherichia coli K12 ze sbírky mikroorganismů Katedry mikrobiologie a genetiky UK v Praze byl použit jako pozitivní kontrola při experimentech. Vybrané kolonie bakterií (vzhled kolonií na kultivačním médiu) byly rozlišovány pomocí soupravy Enterotest 24, která je určena pro rutinní identifikaci významných druhů střevních baktérií z čeledi Enterobacteriaceae a Vibrionaceae do 24 hodin. K soupravě patří také parafinový olej a činidla pro testy indol (IND), fenylalanin (PHE) a acetoin (VPT I, II). Identifikace bakterií byla prováděna podle diagnostického seznamu a s pomocí softwaru TNWLite. 2.2 Metodika Sterilizace skleniček použitých pro transport vzorků Skleničky a víčka byly nejdřív důkladně umyty v horké vodě se saponátem a dvakrát propláchnuty vodou. Sterilizace byla provedena v zavařovacím hrnci, kde byly uzavřené prázdné skleničky dvacet minut vařeny ve vodě, pak se nechaly vychladnout a opět se vařily dvacet minut. (osobní sdělení B. Zikánová) Příprava mikroskopického preparátu Z několika vzorků byl sterilně odebrán 1 ml do mikrozkumavek, vzorky byly centrifugovány po dobu deseti minut na otáček, případné bakterie se usadily na dně mikrozkumavky. Po slití vody byl z kapky na dně připraven mikroskopický preparát pro orientační zjištění množství bakterií. Podle tohoto výsledku byl stanoven postup další práce Membránová filtrace Membránová filtrace se používá v případě, kdy se ve vzorku nachází malé množství bakterií. Podle výsledku mikroskopie se rozhodlo, že se provede kvantitativní zachycení bakterií ze vzorků pomocí filtrace přes membránový filtr za sníženého tlaku. Filtry byly třikrát povařeny po dobu deseti minut v 250 ml vody, která byla před dalším vařením slita a vyměněna za novou, v posledním kroku vaření membránových filtrů byla použita sterilní voda, která se po varu neslévá. 7

8 Filtrační aparatura s vývěvou obsahuje skleněný trychtýřovitý komínek (nálevku) s ryskami označujícími objem. K přichycení nálevky k filtrační baňce slouží kovové kleště, pro manipulaci s membránovými filtry se používá pinzeta, která se mezi kontakty s různými filtry sterilizuje lihem, který následně v plameni odhoří. Na membránovém filtru utkvěly bakterie z 25 ml vzorku. Filtry byly sterilní pinzetou přeneseny na živné médium MC tak, aby zachycené bakterie nebyly v přímém kontaktu s médiem a živiny k nim difundovaly přes filtr. Inkubace probíhala 24 hodin při teplotě 37 C Stanovení počtu bakterií výsevem na pevná kultivační média Objem 0,25 ml každého vzorku byl naočkován na povrch pevného kultivačního média (složení viz výše), vzorky rozetřeny skleněnou hokejkou. Inkubace probíhala v termostatu, miska byla v poloze dnem vzhůru. Dva paralelní výsevy pro izolaci psychrofilních chemoorganotrofních bakterií na ŽA č. 2 byly kultivovány při teplotě 20 C po dobu 48 hodin. Při teplotě 37 C byly inkubovány mezofilní chemoorganotrofní bakterie ve dvou paralelních výsevech na ŽA č. 2 po dobu 48 hodin a enterobakterie ve třech paralelních výsevech na MC během 24 hod. Při teplotě 44 C byly vzorky vod paralelně inkubovány na MC pro izolaci termofilních koliformních bakterií, kultivace probíhala 24 hodin Počítání kolonií Počet kolonií (KTJ, popř. CFU) vypovídá o míře mikrobiální kontaminace daného zdroje vody. Množství vzorku se volí tak, aby po inkubaci na povrchu pevného média vyrostlo 30 až 300 kolonií. Počet vyrostlých se standardně omezuje horní hranicí 300 hned z několika důvodů. Kolonie, které by rostly příliš blízko vedle sebe, mohou často splývat nebo se překrývat, tudíž nelze bezpečně určit, o kolik kolonií se vlastně jedná. Dále se může stát, že při blízkém růstu se jednotlivé kolonie mohou antagonisticky ovlivňovat a výsledný vzhled a tvar kolonie nemusí odpovídat optimálním podmínkám. Nižší počet než 30 kolonií se připouští v případech, kdy je očkován 1 ml (u pitné vody při stanovení organotrofních bakterií). Podobným způsobem je limitován počet vyrostlých kolonií u metody membránové filtrace, kde je přípustný počet maximálně 50 kolonií na filtru o průměru 5 cm (užitná plocha membránového filtru je čtyřikrát menší než plocha agarového média v Petriho misce). (Ambrožová, 2008) Při vlastním počítání se pracuje s fixem, kterým se označují již spočítané kolonie. Výhoda tohoto postupu je patrná zejména u počítání nad padesát kolonií v jedné misce Izolace a ředění čisté kultury na misce Pro izolaci pouze jedné čisté kultury se odebírá vybraná kolonie kličkou, která byla před tím rozpálena v plameni kahanu a ochlazena v médiu, čímž byla sterilizována. Bakterie se nanesou na novou misku opisem křivky na jedné třetině misky. Po té se klička sterilizuje nad kahanem, jak je popsáno výše. Sterilní kličkou se protne primární křivka, tím se na kličku nanesou bakterie a na polovině zbylé plochy se opět opíše podobná křivka, do té první se již nezasahuje. Pak se postup ředění ještě jednou opakuje, sterilizovanou a ochlazenou kličkou se jedním tahem naberou bakterie z druhé křivky a rozetřou se v poslední části misky. (Kaprálek, 1980) Identifikace bakterií Na identifikaci bakterií byl použit komerčně dostupný Enterostest 24, který využívá biochemických vlastností bakterií pro jejich identifikaci. Postup je zobrazen na schématu (viz obr. č. 3). 100 μl homogenizované suspenze se inokuluje do každé jamky. Do jamek H, G, F, E, D a C prvého řádku se přidají dvě kapky parafinového oleje. Inkubace trvá 24 hodin v teplotě 37 C. Nakonec se přidají činidla IND, VPT I a II a PHE. Profil pro vyhledání výsledku se sestavuje ve formuláři, který se vyplňuje pomocí tabulky interpretace reakcí. Nakonec se test vyhodnotí pomocí diagnostického seznamu nebo programu TNWLite. (PLIVA- Lachema Diagnostika s. r. o., Brno) 8

9 Obr. č. 3: Obecné schéma postupu Enterotestu Likvidace odpadů Použitý materiál a kultivační půdy s narostlými bakteriálními koloniemi byly likvidovány podle platných předpisů pro práci s biologickým materiálem. Sterilizace se provádí v autoklávu při standardní teplotě 121 C a tlaku 101,5 KPa po dobu 23 minut. 3 VÝSLEDKY 3.1 Sběr dat pro výběr lokality odběru vzorků studničních vod Před zahájením odběru vzorků studničních vod byla provedena dotazníková akce, jejíž vyhodnocení je shrnuto v tabulce č. 2. Vybrané lokality jsou znázorněny v Katastrální mapě obce Brnířov popisným číslem v červeném kroužku (viz příloha). Každý odebraný vzorek byl označen číslem shodným s číslem popisným dané nemovitosti. Tabulka č. 2: Vyhodnocení dotazníku o využití vybraných studní jejich majiteli Otázky Vyhodnocení Č. Text otázky Č. p. Ot. 1 Ot. 2 Ot. 3 Ot. 4 Ot. 5 Ot. 6 Odebíráte z kohoutku studniční vodu k pití? Odebíráte vodu k zalévání? Provádíte pravidelně rozbor vody? Udržujete nějakým způsobem studnu? Chováte domácí zvířata? Nachází se v okruhu 12 m od studny septik, hnojiště nebo volně se pohybující domácí zvířata? Kritérium vzdálenosti studny na 12 m od septiku je v souladu s ČSN Studny individuálního zásobování vodou. (Chlupáčová, 2007) 9

10 Kritéria výběru míst odběru se opírají nejen o dotazník, ale také o geografickou polohu jednotlivých míst v rámci obce. Dále bylo z dostupných dat na Obecním úřadu v Brnířově zjištěno, že 14 % obyvatel užívá pitnou vodu pouze ze své studny (tato místa jsou označena zelenými čtverci v Katastrální mapě obce Brnířov) a většina z nich není vůbec připojena k obecnímu vodovodu. 3.2 Mikrobiologická analýza odebraných vzorků Orientační stanovení počtu mikroorganismů Pro orientační stanovení počtu mikroorganismů se postupovalo podle metody Preparáty jednotlivých vzorků obsahovaly ojedinělé bakterie, u některých vzorků nebyly pozorovány bakterie žádné. Bylo zjištěno, že vzorky není zapotřebí ředit Stanovení chemoorganotrofních bakterií Limitům pro psychrofilní bakterie podle Vyhl. č. 252/2004 Sb. vyhověly čtyři vzorky s počty menšími než 200 bakterií v 1 ml vzorku (viz tabulka č. 3). Vyhovující vzorky jsou označeny čísly 50, 64, 65 a 68. Zbylých osm vzorků nevyhovělo limitům, z toho pět je několikanásobně přesáhlo. Bakterie byly přítomny v různých množstvích ve většině vzorků a největší podíly počtu psychrofilních chemoorganotrofních bakterií má pět vzorků s čísly 15, 18, 52, 66 a 67 (viz graf č. 2). Tyto vzorky přesáhly počitatelné množství kolonií (tzn. 300 KTJ na Petriho misce, viz kap ), proto v tabulce č. 3 není zaznamenáno jejich přesné množství. Pro mezofilní chemoorganotrofní bakterie je vyhláška značně přísnější. Mezní hodnota dovoluje výskyt maximálně dvaceti kolonií v 1 ml vzorku. Tomuto kritériu vyhovělo sedm vzorků a z toho ve dvou vzorcích 64 a 66 nebyly detekovány žádné. Dva vzorky (52 a 75) výrazně převýšily počtem vykultivovaných bakterií ostatní vzorky a limity přesáhly více než desetkrát (viz graf č. 1). Celkem vyhověly limitům stanoveným pro chemoorganotrofní bakterie čtyři vzorky. Tři vzorky splnily limity pro mezofilní, ale ne pro psychrofilní chemoorganotrofní bakterie. Zbylých pět vzorků nevyhovělo ani jednomu kritériu kvantitativního stanovení chemoorganotrofních bakterií. Výsledky kultivace v rozdílných inkubačních teplotách se v některých případech v rámci jednoho vzorku řádově lišily. Vždy značně převažovaly psychrofilní nad mezofilními chemoorganotrofními bakteriemi (viz tabulka č. 3). Při kvalitativním hodnocení chemoorganotrofních bakterií bylo u vzorků pozorováno různé druhové zastoupení bakterií. Některé vzorky se jevily, jako by byly tvořeny pouze několika málo druhy psychrofilních chemoorganotrofních bakterií (podle vzhledu, viz obr. č. 4), naopak mezofilní chemoorganotrofní bakterie vykazovaly velmi výraznou druhovou variabilitu i v rámci téhož vzorku (viz obr. č. 5 7). Graf č. 1: Celkový počet mezofilních chemoorganotrofních bakterií v 1 ml Graf č. 2: Celkový počet psychrofilních chemoorganotrofních bakterií v 1 ml 10

11 Obr. č. 4: Psychrofilní bakterie (vz. 52) Obr. č. 5: Mezofilní bakterie (vz. 52) Obr. č. 6: Detail mezofil. bakt. I (vz. 52) Obr. č. 7: Detail mezofil. bakt. II (vz. 52) Stanovení enterobakterií a koliformních bakterií Homogenizované vzorky byly aplikovány po 0,25 ml na MC (viz kap ) ve třech paralelách. Narostlé kolonie byly odečteny po 24 hodinách, jejich počet zprůměrován a vztažen na objem 100 ml (viz tabulka č. 3, graf č. 3), jak vyžaduje Vyhl. č. 252/2004 Sb. Při vyhodnocování výsledků se vycházelo z předpokladu, že růst grampozitivních bakterií je potlačen, bezbarvé kolonie nejsou schopny fermentovat laktózu a naopak růžové a červené kolonie laktózu fermentují, to znamená, že patří do skupiny koliformních bakterií. Limity Vyhl. č. 252/2004 Sb. nedovolují výskyt ani jediné enterobakteriální kolonie ve 100 ml vzorku. V kultivační metodě přímého výsevu limitům vyhovělo pět vzorků s čísly 50, 57, 64, 66 a 68 (viz tabulka č. 5). Koliformní bakterie nebyly izolovány v osmi vzorcích. Vzorek 52 se velmi odlišuje od ostatních vzorků nárůstem velkého množství kolonií koliformních bakterií, které čítaly ve 100 ml (viz graf č. 3). Další vzorky, které výrazněji přesáhly stanovené limity, jsou vzorky 15, 18 a 75. Vzorek 18 byl odebrán ze studny používané jako zdroj pitné vody, vzorek 15 ze studny s příležitostnými odběry během sezóny a vzorky 52 a 75 pocházejí z dlouhodobě nevyužívaných studen (viz tabulka č. 3). Zkonfrontujeme-li výsledky stanovení enterobakterií a koliformních bakterií, vyhoví celkem pět vzorků. Porovnáme-li množství enterobakterií a koliformních bakterií zvlášť, zjistíme, že se buď tyto počty shodují, z toho plyne, že se jednalo čistě o koliformní bakterie zbarvené červeně, nebo se počty liší, tehdy byly kromě koliformních bakterií vykultivovány i nekoliformní enterobakterie. Prvnímu případu odpovídají vzorky 52, 67 a 75. Druhý případ nastal u vzorků 15, 18, 24 a Stanovení koliformních bakterií metodou membránové filtrace Podmínky kultivace jsou stejné jako v kap Objem vzorku pro filtraci byl 25 ml. Získané hodnoty byly přepočítány na objem 100 ml, jak vyžaduje Vyhl. č. 252/2004 Sb. Během kultivace došlo u některých vzorků ke ztrátě kontaktu filtru s kultivačním médiem, proto vyhodnocení proběhlo pouze u filtrů z % přilnulých k médiu a u vzorků s celkovým počtem narostlých kolonií do 50 Obr. č. 8: Membránový filtr (vz. 57) (viz kap ). Tabulka č. 3 zobrazuje vyhodnocení kultivace koliformních bakterií zachycených na filtru. Na obr. č. 8 je membránový filtr s červenými koloniemi koliformních bakterií s červenými koloniemi koliformních bakterií označenými šipkami. Platí pro ně stejné limity stanovené vyhláškou jako v předchozím případě, jejich výskyt není tolerován. Metodou membránové filtrace byly zachyceny koliformní bakterie celkem v pěti vzorcích ze sedmi, které bylo možné vyhodnocovat. Z toho byl výskyt koliformních bakterií zjištěn ve vzorcích 24, 57 a 66 (viz tabulka č. 3), kde nebyly detekovány pomocí metody přímého výsevu. Přítomnost koliformních bakterií se potvrdila metodou membránové filtrace ve vzor- 11

12 cích 24, 52 a 75 a jejich nepřítomnost u vzorků 50 a 65, v těchto případech výsledky odpovídají vyhodnocení metody přímého výsevu Stanovení termotolerantních koliformních bakterií V inkubační teplotě 44 C byly kultivovány termofilní koliformní bakterie, které mohou být hygienicky významné. Homogenizované vzorky byly inokulovány po 0,25 ml na MC ve dvou paralelách, odečet výsledků proběhl po 24 hodinách. Ani v jednom ze vzorků se nepodařilo zachytit termotolerantní koliformní bakterie Souhrnný přehled výsledků kvantifikace bakterií Celkem bylo analyzováno 12 vzorků studničních vod, z nichž šest využívají majitelé jako vodu pitnou (viz tabulka č. 3). Mikrobiologická analýza ukázala, že z těchto vzorků vyhověly limitům Vyhl. č. 252/2004 Sb. (viz tabulka č. 1) pouze dva, a to vzorek číslo 50 a 64. Vzorek 68 lze také označit jako pitnou vodu, i když pochází ze studny, ze které je čerpána užitková voda (viz tabulka č. 3). Získané hodnoty, které překročily limity, jsou barevně zvýrazněny (červeně voda využívaná jako pitná, žlutě užitková voda nebo voda sezónně čerpaná, např. na zalévání, oranžově dlouhodobě nepoužívané studny, šedě studny nedostatečně vzdálená od septiku). Čtyři vzorky nesplnily ani jedno hodnocené kritérium, to je třetina testovaných vzorků. Dva vzorky vyhověly pouze v jedné stanovované kategorii, vzorky 57 a 66 ve dvou. Vzorek 65 vyhověl kromě stanovení enterobakterií všem požadavkům pro pitnou vodu. Tabulka č. 3: Celkové výsledky mikrobiologického rozboru vzorků vod Vz. Psychrofilní Mezofilní Enterobakterie/ Koliformní Membránová filtrace: bakterie/ml bakterie/ml 100 ml bakterie/100 ml koliformní bakt./100 ml 15 > > > > > Legenda: barevné = nedodržení limitu; červená = "pitná" voda; žlutá = užitková voda (na zalévání); oranžová = nepoužívaná studna; šedá = v blízkosti studny je septik a chov zvířat Výrazně větší počet vykázaly psychrofilní chemoorganotrofní bakterie než mezofilní. Rozdíly mezi kultivacemi v odlišných teplotách byly asi stonásobné. V pěti vzorcích bylo zjištěno více než psychrofilních chemoorganotrofních bakterií v 1 ml vzorku, to nejméně šestkrát překračuje limity Vyhl. č. 252/2004 Sb. Vzorky 52 a 75 přesáhly limity mezofilních chemoorganotrofních bakterií více než desetkrát. Téměř v polovině vzorků nebyly enterobakterie vůbec zaznamenány. Jejich nejmasivnější výskyt byl prokázán ve vzorku 52, bylo to kolonií koliformních bakterií. Pozitivní výsledky záchytu koliformních bakterií souzní s výskytem enterobakterií v pěti vzorcích. Vzorky 15 a 65 obsahovaly pouze nekoliformní enterobakterie a ve vzorcích 57 a 66 byly zachyceny koliformní bakterie metodou membránové filtrace a enterobakterie přímým výsevem izolovány nebyly. Vzorky 18 a 52 byly odebrány ze studní, které se nachází ve vzdálenosti menší než dvanáct metrů od septiku (tuto hraniční vzdálenost chránící před možným průsakem stanovuje ČSN ). Oba vzorky několikanásobně přesáhly všechny limity pro pitnou vodu. Podobně vzorek 75 nevyhověl vyhlášce ani v jednom bakteriálním stanovení. Studny u domů 12

13 s č. p. 52 a 75 se dlouhodobě nevyužívají. Při zohledňování polohy studní a výskytu bakterií ve vodě nebyla zjištěna souvislost potenciálního původu znečištění se vzdáleností studny od zemědělsky využívaných polí, která nejsou chemicky hnojena Výběr kolonií a jejich identifikace Na základě odlišného vzhledu (hlavně zbarvení a velikosti) jednotlivých kolonií enterobakterií a koliformních bakterií vykultivovaných na MC jich bylo sedm vybráno k přeočkování, tzn. k izolaci čistých bakteriálních kolonií (viz obr. č ). Referenční kmen E. coli K12 sloužil jako kontrola (viz obr. č. 9). Vzorek se nepodařil přeočkovat. Obr. č. 9: E. coli K12 Obr. č. 10: Kolonie 1 (vz. 52) Kolonie 2 (vz. 52) Obr. č. 11: Kolonie 3 (vz. 15) Obr. č. 12: Kolonie 4 (vz. 67) Obr. č. 13: Kolonie 5 (vz. 18) Obr. č. 14: Kolonie 6 (vz. 18) Obr. č. 15: Kolonie 7 (vz. 18) Přeočkované kolonie byly identifikovány pomocí Enterotestu 24 (viz kap ). S použitím diagnostického seznamu bylo dosaženo jiných závěrů než s pomocí programu TNWLite (viz tabulka č. 4). Diagnostický seznam selhal u třech druhů bakterií, tyto byly programem TNWLite určeny jako inaktivní E. coli, Xenorhabdus nematophilus a blíže neurčitelná enterická skupina. Ve třech případech identifikace došlo ke shodě mezi diagnostickým seznamem a TNWLite v určení inaktivní E. coli, Citrobacter sp. a Yersinia enterolytica. 13

14 Tabulka č. 4: Identifikace pomocí diagnostického seznamu a TNWLite Izolát Vzorek Diagnostický seznam TNWLite 1 52 neurčeno E. coli inaktivní 2 52 nepodařilo se vykultivovat nepodařilo se vykultivovat 3 15 neurčeno Xenorhabdus nematophilus 4 67 neurčeno Enteric group 5 18 E. coli E. coli inaktivní 6 18 Citrobacter sp. Citrobacter sp Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica E. coli je popsána v kap Bakterii Yersinia enterocolitica (izolát č. 7, viz obr. č. 15) lze v přírodě nalézt jako parazita zvířat (hlavně hlodavců). Primárně se nachází v infikovaném mase, ale může kontaminovat i vodu. U člověka způsobuje průjmová onemocnění. (Bednář, 1996) Xenorhabdus nematophilus (izolát č. 3, viz obr. č. 11) je gramnegativní fakultativně aerobní tyčinka, běžně se nachází ve střevním traktu červů jako symbiont nebo larev hmyzu jako parazit. (Bradstreet, 2004) Citrobacter sp. (izolát č. 6, viz obr. č. 14) je gramnegativní koliformní bakterie, jméno získala podle své schopnosti utilizovat citrát jako zdroj uhlíku. Vyskytuje se téměř všude, v lidském střevě většinou nezpůsobuje enterokolitidy, ale může vyvolat záněty močových cest, dětskou meningitidu nebo sepsi. Je to významná nozokomiální bakterie. (Drelichman, 1985; Badger, 1999) Tento druh je zajímavý schopností bioakumulace těžkých kovů (včetně radioaktivního uranu), proto může být používán k čištění odpadních vod. (Macaskie, 1992) 4 Diskuse Přehled výsledků v konfrontaci s Vyhláškou č. 252/2004 Sb. Získané výsledky lze považovat ve většině pouze za orientační. Důvodem je nedosažení takového počtu narostlých bakterií na plotnu, který by vyhovoval statisticky objektivnímu vyhodnocení (viz kap ). Z časových důvodů jsem nemohla odběry a testování opakovat. Jistým omezením výpovědní hodnoty dat je negativní výsledek při zjišťování počtu termotolerantních koliformních bakterií. Je otázkou, zda v tomto případě nebyly dodrženy přesné kultivační podmínky (teplota v termostatu se může během dne měnit) nebo zda termotolerantní enterobakterie skutečně nebyly v žádném ze vzorků přítomny či se na negativním výsledku podepsalo roční období (pozdní podzim), kdy byly vzorky odebírány. Jistě by bylo velmi zajímavé a přínosné provést mikrobiologický rozbor vzorků studničních vod i v jiném ročním období. Možný vliv okolního prostředí na četnost bakterií ve vzorcích Získané výsledky o výskytu koliformních bakterií a o počtu chemoorganotrofních bakterií ukazují na možnou souvislost s chovem zvířat, popř. s nedostatečnou vzdáleností septiku od studny a možností jeho prosakování do studniční vody. Vzorky 18 a 52 pochází ze studní, které jsou nedostatečně vzdálené od septiku, méně než dvanáct metrů, jak stanovuje ČSN V obou případech byly nalezeny zvýšené počty všech stanovovaných bakterií. A vzorek 52 se zásadně vymyká v číslu vykultivovaných enterobakterií, které dosáhlo řádu desetitisíců ve 100 ml vzorku. Na špatném výsledku mikrobiologického rozboru se může podílet také míra využívání studny snížená na minimum, voda se nečerpá a ani se o její kvalitu majitel žádným způsobem nezajímá a nestará. V případě vzorku 75 může být špatný výsledek zapříčiněn přítomností nedalekého zemědělského družstva s chovem skotu a prasat (viz příloha). 14

15 Vyhodnocení identifikace bakterií pomocí Enterotestu 24 Přeočkování čistých bakteriálních kolonií (viz kap ) se podařilo v šesti případech, v jednom případě (kolonie 2 ze vzorku 52, viz kap ) se inkubace nezdařila. Jednalo se o fenotypově ojedinělou kolonii, vzrůstem oproti ostatním malou, bílé barvy. Existuje jistá pravděpodobnost, že se nejednalo o enterobakterii. Ve střevech se vyskytují kromě enterobakterií i další, např. bifibakterie aj. (Horáková, 2008) Bifibakterie na MacConkey agaru nerostou, protože potřebují jiné podmínky kultivace i výživy, ale mohou na něm ojediněle vyrůst grampozitivní enterokoky, které jsou ve většině potlačeny. (Oxoid Ltd, Basingstoke, UK) Lze se domnívat, že bakteriální kolonie, u které se nepodařilo její přeočkování, jsou nepotlačené grampozitivní bakterie. Pomocí diagnostického seznamu se podařilo určit tři bakteriální druhy ze šesti, program TNWLite dokázal taxonomicky zařadit všechny izolované bakterie. Tuto skutečnost si lze vysvětlovat schopností programu zpracovat všech 24 nezávislých metabolických testů, tudíž lze lépe postihnout druhovou variabilitu. Na proti tomu maticový profil je pětimístný pro zjednodušení identifikace pomocí diagnostického seznamu, tudíž je vyhodnoceno pouze 18 biochemických testů. Čím víc výsledků nezávislých testů se vyhodnocuje, tím lepší je identifikace. (Atlas, 1996) Zajímavým zjištěním je identifikace bakterií Yersinia enterocolitica a hlavně Xenorhabdus nematophilus. První z nich parazituje ve svalech hlodavců, druhá v larvách hmyzu. (Bednář, 1996; Bradstreet, 2004) U první je známo, že může kontaminovat vodu, ale s bakterií Xenorhabdus nematophilus se ve vodě běžně nesetkáváme. 5 Závěr 1. Bylo analyzováno 12 vzorků, z toho limitům Vyhlášky č. 252/2004 Sb. vyhověly tři, které lze používat jako pitnou vodu. Čtyři vzorky nevyhověly ani v jednom stanovovaném parametru mikrobiologického rozboru (chemoorganotrofní a koliformní bakterie). 2. Zvýšené počty bakterií v některých vzorcích naznačují možnou příčinnou souvislost mezi intenzitou využívání zdroje a umístěním studny nedaleko septiku nebo chovem domácích zvířat. 3. Určení druhů bakterií pomocí Enterotestu 24 potvrdilo ve všech případech, že se jedná o enterobakterie, čtyři lze zařadit mezi koliformní druhy. Na mikrobiálním znečištění se mohou podílet i bakterie, které jsou parazity bezobratlých živočichů, jak bylo zjištěno nálezem druhu Xenorhabdus nematophilus. Přestože mikroorganismy ve zdánlivě průzračných vodách jsou pouhým okem neviditelné, můžeme pomocí kultivačních metod zjistit jejich přítomnost ve vodách ve značném množství, a to i takových druhů, které jsou pro člověka nebezpečné. Domnívám se, že většina obyvatel Brnířova tyto skutečnosti podceňuje a jistě by bylo na místě zvýšení všeobecné informovanosti lidí nejen v obci Brnířov. Inkriminovaným majitelům studní jsem tlumočila výsledky mikrobiologického rozboru, který jsem provedla na půdě Katedry mikrobiologie a genetiky Přírodovědecké fakulty UK v Praze. Toto byl první krok, kterým jsem přispěla k vyšší informovanosti obyvatel. Výsledky své práce jsem konzultovala se starostou obce a poskytla je občanům k volnému nahlédnutí na Obecním úřadě v Brnířově. 15

16 6 Seznam použité literatury a internetových adres [1] AMBROŽOVÁ, J. Aplikovaná a technická hydrobiologie [online]. 2. vyd. Praha: Vysoká škola chemicko-technologická Praha, ISBN [Cit ]. Dostupné z URL: < [2] AMBROŽOVÁ, J. Mikrobiologie v technologii vod [online]. 2. vyd. Praha: Vysoká škola chemicko-technologická Praha, ISBN [Cit ]. Dostupné z URL: < [3] ATLAS, R. M. Principles of Microbology. 2 nd ed. WCB McGraw-Hill, ISBN Numerical Taxonomy, p Systems for Bacterial Identification, p [4] BADGER, J. D. a kol. Citrobacter freundii Invades and Replicates in Human Brain Microvascular Endothelial Cells [online]. Infection and Immunity, August 1999, vol. 67, no. 8, p [Cit ]. Dostupné z URL: < [5] BEDNÁŘ, M. a spol. Lékařská mikrobiologie. 1. vyd. Praha: Marvil, 1996, s [6] BRADSTREET, C. Xenorhabdus nematophilus [online]. Missouri S&T, Microbes of the week [Cit ]. Dostupné z URL: < [7] DRELICHMAN, V., BAND, J. D. Bacteremias due to Citrobacter diversus and Citrobacter freundii. Incidence, risk factors, and clinical outcome [online]. Archives of Internal Medicine, October 1985, vol. 145, no. 10, p [Cit ]. Dostupné z URL: < [8] HORÁKOVÁ, K. Možnosti izolace a identifikace hygienicky významných bakterií ve vodách. Disertační práce [online]. Brno, [Cit ]. Dostupné z URL: < [9] CHLUPÁČOVÁ, M. Mikrobiální závadnost studniční vody a dezinfekce [online] [Cit ]. Dostupné z URL: < [10] KAPRÁLEK, F. Základní mikrobiologické praktikum. 1. vyd. Praha: Státní pedagogické nakladatelství, 1980, s [11] MACASKIE, L. E. a kol. Uranium bioaccumulation by a Citrobacter sp. as a result of enzymically mediated growth of polycrystalline HUO 2 PO 4 [online]. Science, August 1992, vol. 257, no. 5071, p [Cit ]. Dostupné z URL: < [12] ŘÍHOVÁ AMBROŽOVÁ, J. Bakterie koliformní. Encyklopedie hydrobiologie: výkladový slovník [online]. Praha: VŠCHT Praha, [Cit ]. Dostupné z URL: < [13] ŘÍHOVÁ AMBROŽOVÁ, J. Stanovení abiosestonu. Encyklopedie hydrobiologie: výkladový slovník [online]. Praha: VŠCHT Praha, [Cit ]. Dostupné z URL: < [14] ROSYPAL, S. a kol. Nový přehled biologie. 1. vyd., dotisk. Praha: Scientia, ISBN , s [15] Enterotest 24 [online]. PLIVA-Lachema Diagnostika s. r. o., Brno. [Cit ]. Dostupné z URL: < [16] Katastrální mapa obce Brnířov [online]. [Cit ]. Dostupné z URL: < [17] MacConkey Agar No. 3 [online]. Oxoid Ltd, Basingstoke, UK. [Cit ]. Dostupné z URL:< [18] Živný agar č. 2 [online]. IMUNA PHARM, a. s., Šarišské Michal any. [Cit ]. Dostupné z URL: < 16

17 7 Příloha 17