ANTI-A (ABO1), ANTI-B (ABO2), ANTI-A,B (ABO3) ANTI-D (RH1)

Transkript

1 ANTI-A (ABO1), ANTI-B (ABO2), ANTI-A,B (ABO3) ANTI-D (RH1) IgM I, ANTI-D (RH1) IgM II, ANTI-D (RH1) TOTEM, ANTI-D (RH1) IgG, ANTI-DCE (RH1,2,3), NEG CONTROL, GROUPAKIT ÚVOD Tyto reagencie jsou in vitro diagnostika (IVDMD - In Vitro Diagnostic Medical Devices) pro profesionální použití. Jsou určeny k vyšetřování lidských biologických vzorků. ANTI-A (ABO1), ANTI-B (ABO2), ANTI-A,B (ABO3) jsou diagnostika určená ke stanovení ABO skupiny lidských erytrocytů. Umožňují určit přítomnost A a/nebo B antigenů na povrchu erytrocytů. ANTI-D (RH1) IgM I, ANTI-D (RH1) IgM II, ANTI-D (RH1) TOTEM, ANTI-D (RH1) IgG jsou diagnostika určená ke stanovení antigenů lidských erytrocytů. Umožňují určit přítomnost antigenu D (RH1) na povrchu erytrocytů. ANTI-DCE (RH1,2,3) diagnostikum umožňuje detekci přinejmenším jednoho z antigenů D (RH1), C (RH2) a E (RH3) na povrchu erytrocytů. Diagnostikum NEG CONTROL se používá při určování skupiny ABO D (RH1). Neobsahuje protilátkovou aktivitu. Užití kontroly za stejných podmínek jako použitá diagnostika usnadňuje interpretaci získaných výsledků. PRINCIP Techniky pro určování antigenů erytrocytů, zkumavková nebo sklíčková, jsou založeny na principu hemaglutinace. Testované krvinky, pokud nesou příslušný antigen, jsou shlukovány (aglutinovány) v přítomnosti reagencie obsahující odpovídající protilátku: buďto přímou aglutinační metodou, dostanou-li se do kontaktu s diagnostikem, obsahujícím odpovídající protilátku (typu IgM), nebo nepřímou aglutinační metodou: pomocí nepřímého antiglobulinového testu v případě použití IgG protilátky. Reakce je provedena ve dvou krocích: k testovaným krvinkám je přidáno diagnostikum, obsahující IgG protilátku, která se naváže na odpovídajíc antigen (je-li přítomen). Po promytí přidání AGH MAESTRIA IgG séra způsobuje aglutinaci senzibilizovaných krvinek (nesoucích antigen s navázanou protilátkou). Určování ABO krevních skupin je definováno stanovením A a/nebo B antigenů na povrchu lidských červených krvinek a současně průkazem přítomnosti anti-a a/nebo anti-b protilátek v plazmě. Je tedy nutno identifikovat antigeny erytrocytů známými anti-a, anti-b a anti-a,b diagnostiky (krvinkový test, přímý test) a poté potvrdit výsledek ověřením (ne)přítomnosti odpovídajících protilátek v plazmě vyšetřovaného vzorku pomocí erytrocytů se známým fenotypem A1, B, a případně A2 a O (plazmový test, reverzní test). Pro určení D (RH1) je potřeba použít diagnostika ANTI-D (RH1) a NEG CONTROL. SLOŽENÍ Reagencie jsou připravovány z monoklonálních protilátek v konzervačním prostředí. Monoklonální protilátky, produkované společností DIAGAST, jsou získávány ze supernatantů in vitro hybridomových kultur myšího nebo lidského původu. Reagencie obsahují azid sodný (< 0,1 %), arzenitan sodný (0,02 %) a hovězí albumin. Reagencie jsou dodávány v lahvičkách s kalibrovaným kapátkem a jsou též součástí kitu GROUPAKIT. GROUPAKIT (DIAGAST kat.č ) obsahuje po jedné lahvičce diagnostika ANTI-A (ABO1), ANTI-B (ABO2), ANTI-A,B (ABO3), ANTI-D (RH1) IgM I a NEG CONTROL. Diagnostikum NEG CONTROL, produkované společností DIAGAST, neobsahuje protilátky. Označení reagencií - viz poslední strana. BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Doporučujeme použití rukavic a ochranných brýlí, také opatrnost při manipulaci se vzorky lidského původu, stejně jako s jakýmkoliv substrátem, který přišel do styku s těmito vzorky - jako při práci s potenciálně infekčními produkty. Dodržujte zvláštní ochranná opatření a podmínky pro likvidaci a desinfekci, zavedené ve shodě s místními předpisy. Nepoužívejte reagencie poškozené nebo se známkami úniku obsahu. SKLADOVÁNÍ Reagencie musí být skladovány při teplotě mezi 2 C až 8 C. Účinnost při použití doporučenou metodikou je zaručena od prvního použití do data exspirace, uvedeného na štítku. Po tomto datu nesmí být používány. Je

2 doporučováno minimalizovat uložení reagencií mimo ledničku a neponechávat je v laboratorní teplotě mezi dvěma použitími. POTŘEBNÉ REAGENCIE A MATERIÁLY - Fyziologický roztok (NaCl 0,9%) - Inkubátor nebo vodní lázeň na 37 C - Skleněné zkumavky 10 nebo 12x75mm, stojánek na zkumavky - Tyčinka na roztírání - Opalinová deska - Přesně nastavitelné automatické pipety - Centrifuga s relativní odstředivou silou g - Kontrolní vzorky se známým fenotypem, např. HEMA CQI (kat.č. - viz katalog DIAGAST) - Antiglobulinové sérum AGH MAESTRIA IgG (kat.č. viz katalog DIAGAST) - Krvinky senzibilizované IgG - Kit pro určování D variant: D SCREEN (kat.č. viz katalog DIAGAST) VZORKY KONTROLY Vyšetřovaný krevní vzorek Krev odebraná do uzavřené sterilní zkumavky s antikoagulačním roztokem (EDTA, heparin nebo citrát), skladovaná mezi +2 C až + C, testovaná do 48 hodin, dokud nejsou viditelné známky hemolýzy. Před testováním centrifugujte krevní vzorky 3 minuty při 1200g. Vzorky se známými fenotypy: HEMA CQI Analytický systém musí být validován použitím vzorků se známými fenotypy: - vzorek obsahující antigen, odpovídající protilátce v použitém diagnostiku, - vzorek neobsahující antigen, odpovídající protilátce v použitém diagnostiku. Použití takových vzorků nebo HEMA CQI umožňuje detekci anomálií (laboratorní práce, zacházení s materiálem, stav reagencií, přístrojů, okolního prostředí) a provedení nápravných opatření. Reagenční kontrola Reakci každého vzorku při určování RH1 porovnejte s kontrolní reakcí provedenou za stejných podmínek, ale s nahrazením ANTI-D (RH1) diagnostikem NEG CONTROL. V případě anomálií při určování ABO skupiny porovnejte s kontrolní reakcí provedenou za stejných podmínek, ale s nahrazením diagnostika pro určování ABO diagnostikem NEG CONTROL. POSTUP a) Sklíčkový test za laboratorní teploty (+18 C až +25 C) /neplatí pro ANTI-D (RH1) IgG/ - Na dokonale čistou plochu (sklíčko), použitím kapátka lahvičky, umístěte 1 kapku reagencie. - Vedle každé z reagencií umístěte 25 μl nepromytého sedimentu krvinek tak, aby nedošlo ke kontaktu mezi kapkami. - Čistou tyčinkou rovnoměrně spirálovým pohybem promíchejte reagencii a krvinky na ploše o průměru 2 až 3 cm. - Inkubujte 30 sekund při laboratorní teplotě a bez míchání. - Za pomalého rotování deskou (sklíčkem) během 3 minut pozorujte makroskopicky případnou aglutinaci. - Reakce ihned odečtěte. b) Zkumavkový test za laboratorní teploty (+18 C až +25 C) /neplatí pro ANTI-D (RH1) IgG/ - Připravte 5% suspenzi nepromytých krvinek v izotonickém fyziologickém roztoku. - Kapátkem lahvičky dávkujte do zkumavky kapku reagencie. - Do zkumavky přidejte 50 μl 5% suspenze krvinek. - Jemným poklepem promíchejte obsah zkumavky a centrifugujte 1 minutu při 500g. - Reakce odečítejte makroskopicky: mírným poklepem uvolněte sedimentované krvinky a pozorujte aglutinaci. - Zaznamenejte vznik případných aglutinací. c) Nepřímý antiglobulinový test pouze pro ANTI-D (RH1) TOTEM - Ihned po centrifugaci a odečtení, jsou-li výše uvedené reakce slabě pozitivní nebo negativní, promíchejte obsah zkumavek a inkubujte 15 minut při 37 C. - Promyjte krvinky dvakrát fyziologickým roztokem a po posledním promytí odstraňte promývací roztok. - K sedimentu krvinek přidejte 50 μl antiglobulinového séra AGH MAESTRIA IgG. Promíchejte a potom centrifugujte 1 minutu při 120g. - Odečítejte reakce (jak je uvedeno v bodu b).

3 d) Nepřímý antiglobulinový test pouze pro ANTI-D (RH1) IgG - Připravte 5% suspenzi nepromytých krvinek v izotonickém fyziologickém roztoku. - Kapátkem lahvičky dávkujte do zkumavky jednu kapku reagencie. - Do zkumavky přidejte 50 μl 5% suspenze krvinek. - Jemným poklepem promíchejte obsah zkumavky a inkubujte 15 minut při 37 C. - Promyjte krvinky dvakrát fyziologickým roztokem a po posledním promytí odstraňte promývací roztok. - K sedimentu krvinek přidejte 50 μl antiglobulinového séra AGH MAESTRIA IgG. Promíchejte a potom centrifugujte 1 minutu při 120 g. - Odečítejte reakce (jak je uvedeno v bodu b). INTERPRETACE - Pokud dojde k aglutinaci (erytrocyty shluknuté do jednoho či několika shluků), je reakce pozitivní a antigen (nebo alespoň jeden z antigenů) odpovídající protilátce v diagnostiku je na vyšetřovaných erytrocytech přítomen. Pokud k aglutinaci nedojde (erytrocyty se resuspendují do homogenní suspenze), je reakce negativní a antigen odpovídající protilátce v diagnostiku není na vyšetřovaných erytrocytech přítomen. - Určení ABO skupiny dané osoby je spolehlivě definováno pouze při striktně souhlasných výsledcích krvinkového (přímého) a plazmového (reverzního) testu. - Pokud dojde k diskrepanci, nevydávejte výsledek a pokračujte ve vyšetřování krevní skupiny v souladu s platnými předpisy a protokoly, nebo zašlete vzorek do specializované/referenční laboratoře. - Provedení auto-, alo- a reagenčních kontrol, a stejně tak klinický kontext může přispět k objasnění diskrepantních výsledků. - Autokontrola: Testujte vzorek plasmy za stejných podmínek s vlastními erytrocyty. - Alokontrola: Testujte vzorek plasmy za stejných podmínek s panelem erytrocytů skupiny O (detekce antierytrocytárních protilátek jiných nežli anti-a nebo anti-b). - Reagenční kontrola: testujte krvinky vyšetřovaného vzorku za stejných podmínek jako při přímém testu pomocí negativní kontroly. - Pro stanovení D (RH1) přímou aglutinační metodou (sklíčkový a zkumavkový test): pokud nastane aglutinace s ANTI-D (RH1) IgM nebo TOTEM, je na testovaných krvinkách přítomen D antigen. Nenastane-li aglutinace a je-li potřeba detekovat slabé a/nebo variantní D antigeny, je možné použít ANTI-D (RH1) TOTEM nebo ANTI-D (RH1) IgG v nepřímém antiglobulinovém testu. Negativní reakce nepřímého antiglobulinového testu mohou být validovány přidáním IgG senzibilizovaných krvinek (viz příbalovou dokumentaci příslušných diagnostik). - Reakce jsou správně interpretovatelné pouze, pokud: reagenční kontrola s NEG CONTROL diagnostikem je negativní, analytický systém byl validován použitím vzorků se známými fenotypy. - Kromě toho, reakce při nepřímém antiglobulinovém testu je interpretovatelná jen tehdy, když přímý antiglobulinový test testovaných krvinek je negativní. LIMITY METODY - Používat reagencie k provádění testů musí pouze kvalifikovaný personál. - K dávkování kapek diagnostik je nutné používat kalibrované kapátko, které je součástí diagnostika. - Reakce musí být odečítány bezprostředně po centrifugaci a resuspendování. - Je nezbytně nutné pracovat s čistým materiálem a nekontaminovanými reagenciemi (bakteriální nebo jiná kontaminace) - Následující podmínky musí být přesně dodržovány: skladovací podmínky a expirační doba, postupy, kalibrace doporučených zařízení. - Slabé A a/nebo B fenotypy nemusí být vždy detekovány sklíčkovým testem tento test je méně citlivý, nežli zkumavkový test. Proto pokud je pozorována diskrepance mezi krvinkovým a reverzním testem, může jít o přítomnost slabého fenotypu, potom je třeba při opakování testu použít citlivější techniky. - Pro nepřímý antiglobulinový test je nutné použít AGH MAESTRIA IgG. - Jako negativní kontrolu je nutné použít diagnostikum NEG CONTROL. - ANTI-D (RH1) diagnostika se nemají používat technikami s potřebou enzymatické úpravy krvinek. - ANTI-D (RH1) IgM diagnostikum nemá být užíváno v nepřímém antiglobulinovém testu. - Při použití ANTI-D (RH1) TOTEM mohou být někdy pozorovány diskrepance mezi negativním přímým aglutinačním testem a pozitivním nepřímým antiglobulinovým testem. Může jít o přítomnost slabého a/nebo variantního D antigenu. - Falešně pozitivní reakce se mohou objevit: pokud se diagnostikum používá přímou aglutinační technikou a vyšetřovaný pacient má chladové aglutininy,

4 pokud se diagnostikum použije v nepřímém antiglobulinovém testu a vyšetřovaný pacient má pozitivní přímý antiglobulinový test. Tyto skutečnosti zdůvodňují nutnost současného provedení reagenční kontroly s NEG CONTROL. ÚČINNOST - Tyto reagencie při použití doporučených metod vyhovují požadavkům Obecných technických specifikací pro IVDMD diagnostika. - Účinnost ANTI-A (ABO1), ANTI-B (ABO2), ANTI-A,B (ABO3) byla ověřena doporučovanou metodou na více než krevních vzorcích (dárci, pacienti i novorozenci), odebraných s doporučenou antikoagulační přísadou (EDTA, heparin nebo citrát). Toto expertní ověření prokázalo 100% specifitu u běžných fenotypů A1, A2, A1B, A2B, B a O. Testy se slabými fenotypy prokázaly dobrou specifitu u fenotypů A3 a B3. - ANTI-A,B (ABO3) reaguje s erytrocyty fenotypu Ax. - ANTI-B (ABO2) neaglutinuje erytrocyty se získaným B fenotypem. - V některých případech mohou být pozorovány dvě populace krvinek: u osob nedávno transfundovaných, u některých slabých A a B fenotypů (jako A3, B3), u některých hematologických modifikací, mozaik nebo chimér. - Protilátka ANTI-A a též ANTI-A,B poskytují s antigenem Tn zkříženou reakci, která se projevuje obrazem dvojí populace (jde o vzácný jev). - Účinnost ANTI-D (RH1) IgM I, ANTI-D (RH1) IgM II, ANTI-D (RH1) TOTEM, ANTI-D (RH1) IgG a ANTI-DCE (RH1,2,3) byla ověřena doporučovanou metodou na až krevních vzorcích (dárci, pacienti i novorozenci), odebraných s doporučenou antikoagulační přísadou (EDTA, heparin nebo citrát). Toto expertní ověření prokázalo 100% specifitu u běžných Rhesus fenotypů. - Síla výsledných reakcí ANTI-D (RH1) IgM může záviset na počtu antigenních míst na krvinkách. - ANTI-D (RH1) TOTEM a ANTI-D (RH1) IgG umožňují vyhledávání slabých D (RH1) antigenů technikou nepřímého antiglobulinového testu. - ANTI-D (RH1) IgM I a ANTI-D (RH1) TOTEM mají tu vlastnost, že jsou schopny detekovat některé vzácné RH33 epitopy (RoHar), což může způsobovat diskrepanci ve srovnání s polyklonálními diagnostiky, které tyto epitopy nerozeznávají vůbec, nebo nepříliš dobře. - Jako jediné pouze ANTI-D (RH1) TOTEM diagnostikum umožňuje detekci varianty D(VI) v přímém aglutinačním testu. - Kromě toho, různé klony monoklonálních protilátek ANTI-D rozeznávají specificky určité epitopy D antigenu (viz tabulku na poslední straně). - Pro identifikaci jednotlivých RhD variant všeobecně je doporučováno užití D SCREEN kitu. LITERATURA - BETREMIEUX C., BEOLET M., KEYSER L. A new strategy for D phenotyping with TOTEM multimonoclonal ANTI-D reagent XXIII rd I.S.B.T. Congress, July ARAMBURU E., RABASA P., ESQUIROZ R., GALARRETA T., OLCOZ B. Valoracion de un antisuero anti-d IgM-IgG monoclonal (DIAGAST) et donantes de sangre con expresividad debil del antigeno D. Hematology Congress Madrid October MANNESSIER L. BLOOD TRANSFUSION CENTRE LILLE France The use of monoclonal antibodies as blood grouping reagents: applications, advantages and problems. Congress of the Italian society for blood transfusion Rome June 1992.

5 ANTI-A (ABO1) ANTI-B (ABO2) ANTI-A,B (ABO3) ANTI-D (RH1) IgM I REAGENCIE KAT. ČÍSLO KLON TŘÍDA PŮVOD 5 x 10 ml x 10 ml x 10 ml x 10 ml x 10 ml x 10 ml x 10 ml x 10 ml D10 IgM Myší 9621A8 IgM Myší 9113D D12 IgM Myší P3X61 IgM Lidský ANTI-D (RH1) IgM II 5 x 10 ml HM10 IgM Lidský ANTI-D (RH1) TOTEM 5 x 10 ml P3X61 + P3X21223B x 10 ml P3X290 + P3X35 IgM IgM IgG IgG Lidský ANTI-D (RH1) IgG 5 x 10 ml HM16 IgG Lidský ANTI-DCE (RH1,2,3) 5 x 5 ml NEG CONTROL Klony Třída DII 5 x 10 ml x 10 ml DIIIa DIIIb DIIIc P3X61 + P3X25513G8 + P3X234 IgM Lidský DIVa DIVb DVa DVI DVII DFR DBT DHAR DHMi P3X61 IgM / HM10 IgM HM16 IgG P3X21223B10 IgM P3X290 IgG + + +/ / P3X35 IgG znamená pozitivní reakci; ovšem intenzita může být různá v závislosti na počtu antigenních míst přítomných u testovaných erytrocytů. +/- znamená, že pozitivní nebo negativní výsledek může být pozorován v souvislosti s antigenicitou testovaných krvinek DIAGAST 251, AV. AVINEE LOOS FRANCE key-code : Datum revize: červen 2013

6