Sylabus Základy bioinženýrství N319002

Transkript

1 Sylabus Základy bioinženýrství N Sylabus obsahuje souhrn základních faktů předmětu Základů bioinženýrství. Pro jejich správnou interpretaci, pochopení a začlenění do kontextů je třeba mít znalosti základních předmětů, jako jsou Fyzika, Matematika, Analytická a Fyzikální chemie, Biochemie, Mikrobiologie, Chemické inženýrství. Před každou kapitolou jsou okruhy témat, u nichž je doporučeno si osvěžit své znalosti pro smysluplné vstřebání probírané látky. Za každou kapitolou jsou otázky, jejichž promýšlením (a ideálně správným zodpovězením) se lze o významný kus přiblížit k cíli absolvování tohoto předmětu, tedy získání efektivních znalostí a dovedností pro kultivaci buněk v průmyslovém měřítku a tedy i úspěšné absolvování zkoušky. Začlenění vašich dosavadních znalostí do nových kontextů a jejich rozšířením o oblasti technologického a inženýrského přístupu ke kultivacím buněk bude hlavní cíl přednášek předmětu Základy bioinženýrství. Přednášky 1. Problematika biotechnologie a bioinženýrství, struktura biotechnologického procesu. 2. Technologické aspekty využití intaktních buněk jako producentů (rostlinné vs. živočišné vs. mikroorganismy). Typy produktů. Možnosti použití enzymů. 3. Přípravné operace biotechnologických výrob (uchovávání mikroorganismů, příprava inokula, příprava a sterilizace kapalného média, sterilizace bioreaktoru, SIP, filtrace a sterilace plynů). 4. Parametry pro popis kultivace mikroorganismů. Výtěžnost a produktivita procesů. Přehled typů kultivací. 5. Vsádková kultivace (charakteristika, hmotová bilance, použití). 6. Vsádková kultivace s postupným živením (charakteristika, způsoby přítokování média, hmotová bilance, použití). 7. Kontinuální kultivace (charakteristika, způsoby řízení procesu, hmotová bilance, porovnání se vsádkovou kultivací, použití). Volbu typu kultivace na základě požadovaného produktu. 8. Aerace a přestup kyslíku (realizace aerace, mechanismus přestupu kyslíku, KLa). 9. Míchání (typy míchání v biotechnologických provozech, specifika míchání bioreaktorů). 10. Bioreaktory (rozdělení, konstrukce, použití). 11. Měřené a regulované veličiny při kultivaci buněk. Základy regulace bioprocesů (regulační okruh, typy regulátorů, veličiny v regulaci). 12. Dokončovací operace biotechnologických výrob (konvenční separační technologie, dezintegrace buněk, membránové separační technologie). 13. Dokončovací operace biotechnologických výrob (extrakce, srážení, destilace, sušení, stripování, CIP). Výrobní linka biotechnologického procesu. 14. Biotechnologie a bioreaktory pro zpracování odpadů z biotechnologických výrob. 1

2 1. Problematika biotechnologie a bioinženýrství, struktura biotechnologického procesu. Historie biotechnologií před-pasteur éra, před alkoholické nápoje (pivo, víno) - mléčné výrobky (sýry, jogurt) - další fermentované potraviny Pasteur éra, etanol, butanol, aceton, glycerol - organické kyseliny (kyselina citronová) - aerobní čištění odpadních vod éra antibiotik, penicilin - submerzní kultivace - rozšiřování palety druhů antibiotik - technologie živočišných buněk; vakcíny proti virovým onemocněním - biotransformace steroidů post-antibiotická éra, amino kyseliny - single cell proteiny (SCP) - enzymy - technologie imobilizace enzymů a buněk - anaerobní čištění odpadních vod (bioplyn) - bakteriální polysacharidy (xanthan, dextran) éra nových biotechnologií, hybridomová technologie - monoklonální protilátky - monoklonální diagnostické testy (1980) - genetické inženýrství (1974) - lidský insulin (1982) - první klonovaný živočich - ovce Dolly (1997) - publikování kompletního lidského genomu v Science and Nature (2001) Historie biotechnologií je přehledně zpracována na Biotechnologie každý proces, který využívá živé organismy nebo jejich části k tvorbě nebo úpravě produktů, k získání rostlin nebo zvířat s lepšími vlastnostmi, nebo k získání mikroorganismů pro speciální účely aplikace biologických systémů a organismů v technických a průmyslových procesech zahrnuje procesy katalyzované čistým enzymem nebo směsí enzymů, intaktní (funkční) mikrobiální, rostlinnou nebo živočišnou buňkou, nebo jednou či více organelami izolovanými z buněk 2

3 Bioinženýrství Bioinženýrství je jedna z částí biotechnologie - interdisciplinární obor (biochemie, biologie, mikrobiologie, fyzikální chemie, chemické inženýrství, biofyzika, konstrukce a stavba zařízení, měření a regulace). Bioinženýr zajišťuje průmyslovou realizaci biotechnologických procesů. Biotechnologie je průnik tří základních disciplín: biologie, chemie a inženýrství. Bioinženýrství je průnik dvou základních disciplín: biologie a inženýrství. Pro řízení biologických procesů je tedy nutné ovládat jednotlivé disciplíny ale umět je propojit a používat znalosti jednotlivých disciplín v kontextu ostatních. Základní schéma operací v biotechnologickém procesu. 3

4 2. Technologické aspekty využití intaktních buněk jako producentů (rostlinné vs. živočišné vs. mikroorganismy). Typy produktů. Možnosti použití enzymů. Podněty k zopakování si Definice rychlosti; matematické a grafické vyjádření. Kinetika chemických reakcí 0. a 1. řádu (A B). Řešení kinetických rovnic. Mechanismy reakcí, katalýza, řídící děj. Mechanismus katalyzovaných reakcí a typy katalyzátorů. Porovnání chemických a biologických katalyzátorů. Enzymy funkce, rozdělení, vlastnosti, kinetika enzymových reakcí. Význam a stanovení konstant KM a vmax v kinetické rovnici Michaelis-Menten. Řád enzymové reakce. Inhibice enzymové reakce druhy a význam. Základní druhy metabolismu mikroorganismů.. Základní metabolické dráhy a jejich návaznost. Kultivace mikroorganismů je proces, při kterém mikroorganismy spotřebovávají substrát a živiny na rozmnožování a případné produkty. Cílem je produkce požadovaného produktu co nejvyšší rychlostí, v co největším množství, nejjednodušší a nejlevnější cestou. Využívají se následující schopnosti mikroorganismů: syntetická schopnost biokonverze biodegradace biosorbce (na povrchu) bioakumulace (uvnitř buňky) Základní rozdělení produktů kultivace: biomasa primární produkty o produkty primárního (základního) metabolismu o spojeno s růstem buněk o etanol, kyseliny mléčná, citrónová, octová, metan sekundární produkty o produkty sekundárního (specifického) metabolismu; často biotransformace o nerostoucí buňky o antibiotika, steroidy, alkaloidy, vitamíny Příklady využití jednotlivých skupin mikroorganismů: plísně sýry, antibiotika, alkaloidy (námel paličkovice nachová) bakterie mléčné kvašení, vitamíny, enzymy, rozpouštědla kvasinky pekařské droždí, krmná biomasa, etanol jednobuněčné řasy oleje, škrob, biologicky aktivní látky Využívají formy a typy biokatalyzátorů: intaktní buňky o rostlinné buňky o živočišné buňky o mikrobní buňky 4

5 buněčné organely enzymy Intaktní buňky charakterizuje: dlouhodobější účinek ochrana enzymů buněčnou stěnou a membránou možno buňky zvyknout na jiný substrát univerzálnější (menší specifita) mohou mutovat Enzymy charakterizuje: možné vyšší koncentrace substrátu energeticky (provozně) méně náročné (než udržovat živou buňku) ale čisté enzymy poměrně drahé o volné enzymy - v roztoku o vázané enzymy - imobilizace nutno větší množství vícenásobné použití větší stabilita Technologické aspekty specifik mikrobiálního metabolismu Finální akceptor elektronů Chemoorganotrofní organismy získávání energii oxidací organických látek (donory elektronů). Jejich katabolismus produkuje vodík a elektrony (NADH+H + ), které musí být následně využity. Ať už je mechanismus nakládání s nimi jakýkoli, musí existovat jako poslední krok jejich předání na finální akceptor elektronů. Podle finálního akceptoru elektronů se metabolismus rozděluje na: respirace akceptor - látky přijaté z prostředí za účelem použití jako finální akceptory elektronů o aerobní (kyslík) o anaerobní (dusičnan, síran, thiosíran), pouze některá prokaryota fermentace akceptor meziprodukt odbourávání degradované molekuly (např. pyrohroznová kyselina nebo acetaldehyd) Respirace Zjednodušené schéma oxidativní fosforylace včetně finálního přenosu vodíku a elektronů při respiraci. 5

6 Fermentace Finálním akceptorem elektronů je část degradované molekuly - část molekuly se oxiduje ( - COOH, CO2) a část redukuje ( ethanol, laktát). Příklady jsou například alkoholové kvašení a mléčné kvašení prováděné některými anaerobní mikroorganismy a fakultativně anaerobními mikroorganismy (nepřítomnost O2, Crabtreeho efekt - kvasinky). Zjednodušené schéma finálního přenosu vodíku a elektronů při fermentaci (etanolové kvašení). Zjednodušení schéma finálního přenosu vodíku a elektronů při fermentaci (mléčné kvašení) prováděné homofermentativními mléčnými bakteriemi např. Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus (některé druhy). Udržovací (maintenance) energie Udržovací (maintenance) energie je energie nutná k udržení homeostáze (vnitřního prostředí) buněk a poskytuje ji tzv. basální metabolismus. Jakákoliv živá buňka představuje systém, kde stále běží rozkladné a syntetické děje = endogenní metabolismus spotřebovávající udržovací energii. Hodnota udržovací energie je téměř konstantní. Ovlivňuje ji např. koncentrace O2, limitace jinou živinou než zdrojem E. Neideální vnější prostředí znamená nutnost vydání většího množství energie na udržení optimálního vnitřního prostředí. Čím nižší růstové rychlosti tím vyšší procentuální zastoupení energie pro udržovací účely v celkovém množství spotřebované energie. 6

7 Příklady technologií rozdělených podle finálního akceptoru elektronů Metabolismus Příklad mikroorganismu Technologie Základní popis Fermentace Methanobacterium produkce bioplynu CH3-COOH bryantii čištění odpadů CH4+CO2 Saccharomyces produkce etanolu Glukóza cerevisiae 2CH3CH2OH + Aerobní respirace Anaerobní respirace Lactococcus lactis produkce mléčné kyseliny Clostridium acetobutylicum většina mikroorganismů používaných biotechnologiích v (chemoorganotrofní) Nitrosomonas sp. (chemolitotrofní) Paracoccus denitrificans Methanothrix soehngenii produkce biorozpouštědel aerobní produkce sekundárních metabolitů produkce biomasy (droždí) aerobní čistění odpadní vody a plynu odstranění amoniaku z odpadní vody nebo plynu odstranění dusičnanů/dusitanů z odpadní vody produkce bioplynu čištění odpadů 2 NH3 + 4 O2 2 NO H + + H2O (dvoustupňový proces) 2 NO3 - + organická látka (zdroj e - +H + ) N2 + (CO2 + H2O) (zjednodušená rovnice) CO2+4H2 CH4+2H2O Poznámka 2CO2 Glukóza 2CH3-CHOH- COOH složitý mechanismus - vznik směsi CH3CH2OH, CH3COCH3 a CH3(CH2)2OH C6H12O6 + 6 O2 6 CO H2O Více viz kapitola 14 alkoholová fermentace (kvašení) mléčná fermentace (kvašení) acetonbutanoletanolová fermentace Uhlíkatá látka - zisk energie a zdroj uhlíku Proces nitrifikace Proces denitrifikace Více viz kapitola 14 7

8 Přehled metabolických efektů a jejich technologických důsledků Pasteurův efekt Crabtreeho efekt Kyslíkový efekt Glukózový efekt Katabolická represe kvasinka Saccharomyces cerevisiae (fakultativně anaerobní) v přítomnosti kyslíku zpomaluje kvašení (fermentace) a zrychluje se růst kultury (využití aerobní respirace). kvasinka Saccharomyces cerevisiae v médiu s velkou koncentrací glukózy provádí fermentaci i v přítomnosti kyslíku tj. místo aerobní respirace. Následkem je neefektivní využití glukózy-substrátu. Metabolismus fakultativně anaerobních mikroorganismů v přítomnosti kyslíku. Podstatou je represe metabolických drah (fermentace nebo anaerobní respirace) v přítomnosti kyslíku a indukce drah, které jsou třeba k jeho využití jako finálního akceptoru elektronů. Utilizace směsi glukózy a dalšího substrátu. Podstatou je represe ostatních metabolických drah glukózou. Následkem je diauxie. Utilizace směsi různě utilizovatelných substrátů. Podstatou je represe metabolických drah hůře utilizovatelných substrátů těmi snáze. Následkem je diauxie. Způsoby technologického využití enzymů Enzymy je možné použít jako volné ( rozpustné ; disperze ve vodném médiu) enzymy nebo imobilizované. Volné enzymy jednorázová aplikace nízká stabilita volného enzymu drahé (jednorázové použití) Imobilizované enzymy Důsledkem imobilizace je částečná ztráta aktivity enzymu z důvodu možné blokace aktivního centra (zvláště při náhodné imobilizaci). Proto se snažíme používat orientovanou imobilizaci kdy jsou cíleně aktivní centra imobilizovaného enzymu orientována od nosiče. Výhody imobilizovaných enzymů oproti volným: opakované použití zvýšení stability enzymů a prodloužení doby jejich aktivity odpadá separace produktu a enzymu možnost kontinuálního provozu možnost účinnějšího řízení procesu Způsoby imobilizace enzymů Fyzikální adsorpce alumina, kaolin, ionexy (jednoduché ale uvolňování enzymů) Inkluze enzymů ve struktuře (bio)polymerního gelu (alginát, želatina ), polopropustné membrány (semipermeabilní trubičky, ultrafiltrační membrány) nebo nanomatric. Kovalentní imobilizace na nosiče nesoucí vhodné funkční skupiny (-NH2, COOH, - SH, -OH) Příklad: 8

9 skupiny -NH2 na nosiči i enzymu + glutaraldehyd -NH2 + HCO- -N=CH- Zesítění - spojení aminoskupin patřících k různým enzymům (např. NH2 + glutaraldehyd) tvorba proteinových agregátů ( submerzní proces ale relativně snadná separace) Imobilizace na magnetické nosiče - polymerní částice s magnetickými oxidy železa, silanizovaný magnetovec ( submerzní proces imobilizovaných enzymů a zároveň snadná separace) Aplikace imobilizovaných enzymů míchané reaktory náplňové reaktory reaktory s fluidním ložem ultrafiltrační membránové systémy Vlivy na enzymovou aktivitu mají: inhibitory aktivátory koncentrace substrátu koncentrace enzymu fyzikálně-chemické vlastnosti prostředí o ph o teplota o iontová síla mechanické vlivy o střižné síly (míchání) Náměty k přemýšlení a procvičení znalostí Porovnejte použití enzymů a intaktních buněk z technologického hlediska. Jaké jsou mechanismy působení ph, teploty a střižných sil na enzymovou aktivitu? Je rozdíl v nárocích na přesnost regulace teploty a ph mezi intaktními buňkami a enzymy? Pokud ano tak proč? Porovnejte základní druhy metabolismu z hlediska finálního akceptoru elektronů. V jakém stavu, z chemického hlediska, musí být látka, aby mohla sloužit jako finální akceptor elektronů? Jaké jsou důsledky metabolických efektů na kultivaci buněk? Jaké jsou technologické důsledky existence udržovací (maintenance) energie? 9

10 3. Přípravné operace biotechnologických výrob (uchovávání mikroorganismů, příprava inokula, příprava a sterilizace kapalného média, sterilizace bioreaktoru, SIP, filtrace a sterilace plynů). Podněty k zopakování si Vztah mikroorganismů k teplotě a chemickým látkám v okolí, termorezistence jednotlivých fyziologických stavů mikroorganismů. Výměníky tepla, transport tepla, prostup a přestup tepla. Biotechnologický proces Obecné schéma biotechnologického procesu. Přípravné operace (upstream procesy) uchovávání mikroorganismů příprava inokula příprava kapalného média sterilace kapalného média filtrace a sterilace plynů 10

11 Uchovávání mikroorganismů Délka a podmínky uchovávání závisí na rychlosti změn vlastností buněk, tedy na typu a stavu buněk a způsobu uchovávání. Dlouhodobé - inaktivní buňky lyofilizace (sublimace ledu za podtlaku + kryoprotektant) pod vrstvou parafinu (plísně), hluboké zmrazení -80 C hlubokomrazící box (+ kryoprotektant) velmi hluboké zmrazení -140 C - tekutý dusík (+ kryoprotektant) Krátkodobé - aktivní buňky lednice 4-6 C (lépe odstředěné než v médiu) na agaru či jiném pevném médiu (přeočkovávání každých 4-6 týdnů) Kryoprotektanty zabraňují vzniku ledových krystalů, které by při svém vzniku zničily buňky (její struktury). Ledové krystaly jsou ostré a mají větší objem než kapalná voda. Koncentrace kryoprotektantů se liší podle konkrétního použití, ale jsou většinou v rozmezí %. glycerol (zamrazování) dimethylsulfoxid (DMSO) (zamrazování) sacharóza (lyofilizace) Příprava kapalného média Mikroorganismy vyžadují určité spektrum chemických látek využívaných jako živiny a zdroje energie: látky využívané pro výstavbu buněk (asimilace) látky využívané pro získávání energie (disimilace) některé látky plní obě funkce - často uhlíkaté látky využívané jako zdroj uhlíku a energie (glukóza) anorganické živiny základní prvky (C, N, O, H) makroprvky (zdroje S, P, Mg, K ) stopové prvky (Fe, Mn, Cu ) organické živiny - organické zdroje C, N, P a specifické látky např. AMK, vitamíny - esenciální živiny (eukaryota) Příprava kapalného média Rozpuštění navážených složek média v upravené vodě (demineralizace, odstranění chloru) v míchané nádobě (vrtulové míchadlo) Úprava ph (před někdy nutné i po sterilaci) Odstranění O2 (anaerobní kultivace) o sterilací (s teplotou klesá rozpustnost plynů) o nahrazení jiným plynem (N2, CO2, H2). o přídavek redukujících chemických látek (kyselina thioglykolová nebo její sodné soli, cystein, redukované železo) Sterilace Destrukce (tepelná, chemická) nebo odstranění (filtrací) všech životaschopných forem mikroorganismů. Je nutné ji provést co nejdříve po přípravě média (minimalizace změn média kontaminací). Provedení: 11

12 o tepelná (suché, vlhké teplo) o (mikro)filtrace o záření o chemická Sterilace teplem Tepelná destrukce mikroorganismů - tepelná denaturace enzymů základního významu. Je vhodná pouze pro termostabilní média! Provedení: Průmyslové provozy převážně separátně sterilovat médium (průtokový sterilizátor) a bioreaktor. Experimentální/laboratorní reaktory - převážně sterilace reaktoru s médiem. Účinnost sterilace je funkcí teploty, času, podmínek, druhu mikroorganismu, fyziologickém stavu a koncentraci buněk. Vliv vlastností média na účinnost sterilace teplem: vlhkost ( ) ph ( ) obsah lipidů, bílkovin a sacharidů ( ) Vlastní provedení sterilace může být in-situ nebo ex-situ: in-situ nepřímým ohřevem přes duplikátor (pára) nebo elektricky přímou aplikací ostré (přehřáté) páry do reaktoru (pozor na zředění média zkondenzovanou párou!) ex-situ suchá sterilace (suchým vzduchem) v sušárně - nástroje C/2 hod vlhká sterilace (párou) - média, reaktory o autokláv 0,2 MPa/121 C/15-45 min o sterilace přímou parou, 135 C/5 minut Kinetika procesu r dc dt k = f (teplota, podmínky, druh mikroorganismu, fyziologický stav buněk,) Letalitní křivka je závislost mezi letální teplotou (T) a logaritmem doby působení (log τ). Přímka spojuje body za daných podmínek, kdy jsou všechny mikroorganismy usmrceny. Vyjadřuje základní vztah mezi teplotou a dobou sterilace: čím vyšší teplota tím kratší čas nutný pro usmrcení mikroorganismů. Při sterilaci teplem je nutné věnovat pozornost: k C k rychlostní konstanta odumírání c koncentrace buněk obsahu termolabilních látek obsahu vzájemně spolu reagujících látek obsahu spor obsahu ochranných látek intenzitě vedení tepla T k log q 12

13 Termolabilní látky vitamíny, růstové faktory, bílkoviny Řešením je jejich sterilace filtrací a aseptické přidání po zchladnutí média ionty kovů prvky - srážení v neutrálním a zásaditém prostředí ionty OH - 3- a PO 4 Řešením je: o přídavek chelatačního činidla (EDTA, citrát) - sníží volnou koncentraci o oddělená sterilace stopových prvků a fosforečnanů o snížení ph média Vzájemně spolu reagující látky Při sterilaci může probíhat Maillardova reakce - karamelizace cukerné složky: reakce mezi redukujícími cukry a volnými aminoskupinami proteinů. Produkty reakce mohou působit inhibičně na růst mikroorganismů. Řešením je cukernou složku sterilovat zvlášť a asepticky přidat po zchlazení média. Obsah spor Příkladem jsou spory rodu Clostridium - C. botulinum vytváří velmi tepelně odolné i při 120 C po dlouhou dobu. Řešením je: frakcionovaná (přerušovaná) sterilace 1. sterilace zchlazení + čas na vyklíčení spor (~ h) 2. sterilace snížení ph sterilovaného média Obsah ochranných látek Látky lipidy, bílkoviny a sacharidy mají ochranný účinek vůči působení tepla. Řešením je prodloužení sterilace, vyšší teplota event. odstranění těchto látek. Intenzita vedení tepla Nutno počítat se zpožděním dosažení sterilační teploty např. v jádru velkých objemů (nemíchaných) kapalin, potravin v obalech (konzervy, nápoje v lahvích atd.). Sterilační čas je nutné počítat od dosažení sterilizační teploty v celém sterilovaném objemu. Na to je třeba brát zřetel i v laboratorní praxi např. při sterilaci reaktoru s médiem nebo velkých baněk v autoklávu: 1. problém Teplota v jádru kapaliny se na požadovanou hodnotu dostane až se zpožděním z důvodu pomalého vedení tepla v nemíchané kapalině, což je nutno zohlednit. Čím větší objem tím delší čas prohřátí a tudíž sterilaci celého objemu. 2. problém Při skončení sterilace se kapalný obsah reaktoru (velké baňky) chladí mnohem pomaleji než okolní prostor v klávu (vedení tepla v nemíchané kapalině). Při příliš prudkém poklesu tlaku se kapalina dostává do nové rovnováhy (kapalina-pára) tak, že prudce vyvře. Řešením je: mírné a postupné snižování tlaku v klávu bez automatizace po skončení sterilace teplotní sonda, které se umístí do referenční podobně velké nádoby a podle její teploty kláv upravuje program sterilace (moderní automatické klávy) vhodný teplotní program, který zohlední jak zahřívání tak chladnutí kapalného média 13

14 Sterilace filtrací Používají se membránové filtry, běžné s velikosti pórů 0,2 μm (vegetativní formy a spory) Materiál membrán: vodné roztoky - celulózo-acetátová membrána nevodné roztoky (ethanolové, DMSO) - hydrofóbní polymery rezistentní k rozpouštědlům nylon, teflon Používají se pro: malé objemy kapalných médií s minimem suspendovaných pevných částic (kromě mikroorganismů) média obsahující termolabilní látky (vitamíny, růstové faktory) médium obsahuje kovy, které se při sterilaci teplem vysrážejí filtrace plynů Sterilace zářením Používají se γ, β nebo UV záření. Mechanismus je v přímé denaturaci nebo ničení (makro)molekul (bílkoviny, DNA) nebo rozkladu vody na peroxidy/radikály, které sterilují. Používají se pro: termolabilní materiály/média γ event. β - hloubková sterilace UV - povrchy nebo plyny/kapaliny Sterilace chemická Používají se např. ethylenoxid, peroxid vodíku, kyselina peroctová, oxid chloričitý, formaldehyd. Principem je chemická reakce nukleofilů nebo radikálů s molekulami v buňkách = destrukce (makro)molekul. Používá se pro: vybavení Petriho misky (balení prázdných sterilních - kyselina peroctová) zařízení, laboratorní přístroje nástroje Úprava a sterilace plynů Vzduch z atmosféry obsahuje prachové částice, aerosol, mikroorganismy, chemické látky a je nutné ho upravovat. záření (UV) - spíše (výrobní) prostory haly, laboratoře filtrace 1. odstranění hrubších nečistot filtrací + komprese 2. sterilace mikrofiltrace (pro aseptické procesy) o membránové filtry o hloubkové filtry dlouhý filtr naplněný sterilizovatelným vláknitým (celuláza, skelná vata, syntetická vlákna) event. zrnitým materiálem obohacení kyslíkem (zvýšení parciálního tlaku kyslíku) výroba kyslíku: o molekulová síta (adsorbce menšího O2 průchod většího N2) o destilace vzduchu Příprava inokula Inokulum je startovní množství buněk nebo spor. Jeho kvalita a množství je klíčový faktor kultivace. 14

15 Získání inokula Vlastní výroba (propagační stanice) - velké podniky Nákup od velkých podniků nebo specializovaný podniků - malé podniky, kterým by se nevyplatila propagační stanice - typicky malé pivovary Nadnárodní potravinářské podniky mají většinou několik provozů vyrábějících stejný výrobek a proto je nutná unifikace = centrální zásobování inokulem (např. zmražená suspenze, která se dávkuje přímo do reaktoru) Propagace je několika stupňová kultivace buněk ve speciálním technologickém celku nazývaném propagační stanice, které následně slouží jako inokulum produkčního reaktoru. Jedná se o série kultivačních nádob (baňky následně reaktory) přičemž každá následná je cca 5-10 x větší než předešlá. Buněčná suspenze z předchozího reaktoru slouží jako inokulum následujícího. Kultura se při propagaci přeočkovává a provozní reaktor následně inokuluje buňkami v exponenciálním růstu. Propagační poměr je poměr objemu inokula a čerstvého kultivačního média, většinou 1:5-1:10. Důvody propagace respektive propagační stanice tj. samostatné produkce inokula je získání velkého množství inokula do produkčního reaktoru, přičemž benefity jsou: menší nebezpečí kontaminace zkrácení lag-fáze zkrácení doby kultivace vyšší produktivita produkčního reaktoru (nekultivujeme inokulum v něm = odstranění tohoto neprodukčního času) Proces propagace lze rozdělit na propagaci: 1. laboratorní - inokulum je skladovaná kultura (zamražená, lyofilizovaná, agary) Začíná se baňkami a následně laboratorními reaktory, přičemž získáme ~ litry suspenze. 2. provozní - jako inokulum je suspenze z laboratorní propagace. Používají se malé provozní reaktory, přičemž získáme ~ m 3 suspenze. Náměty k přemýšlení a procvičení znalostí Jak se při jednotlivých typech uchovávání mohou měnit vlastnosti mikroorganismů? Jaké způsoby použijete pro krátkodobé a jaké pro dlouhodobé skladování? Jaký je rozdíl mezi základním a komplexním medium? Definujte složení média pro fototrofní vs. chemotrofní; aerobní vs. fakultativně aerobní vs. anaerobní; autotrofní vs. heterotrofní; eukaryotní vs. prokaryontní mikroorganismy. Jaké další požadavky na kultivaci - další nezbytné složky prostředí - mají zástupci těchto skupin mikroorganismů? V jakých chemických formách dodáte do média základní prvky (C, N, O, H, P, S, K, Mg)? Závisí forma na druhu použitého mikroorganismu? Jakého řádu je kinetika tepelné sterilizace? Jaká jsou omezení použití sterilace teplem při produkčních technologiích kultivace buněk a v potravinářských výrobách? Jaký je rozdíl mezi pasterací a sterilací? Při jakých biotechnologických procesech se používá pasterace a při jakých sterilace? Uveďte postup, jaký byste použili pro sterilizaci kapalného média s tepelně labilní složkou s využitím tepelné sterilace. Uveďte postup přípravy sterilního reaktoru s médiem připraveného k inokulaci včetně postupu přípravy (sterilního) média z výchozích látek. 15

16 4. Parametry pro popis kultivace buněk. Výtěžnost a produktivita procesů. Přehled typů kultivací. Podněty k zopakování si Základní matematické funkce (lineární, exponenciální, logaritmické, parabolická, hyperbolická) matematické a grafické vyjádření. Integrace základních matematických funkcí. Disperzní soustavy. Lambert-Beerův zákon: matematické a grafické vyjádření, použití pro spektrofotometrické stanovení barevných roztoků a suspenzí. Základní vlastnosti bakterií, kvasinek a plísní (stavba, nároky na prostředí a živiny, metabolismus, tvorba spor). Nároky mikroorganismů na prostředí a jejich rozdělení podle jejich nároků na kyslík, ph, vodní aktivitu, teplotu, zdroje uhlíku, zdroje energie. Základní termíny kinetiky rozmnožování mikroorganismů: doba zdvojení, generační doba, synchronizovaný růst, růstová křivka. Jakými metodami lze stanovit počet buněk? Jakou vypovídací schopnost jednotlivé metody mají? Kultivace mikroorganismů Faktory ovlivňující kultivaci: Fyzikální faktory (T, p, ph) Chemické faktory (kvantita a kvalita živin, O2, H2O, přítomnost dalších chemických látek) Biologické faktory (stav a množství inokula, přítomnost dalších (mikro)organismů) Technologické faktory (uspořádání procesu batch, fed-batch, kontinuální) Mechanické faktory (proudění kapalin/plynů, střižné síly) Prostorové faktory (koncentrace mikroorganismů, kontakt s pevným materiálem) Důvody proč sledovat a regulovat parametry ovlivňující mikroorganismy jsou dvojího druhu: Využití optimálních podmínek optimalizace podmínek kultivace = maximální produkce (biomasa, produkty) Využití nepříznivých podmínek potlačení/usmrcení nežádoucích mikroorganismů Působení prostředí vede ke změnám ve vlastnostech mikroorganismů: Fyziologické a metabolické změny krátkodobé působení faktorů reakce organismu (přizpůsobení) v rámci aktuálních regulačních mechanismů (založených na aktuální genetické výbavě) = rychlé reakce na fyziologické úrovni krátkodobé změny (závisí na době působení faktoru) Evoluční změny dlouhodobé působení faktorů selekční lépe přizpůsobených jedinců/populací = změny na genetické úrovni dlouhodobé změny Podmínky a jejich působení na fyziologii mikroorganismů: Optimální podmínky bez fyziologických změn, optimální růst/produkce Mírně vzdálené od optima (+ nebo -) 16

17 stres, produkce stresových faktorů, fyziologické i metabolické změny, pokles růstu/produkce Zásadně vzdálené od optima (+ nebo -) o mikrobistatické podmínky způsobují zastavení rozmnožování o mikrobicidní podmínky způsobují smrt Přehled základních vlivů prostředí na mikroorganismy a možnost jejich využití proti mikroorganismům. Vliv prostředí Možnost využití proti mikroorganismům Chemické látky mytí a sanitace, dezinfekce (NaOH, detergenty, Cl2, NaClO) antimikrobiální účinky (antibiotika, detergenty) ovlivnění fyzikálně-chemických vlastností prostředí např. ph Teplota sterilace pasterace skladování za snížené teploty nebo zamražením ph snížení ph potravin = zvýšení trvanlivosti (hlavně proti bakteriím) tepelná sterilace účinnější při nižším ph Vodní aktivita snížení obsahu vody - sušení (maso, ovoce ) zvýšení koncentrace rozpustných látek (nasolení, vysoká koncentrace cukrů) Oxidoredukční potenciál uchovávání v ochranné atmosféře (CO2, N2) - eventuální anaerobní rozklad je mnohem pomalejší. Záření UV záření sterilizace prostor (laminární boxy, místnosti ); germicidní lampy nm γ-záření speciální sterilizace proniká do hloubky např. potravin (čerstvé maso) nemění organoleptické vlastnosti potravin Hydrostatický tlak vliv mají až vysoké hodnoty - tlaky vyšší než cca 10 MPa zpomalení až zastavení rozmnožování usmrcení až řádově stovky MPa po dlouhou dobu Mechanické vlivy mechanická dezintegrace buněk. Elektrický proud střídavý zahřívání stejnosměrný elektrolýza, vznik biocidních látek (Cl2, atomární kyslík) Ultrazvuk mechanická dezintegrace buněk. Model růstu a množení, rychlost růstu buněk, růstová křivka Kinetické rovnice růstu mikroorganismů Kinetické rovnice růstu mikroorganismů je ekvivalentem chemické kinetiky 1. řádu. Kinetická konstanta se nazývá specifická růstová rychlost a značí se malým řeckým písmenem μ. Jednotkou je čas -1. dx dt dx dt x Výpočet specifické růstové rychlosti Úpravou (integrací) kinetické rovnice získáme rovnici přímky, kde μ je směrnicí: X X ln X 0 t X ln X 0 t 17

18 Vlastnosti specifické růstové rychlosti μ závisí především na: druhu mikroorganismu složení média zdroji C a E zdroji N přítomnost O2 teplota ph Kinetika odumírání mikroorganismů Kinetické rovnice odumírání mikroorganismů je ekvivalentem chemické kinetiky 1. řádu. Kinetická konstanta se nazývá specifická rychlost odumírání a značí se malým řeckým písmenem δ. Jednotkou je čas -1. dx dt Po spojení s rovnicí pro růst získáme komplexnější popis kinetiky mikrobní populace (růst i odmírání): dx dt Závislost specifické růstové rychlosti na koncentraci substrátu Závislost specifické růstové rychlosti na koncentraci substrátu vyjadřuje Monodova rovnice: X X X max S K s S X Lze vyjádřit pro každou živinu S pak představuje koncentraci substrátu, dusíkatého zdroje, kyslíku. Grafickým vyjádřením je hyperbolická závislost: K S 1 max 1 1 S max linearizace KS vyjadřuje afinitu buňky k substrátu (čím menší hodnota tím větší afinita) μmax vyjadřuje maximální hodnotu µ za daných podmínek 18

19 Růstová křivka Růstová křivka je grafické vyjádření závislosti počtu mikroorganismů na čase v průběhu vsádkové kultivace. 1. lag-fáze 2. fáze zrychleného růstu 3. exponenciální fáze 4. fáze zpomaleného růstu 5. stacionární fáze 6. fáze odumírání Růstová křivka Pro celou růstovou křivku platí obecný vztah: dx X X X dt V různých fázích nabývají rychlostní konstanty různých hodnot nebo i závislosti na čase (konstantnosti) Změny fyziologie buněk v různých fázích růstu Je třeba si uvědomit, že existují zásadní rozdíly ve fyziologii buněk při jednotlivých fázích růstové křivky, které se projevují například rozdílnou citlivostí buněk ke změnám prostředí: největší citlivost je ve fázi zrychleného růstu a exponenciální fázi (největší buněčná aktivita metabolická aktivita i výměna mezi buňkou a prostředím) = řízení kontinuálních procesů je náročné nejmenší citlivost je ve stacionární fázi a fázi odumírání (nejmenší buněčná aktivita) 19

20 Fáze Charakteristika Příčiny Mat. popis Lag fáze Buňky se nerozmnožují, buňky rostou - zvětšují hmotnost a objem adaptace na nové prostředí - přestavba buňky příprava na rozmnožování z klidového stavu na buňku rozmnožující se - Délka lag-fáze závisí na: exponenciálně rostoucí. druh mikroorganismu fyziologický stav buněk μ = δ = 0 velikost inokula složení média podmínkách prostředí Obecně lze říci, že čím větší je rozdílnost podmínek v kterých je kultura před zaočkováním a po zaočkování tím delší bývá lag-fáze. Délka lag-fáze neovlivní zbytek růstové křivky Fáze zrychleného růstu Exponenciální fáze Fáze zpomaleného růstu Stacionární fáze Přechodová fáze začínající rozmnožování jeho postupné zrychlování Buňky se rozmnožují největší rychlostí (μ = μ max) za daných podmínek; počet buněk roste exponenciálně. Charakteristická veličina je specifická růstová rychlost μ. Produkční fáze při získávání biomasy nebo primárních metabolitů. Přechodová fáze zpomalování rozmnožování Makroskopicky se projevuje jako konstantní koncentrace buněk. koncentrace buněk je konstantní zastavuje se růst a poté množení přestavba buněk z rostoucích na klidové v buňkách se hromadí zásobní látky může docházet k přípravě ke sporulaci Produkční fáze při získávání sekundárních metabolitů. Fáze odumírání buňky se nerozmnožují pokles koncentrace buněk odumírání lyze buněk postupný náběh metabolismu na plnou rychlost event. rozdíly v adaptaci mezi jednotlivými buňkami (nesynchronizované) kultury splněny všechny požadavky buněk fyzikálněchemické parametry i složení média pro růst maximální rychlostí začínající působení příčin zmíněných ve stacionární fázi spotřebovaný substrát hromadění metabolitů (přímá nebo nepřímá toxicita (změna ph, redox potenciálu ) inhibice produktem limitace živinou (jinou než substrát) vysoká koncentrace buněk (bakterie max. 10 9, kvasinky max mL -1 ) Viz stacionární fáze. μ 0 μ = f(t) δ = 0 μ 0 μ f(t) δ = 0 μ 0 μ = f(t) δ = 0 μ 0 a buď μ = δ = 0 stacionární stav nebo μ = δ 0 dynamická rovnováha μ = 0 δ 0 20

21 Vliv specifický aspektů mikrobiálního metabolismu na kultivaci buněk Diauxie Reakce mikroorganismů na více zdrojů uhlíku, energie nebo minerálních živin může být dvojí: postupná utilizace = diauxie souběžná utilizace Obecně jde o směs různě utilizovatelných živin. Typickými příklady je utilizace směsí: glukóza/fruktóza + laktóza/maltóza NH4 + + NO3 - Podle tohoto pohledu se jednoduché cukry mohou rozdělit na dvě skupiny: I. Glukóza, manóza, fruktóza (přednostně utilizované) II. Laktóza, xylóza, maltóza Směs cukrů z I a II skupiny dojde k diauxii, směs cukrů z jedné skupiny nevyvolá diauxii. Vysvětlení jevu je efekt katabolické represe a glukózový efekt. Jedná se o projev regulačních schopností buňky - výběr nejekonomičtějšího substrátu: minimalizace počtu a/nebo délky metabolických drah přednostní využití konstitutivních enzymů nesyntetizování induktivních enzymů (represe přítomností lépe využitelného substrátu nebo nějakého meziproduktu jeho metabolické dráhy) Represe ostatních drah je na úrovni transportu, syntézy enzymů i genetické. Růstová křivka pro dva růstové substráty bez diauxie (vlevo) s diauxií (vpravo). Růstová křivka pro tři růstové substráty s diauxií polyauxie (více než 2 substráty). 21

22 Inhibice růstu substrátem Vysoká (inhibiční) koncentrace substrátu se vyskytuje: typicky u batch-kultivací na počátku typicky pro alkoholy, organické kyseliny, uhlovodíky Důsledkem je: prodlužuje se lag-fáze snižuje hodnoty μ v exponenciální fázi snížení celkového nárůstu buněk Řešením je použití fed-batch kultivace. Pokud je cílem produkce biomasy je pro požadovanou koncentraci biomasy (vysokou) je potřeba dodat odpovídající množství substrátu. Tudíž požadovaná vysoká konečná koncentrace biomasy znamená i nutnost vysoké počáteční koncentrace při batch procesu. Tato koncentrace substrátu by téměř jistě byla inhibiční. Proto se používá fed-batch kultivace, tedy přítokovaná, kdy se substrát přidává postupně tak aby jeho koncentrace nedosáhla inhibiční hodnoty. Tento jen lze i využít například při konzervaci potravin vysokými koncentracemi cukru (inhibice + osmotický efekt). Konzervace vysokou koncentrací soli způsobí pouze osmotický efekt. max K s S S S K 2 i Grafické znázornění Monodovy rovnice při inhibici substrátem (bez fáze růstu v přebytku). Toxický substrát jako například fenol. 22

23 Grafické znázornění Monodovy rovnice při inhibici substrátem (s fází růstu v přebytku). Pro substrát typu glukóza. Inhibice růstu produktem Hromadění jednoho nebo více produktu metabolismu při kultivaci (hlavně u batch kultivací) může vyvolat inhibice růstu produktem. Mechanismus je dvojí: přímá inhibice produktem (toxicita, zpětnovazebný efekt) nepřímá inhibice změnou parametrů prostředí zapříčiněnou produktem (změna ph (kyseliny), redox potenciálu ) Důsledky jsou: Nižší tvorba produktu nebo biomasy Nevyužití limitující živiny (ztráty) Pozor: Neovlivňuje délku lag-fáze ani hodnotu μ v exponenciální fázi. Řešením může být: kontinuální kultivace (vyplavování metabolitů) kontinuální odstraňování produktu o srážení (kys. citronová) o mikrofiltrace odstraňování média (v podstatě recykl buněk) o stripování těkavých metabolitů (ethanol, biorozpouštědla) 23

24 max K s S S P K i Růstová křivka pro kultivaci s inhibicí produktem. Parametry kultivace biologické růstová rychlost max, K S výtěžnostní koeficienty Y X / S Y P / Y S P / X Y P /O Y 2 X /O2 produktivita Pr fyzikálně-chemické ph, T, redox potenciál koncentrace X, S, P, CL technologické parametry reaktoru/kultivační nádoby (objem celkový a pracovní, výška hladiny, pracovní tlak, typ míchadla, typ distributoru vzduchu ) RPM (revolutions per minute) otáčky míchadla za minutu VVM (volume per volume per minute) míra aerace - objem plynu na objem vsádky za minutu fyzikální V, m, ρ. m, F Výtěžnostní koeficienty 24

25 Typy kultivací podle stavu buněk povrchová kultivace na povrchu kapaliny nebo imobilizované na pevném médiu - biofilm submerzní kultivace suspenze mikroorganismů - jednotlivé buňky nebo shluky buněk - flokule Typy kultivací podle technologie jednorázová (batch) jednorázová s postupným živením (fed-batch) semikontinuální kontinuální Náměty k přemýšlení a procvičení znalostí Vysvětlete pojmy asimilace i disimilace živiny a uveďte příklady. Z jakého důvodu je potřeba ke konstatování Buňky se rozmnožují největší rychlostí (μ = μmax) přidat za daných podmínek? Rozveďte jednotlivé body seznamu vlivů na specifickou růstovou rychlost (μ) str. 18 nahoře. Jak lze vyjádřit a jaké jsou jednotky X při měření růstové křivky? Jaké metody stanovení množství buněk byste pro měření růstové křivky použily a jaké jsou jejich výhody a omezení? Jaké je limit využití Lambert-Beerova zákona při měření koncentrace buněk (obecně suspenzí)? Jaký je rozdíl mezi termíny historie buněk a stáří buněk. Je možné nastavit podmínky tak aby růstová křivka začínala přímo exponenciální fází, a tedy nebyla lag-fáze? Jak byste to případně realizovali? Z jakého parametru kultivace poznáte, že se jedná o inhibici produktem? Jakých hodnot dosahuje koeficient výtěžností YX/S a na jakých parametrech to závisí? Jaké jsou příčiny a podstata lýze buněk a jaké jsou její technologické důsledky? Popište postup laboratorního experimentu a jeho vyhodnocení pro získání závislosti specifické růstové rychlosti na neinhibičním a inhibičním substrátu. 25

26 5. Vsádková kultivace (charakteristika, hmotová bilance, použití). Podněty k zopakování si Diferenciální rovnice: metody řešení, počáteční a okrajové podmínky. Totální diferenciál. Řešení soustav diferenciálních rovnic. Základní pojmy bilancování hmoty a energie: výchozí vztahy, bilancovaný systém, období a veličina, předpoklady a zjednodušení. Vsádkový chemický reaktor. Ideálně míchaný reaktor. Charakteristika vsádkové kultivace nazývá se také jednorázová nebo batch kultivace jednorázová kultivace inokulace na začátku kultivace kompletní médium na počátku kultivace; celý pracovní objem reaktoru koncentrace extracelulárních produktů na počátku kultivace je nulová Realizace vsádkové kultivace 1. naplnění reaktoru médiem o finálním složení i objemu 2. sterilace (přímá, nepřímá pára + míchání) 3. ochlazení média na kultivační teplotu 4. konečná úprava ph 5. očkování (zahájení kultivace) 6. spuštění aerace (přetlak oproti atmosféře) 7. kultivace (kontrola, měření, regulace, vzorkování) Měří se a případně reguluje: ph, kyslík, redox potenciál, teplota, koncentrace biomasy, substrátů, živin, složení plynů (O2, CO2 ). 8. ukončení kultivace (vypnutí měřících a regulačních obvodů, aerace a míchání) 9. vypuštění vsádky 10. mytí, čištění a výplach reaktoru (zbavení pevných nečistot, v případě kontaminace desinfekce a provedení perfektního výplachu, aby se odstranily iontově aktivní mycí prostředky a desinfekce) Použití vsádkové kultivace produkce biomasy (ne vždy vhodné inhibice substrátem) produkce primárních metabolitů produkce sekundárních metabolitů Hodnocení vsádkové kultivace Výhody Nevýhody mírně nižší investiční náklady relativně jednoduchý proces flexibilní vysoké náklady na opakovanou přípravu inokula malá produktivita jednotlivé kultivace se mohou dost lišit 26

27 zatěžování zařízení opakovaným mytím a sterilacemi nevhodné v případě: o inhibice substrátem o inhibice produktem o glukózový efekt Hmotová bilance jednorázové kultivace Předpoklady a zjednodušení bilance Akumulace dokonale míchaný reaktor bilanční období: začátek je právě inokulovaný reaktor a konec ukončení kultivace (nezahrnuty přípravné operace jako napouštění media, inokulace, finální úprava media ani následné operace jako vypouštění, zpracování suspenze aj.) ρ = konstantní zanedbání úbytku objemu v důsledku odparu vody (aerovaný systém) a odběru vzorků zanedbání zvýšení objemu v důsledku přídavků kyseliny/hydroxidu při ph regulaci mcelk (ρ = konst.) d(ρ V) = ρ dv dt dt = 0 ms d(s V) dt mx d(x V) dt = V ds dt = V dx dt dv V = konst. => dt = 0 mp d(p V) dt = V dp dt Bilance celkové hmoty [vstup] + [zdroj] = [výstup] + [akumulace] dv dt dv 0 dt Bilance biomasy 0. X. V 0 V. dx dt X Bilance substrátu. X 0. V 0 YX / S ds X dt dx dt V. Y X / S ds dt 27

28 Bilance produktu vázaného na růst μ X [0] + [Y P/S V] = [0] + [V dp Y X/S dt ] dp dt = Y μ X P/S Y X/S Bilance produktu nevázaného na růst probíhá ve stacionární fázi [0] + [β X V] = [0] + [V dp dt ] dp = β X dt Produktivita jednorázové kultivace Množství biomasy m X X V ( ) final 0 L g Výtěžnost X X YX / S S S Produktivita final S X P R = Δm X V t = (X X start) V V (t g + t d ) P R = Δm P V t = (P P start) V V (t g + t d ) 0 final 0 g g (g l 1 h 1 ) (g l 1 h 1 ) td - mrtvý čas (čištění, sterilace, lag fáze, zpomalení růstu) tg - exponenciální fáze Náměty k přemýšlení a procvičení znalostí Definujte posloupnost základních kroků spuštění a provozování vsádkové kultivace od reaktoru připraveného na inokulaci (vychlazeného a sterilního včetně média) až po konec kultivace. Nakreslete graf časových průběhů X, S, V pro vsádkovou kultivaci. Klaďte důraz na přesné kreslení tvar a umístění křivek jednotlivých závislostí v kontextu osy x a y (začátek, konec, průběh, sklon) včetně vztahu jednotlivých závislostí mezi sebou. Ujasněte si, jak se při vsádkové kultivaci mění hodnoty základních parametrů (S, X, V, P) jak v čase a tak v objemu reaktoru. Před sestavováním vlastní bilance si nakreslete schéma bilancovaného systému včetně definování a zakreslení bilancovaných veličin. Definujte, pro jaké bilancované období bude bilance sestavována. Ujasněte si člen akumulace ve hmotové bilanci vsádkové kultivace. Vyplňte následující tabulku jednotlivými členy hmotové bilance pro jednorázovou kultivaci a porovnejte ji s tabulkou ostatních typů kultivací. 28

29 vstup zdroj výstup akumulace m X m S m P m celk Jaké jednotky mají jednotlivé členy bilance? Jaké jsou počáteční a okrajové podmínky pro odvozené kinetické rovnice bilance? Je potřeba doplnit výsledné bilanční rovnice ještě dalšími vztahy, a pokud ano tak jakými? 29

30 6. Vsádková kultivace s postupným živením (charakteristika, způsoby přítokování média, hmotová bilance, použití). Charakteristika vsádkové kultivace s postupným živením nazývá se také jednorázová s postupným živením nebo fed-batch kultivace vsádková kultivace s řízeným přítokem média (většinou koncentrát substránu event. i s minerálními živinami) - do zaplnění pracovního objemu reaktoru. start jako batch kultivace ale pouze s částečně naplněným reaktorem (např ¼) koncentrace extracelulárních produktů na počátku kultivace je nulová Použití vsádkové kultivace s postupným živením produkce biomasy produkce primárních metabolitů produkce sekundárních metabolitů výhody: o možnost řízení nástupu stacionární fáze (limitace živinou např. fosforečnanem) o možnost na začátku stacionární fáze začít dávkovat prekurzor o možnost řízeného základního živení (maitenance energy) během stacionární fáze Hodnocení vsádkové kultivace s postupným živením Výhody eliminace inhibice substrátem, glukózového efektu nebo problémům s viskozitou média (viskózní substrát) na počátku kultivace zkrácení lag-fáze možnost lepší optimalizace procesu produkce biomasy a primárních i sekundárních metabolitů (optimální přísun živin) možnost přítokovat další látky ve vhodnou dobu např. prekurzory - sekundární metabolity ve stacionární fázi Nevýhody větší riziko kontaminace (přítokování) komplikovanější technologie (regulace) Realizace přítokování média Cílem je zajistit optimální živení. Příliš velká koncentrace substrátu způsobí inhibici naopak příliš malá koncentrace limitaci. Optimální je růst v (mírném) přebytku pak je maximální růst přítoku média lze realizovat jako: Konstantní stálá hodnota přítoku média Exponenciální zvyšování rychlosti přítoku média s časem kultivace, tak aby se zajistil exponenciální růst hodnota přítoku se spočítá pro µ=µmax (nejen exponenciální ale i maximální růst) Proměnná (regulovaná) 30

31 hodnota přítoku média na základě aktuálních požadavků Konstantní přítokování média Konstantní přítok média se vyznačuje: procesu nejjednodušší provedení postupné plynulé zvyšování objemu bioreaktoru = zředění produkovaného metabolitu. vhodné pro kultivace, kde má koncentrace produktu negativní vliv na metabolickou aktivitu. Má ale značné nevýhody: nejméně efektivní přítokování média (µ<µmax) nereaguje na aktuální stav buněk se vzrůstající koncentrací buněk roste spotřeba substrátu, ale dodávka je konstantní. Exponenciální přítokování média přítok limitujícího substrátu zvyšován úměrně k rychlosti exponenciálního růstu (matematický vztah pro kinetiku zvyšování lze vyjádřit z bilance pro µmax) konstantní μ, konstantní S, exponenciální přítok možnost udržet vysokou růstovou rychlost po dlouhou dobu získání maximálního množství buněk za nejkratší čas v systémech se substrátovou inhibicí Má ale nevýhodu v tom, že nereaguje na aktuální stav a potřeby buněk je založená na předpokládaném chování buněk. 31

32 Proměnná rychlost přítokování média Proměnná rychlost přítokování média se vyznačuje: přítokování média se během kultivace mění podle požadavků mikroorganismů (regulovaný kontinuální nebo diskontinuální přítok) cílem je optimalizace procesu - růstové rychlosti, výtěžku metabolitu, produktivity procesu na základě skutečných a aktuálních (ne vypočtených nebo předpokládaných) požadavků mikroorganismů použití pro speciální produkty - enzymy, antibiotika, aminokyseliny, rekombinantních proteiny (regulace nákladná investičně i provozně) Eliminuje všechny nevýhody předešlých způsobů přítokování ale za cenu vyšších nákladů. Je nutné zvolit vhodnou veličinu pro měření a použití pro následnou regulaci přítoku, která nejlépe vypovídá o aktuálním stavu systému. Optimální je měřit koncentraci substrátu ale možné je měřit i jiné (nepřímé) parametry: Přímé stanovení koncentrace substrátu o přímé měření koncentrace substrátu (periodické vzorkování nebo kontinuální měření) o optimální ale ne vždy snadno proveditelné Nepřímé stanovení - parametry úzce spojené s růstem a metabolismem buněk (lineární závislost změn a minimální prodleva reakce na změnu) a optimálně snadno a on-line měřitelné a zárověň s vysokou přesností a citlivostí měřitelné o měření vznikajících metabolitů (S P ) o CO2; měření v odplynech (S CO2 ) o měření rozpuštěného kyslíku (S CL ) o měření kyslíku v odplynech (S Cg ) o měření ph (S ph ) 32

33 Příklad diskontinuálního regulovaného přítokování včetně časového průběhu výstupu z regulátoru (regulace 0/1). Vlastní provedení regulace je podrobně popsáno v Kapitole 11. Hmotová bilance vsádkové kultivace s postupným živením Předpoklady, zjednodušení a bilanční období viz vsádková kultivace. Akumulace mcelk (ρ = konst.) d(ρ V) = ρ dv dt dt ms d(s V) = S dv ds + V dt dt dt mx d(x V) dt mp d(p V) dt = X dv dx + V dt dt = P dv dp + V dt dt Bilance celkové hmoty [vstup] + [zdroj] = [výstup] + [akumulace] dv d F 0 0 V dt dt dv F dt Bilance biomasy dx dv 0. X. V 0 V. X. dt dt dx F X. X. dt V 33

34 Bilance substrátu. X ds F S. V 0 V. S YX / S dt ds F Sin F S X dt V V Y in. Bilance produktu vázaného na růst μ X [0] + [Y P/S V] = [0] + [V dp Y X/S dt dp dt = Y μ X F P P/S Y X/S V + P dv dt ] Bilance produktu nevázaného na růst probíhá pouze ve stacionární fázi [0] + [β X V] = [0] + [V dp dv + P dt dt ] dp F P = β X dt V Produktivita Viz vsádková kultivace. X / S dv dt Náměty k přemýšlení a procvičení znalostí Definujte posloupnost základních kroků spuštění a provozování vsádkové kultivace s postupným živením od fáze reaktoru připraveného na inokulaci (vychlazeného a sterilního včetně média) až po konec kultivace. Nakreslete graf časových průběhů X, S, V pro vsádkovou kultivaci s postupným živením. Klaďte důraz na přesné kreslení tvar a umístění křivek jednotlivých závislostí v kontextu osy x a y (začátek, konec, průběh, sklon) včetně vztahu jednotlivých závislostí mezi sebou. Ujasněte si, jak se při vsádkové kultivaci s postupným živením mění hodnoty základních parametrů (S, X, V, P) jak v čase a tak v objemu reaktoru. V jaké fázi růstové křivky a proč v ní se začíná s přítokováním média. Jaké vlastnosti musí splňovat měřený parametr, aby ho bylo možné použít pro nepřímou regulaci? Uveďte příklady. Před sestavováním vlastní bilance si nakreslete schéma bilancovaného systému včetně definování a zakreslení bilancovaných veličin. Definujte, pro jaké bilancované období bude bilance sestavována. Ujasněte si člen akumulace ve hmotové bilanci vsádkové kultivace s postupným živením. Vyplňte následující tabulku jednotlivými členy hmotové bilance pro jednorázovou kultivaci s postupným živením a porovnejte ji s tabulkou ostatních typů kultivací. 34

35 vstup zdroj výstup akumulace m X m S m P m celk Jaké jednotky mají jednotlivé členy bilance? Jaké jsou počáteční a okrajové podmínky pro odvozené kinetické rovnice bilance? Je potřeba doplnit výsledné bilanční rovnice ještě dalšími vztahy, a pokud ano tak jakými? Z bilance celkové hmoty získáte výslednou diferenciální rovnice dv/dt=f. Jak přítok (F) zrealizujete a jakou konkrétní hodnotu/vztah dosadíte do rovnice za F? 35

36 7. Kontinuální a semikontinuální kultivace (charakteristika, způsoby řízení procesu, hmotová bilance, porovnání se vsádkovou kultivací, použití). Volbu typu kultivace na základě požadovaného produktu. Podněty k zopakování si Kontinuální chemický reaktor. Doba zdržení, zřeďovací rychlost. Terminologie: ustálený a neustálený stav, rovnováha, dynamická rovnováha. Semikontinuální kultivace Charakteristika semikontinuální kultivace řada batch kultivací bez nutnosti inokulace (pouze první) start jako batch kultivace inokulace se provádí jen u startovní vsádky inokulum každé následné vsádky je část objemu předchozí vsádky bez dávkování média v průběhu jednotlivých kultivací buňky v exponenciální fázi růstu (kromě startu lag fáze) koncentrace extracelulárních produktů na počátku první kultivace je nulová, další kultivace už ne Realizace semikontinuální kultivace 1. batch kultivace 2. ve vhodnou dobu (cca v 1/2 exponenciální fáze za inflexním bodem = vysoká koncentrace biomasy) se vypustí % obsahu reaktoru a doplní na původní objem novým médiem 3. Před koncem exponenciální fáze (před vyčerpáním substrátu aby buňky byly v exp. fázi) se opakuje vypuštění části média a doplnění novým periodické odebírání a zpracovávání produktu (4. ukončení, vypuštění, mytí, dezinfekce (teoreticky nikdy) Hodnocení semikontinuální kultivace Výhody snížení nákladů na inokulum (pouze na startu) úspora času a provozních prostředků nekonečné udržování exponenciální (= produkční) fáze eliminace inhibice produktem (ředění) žádná lag fáze mezi jednotlivými vsádkami (pouze na startu) vysoká produktivita Nevýhody nebezpečí kontaminace 36

37 nebezpečí mutací buněk při dlouhodobém provozu pouze produkce biomasy a primárních metabolitů Použití semikontinuální kultivace Produkce biomasy Produkce primárních metabolitů Kontinuální kultivace Charakteristika kontinuální kultivace nekonečná kultivace inokulace se provádí jen na začátku start jako batch kultivace buňky v exponenciální fázi růstu (kromě startu lag fáze) kontinuální přívod živin a odvod buněk, produktů a metabolitů koncentrace produktů není nulová (kromě startu) Realizace kontinuální kultivace 1. batch kultivace 2. ve vhodnou dobu (konec exponenciální fáze za inflexním bodem = vysoká koncentrace biomasy) se začne přítokovat čerstvé médium + otevřít přepad tranzientní stav 3. provozování kultivace - udržování dynamické rovnováhy + následující kontinuální odebírání a zpracovávání produktu (4. ukončení, vypuštění, mytí, dezinfekce teoreticky nikdy) Hodnocení kontinuální kultivace Výhody snížení nákladů na inokulum (pouze na startu) odstranění lag-fáze (pouze na startu) úspora času a provozních prostředků 37

38 nekonečné udržování exponenciální (= produkční) fáze eliminace inhibice produktem (vyplavování) velmi vysoká produktivita, nízké provozní náklady Nevýhody nebezpečí kontaminace nebezpečí mutací buněk při dlouhodobém provozu pouze produkce biomasy a primárních metabolitů (jednostupňová) málo flexibilní Použití kontinuální kultivace (jednostupňové) produkce biomasy produkce primárních metabolitů Obecně pro: nízká koncentrace substrátu zvláště v kombinaci s velkou D o nízká záměrně, z důvodu zamezení inhibice vznikajícím produktem o nízká vyplívající ze specifik použitého média (např. odpadní vody) o nízká z důvodu špatně rozpustného substrátu inhibiční substrát kultivace mikroorganismů s nízkým μ Parametry pro popis kontinuální kultivace Zřeďovací rychlost (D) D = F V [h 1 ] Doba zdržení (t) t = V F = 1 D [h] Stavy systému při kontinuální kultivaci neustálený (tranzientní) stav o parametry kultivace jsou časově závislé o přechod mezi vsádkovou a kontinuální kultivací v ustáleném stavu o přechodový stav při změně podmínek - D, koncentrace živin, teplota, ph... ustálený stav stav dynamické rovnováhy, anglicky steady state o parametry kultivace jsou časově nezávislé Způsoby řízení kontinuální kultivace chemostat samoregulace pomocí limitace jednou živinou turbidistat regulace přítoku (D) na základě měření X není limitace Chemostat platí, že D = μ a zároveň μ < μmax koncentrace všech živin na vstupu jsou konstantní zřeďovací rychlost je konstantní jedna živina je limitující a její koncentrace je pak 0; ostatní živiny nelimitující 38

39 řídící reakce je v katabolismu a je jí rychlost spotřeby limitující živiny (S je mnohem menší než KS) za daných podmínek se ustaví ustálený stav a systém schopný samoregulace Turbidistat platí, že D = μ a zároveň μ = μmax = buňky rostou maximální rychlostí koncentrace všech živin na vstupu jsou konstantní zřeďovací rychlost není konstantní (je regulována) - měření X a podle toho regulace F (a tedy D) všechny živiny v přebytku - žádná není limitující řídící reakce nemusí být v katabolismu (S může být i větší než KS) použití je při vysokých hodnotách D, kdy malá změna D znamená velkou změnu koncentrace buněk což je potenciálně nestabilní, špatně samoregulovatelný systém. Porovnání chemostatu a turbidistatu a řízení procesu v kontextu závislosti μ na S 39

40 Časový průběh hodnot S, X, V při řízení procesu pomocí chemostatu Časový průběh hodnot X, S a V při startu a následného provozování kontinuální kultivace řízené na principu chemostatu. Dva mezní stavy po spuštění čerpadla pro (I) D a (II) D Hmotová bilance kontinuální kultivace - produkce biomasy Předpoklady, zjednodušení a bilanční období viz vsádková kultivace. Akumulace mcelk (ρ = konst.) d(ρ V) = ρ dv dt dt = 0 pro V = konst. ms d(s V) dt d(s V) dt mx d(x V) dt d(x V) dt = V ds dt = V ds dt = 0 = V dx dt = V dx dt = 0 (neustálený stav) (ustálený stav) (neustálený stav) (ustálený stav) mp d(p V) dt d(p V) dt = V dp dt = V dp dt = 0 (neustálený stav) (ustálený stav) Bilance celkové hmoty (ustálený stav) [vstup] + [zdroj] = [výstup] + [akumulace] 40

41 [ρ F] + [0] = [ρ F] + [ρ dv dt ] dv dt = 0 Bilance biomasy (ustálený stav) dx 0.X.V F X V dt dx 0 D X dt Bilance (limitujícího) substrátu (ustálený stav). X in. YX / S X 0 Sin S D Y F S V F S V ds dt X / S Bilance produktu vázaného na růst (ustálený stav) μ X [0] + [Y P/S V] = [F P] + V dp Y X/S dt dp dt = 0 = Y μ X P/S D P Y X/S Produktivita kontinuální kultivace (ustálený stav) PP R R = DD XX (g l 1 h 1 ) P R = D P (g l 1 h 1 ) Porovnání kontinuální a batch kultivace Výhody kontinuální kultivace oproti batch: minimum ztrátových časů = vyšší produktivita homogennější produkce (jednotlivé vsádky batch kultivace se mohou dosti lišit) = menší nároky na dokončovací operace vhodnější pro produkci biomasy a primárních metabolitů obecně řečeno čím vyšší µ tím vhodnější kontinuální kultivace nicméně kontinuální kultivace má i nevýhody: jednostupňovou kontinuální kultivaci nelze použít pro produkci sekundárních metabolitů (možno ale použít vícestupňovou kontinuální kultivaci) dlouhodobý kontinuální provoz technologie je náročný na údržbu zařízení a s časem roste riziko poruchy (kdekoli v celé technologii) vysoké nároky na sterilitu nebezpečí mutací buněk nevhodný (těžko řiditelný) pro kultivace buněk s malým µ (možno ale použít recykl biomasy) malá flexibilita systému spíše pro dlouhodobé a velkotonážní výroby Kontinuální vícestupňová kultivace ds dt Kontinuální vícestupňová kultivace znamená zapojení dvou a více reaktorů v sérii. Má dvě základní využití a to produkce sekundárních metabolitů a v případě směsí substrátů vyvolávajících diauxii. 41

42 Produkce sekundárních metabolitů První reaktor nárůst biomasy čímž se spotřebuje substrát (exponenciální fáze) ve druhém reaktoru kultura přejde do stacionární fáze a produkce sekundárních metabolitů. Možný je přídavek prekurzorů před druhým reaktorem. Použití při diauxii Je možno nastavit různá D pro jednotlivé reaktory. Například pokud při F=konst. a ustáleném stavu je μ1=2.μ2 pak musí D1=2D2 a tedy V1=1/2V2. Kontinuální kultivace s recyklem biomasy Cílem je zvýšit koncentraci buněk v reaktoru což vede k vyšší produktivitě a možnosti využít vyšší D, protože vyplavené buňky se do reaktoru vrací (externí recykl) nebo v něm zůstávají (interní recykl). Umožňuje tedy kultivaci za podmínek D > μ. interní recykl (mikrofiltrační modul) externí recykl (mikrofiltrace, sedimentace, kontinuální odstředivka) Použití Viz obecně kontinuální kultivace a speciálně pro kultivace mikroorganismů kde μ je velmi malé mikroorganismy s malou μ nebo malé μ jako důsledek nepříznivého prostředí (média) např. limitace nebo inhibice (toxická substrát), obtížně degradovatelný substrát. Nízké hodnoty μ zapříčiňují nestabilitu a špatnou regulovatelnost kontinuální kultivace malé μ znamená i malá D. Typické použití je v technologii čištění odpadních vod. 42

43 Výhody rychlejší start kultivace dosažení vysoké koncentrace produktu snížení spotřeby C-zdroje (odpadá tvorba části biomasy) úspora jednoho kroku dokončovacích operací - separace buněk od média Náměty k přemýšlení a procvičení znalostí Definujte posloupnost základních kroků spuštění a provozování kontinuální kultivace od fáze reaktoru připraveného na inokulaci (vychlazeného a sterilního včetně média) až po konec kultivace. Nakreslete graf časových průběhů X, S, V pro kontinuální kultivaci provozovanou jako chemostat. Klaďte důraz na přesné kreslení tvar a umístění křivek jednotlivých závislostí v kontextu osy x a y (začátek, konec, průběh, sklon) včetně vztahu jednotlivých závislostí mezi sebou. Porovnejte ztrátové časy všech tří typů kultivací. V jakém klíčovém parametru pro popis kultivace se případné rozdíly projeví? Ujasněte si rozdíl mezi startovními (Xstart, Sstart, Vstart, Pstart), aktuálními (X, S, V, P) a vstupní (Xin, Sin, Pin) hodnotami parametrů kultivace nejen u kontinuální kultivace ale i obou předchozích. Ujasněte si, jak se při kontinuální kultivaci mění hodnoty základních parametrů (S, X, V, P) jak v čase a tak v objemu reaktoru. Jaký na to má vliv to, jestli se systém nachází v ustáleném nebo neustáleném stavu? V jaké fázi růstové křivky a proč v ní se začíná se startem kontinuální kultivace (spuštění čerpadla)? Porovnejte start jednotlivých typů kultivací. Vysvětlete podstatu samoregulace u chemostatu. Před sestavováním vlastní bilance si nakreslete schéma bilancovaného systému včetně definování a zakreslení bilancovaných veličin. Definujte, pro jaké bilancované období bude bilance sestavována. Ujasněte si člen akumulace ve hmotové bilanci kontinuální kultivace. Vyplňte následující tabulku jednotlivými členy hmotové bilance pro kontinuální kultivaci v ustáleném stavu a porovnejte ji s tabulkou ostatních typů kultivací. vstup zdroj výstup akumulace m X m S m P m celk Jaké jednotky mají jednotlivé členy bilance? Jaké jsou počáteční a okrajové podmínky pro odvozené kinetické rovnice bilance? 43

44 Je potřeba doplnit výsledné bilanční rovnice ještě dalšími vztahy, a pokud ano tak jakými? Jak by se změnily výsledné rovnice bilance, pokud by měly být použity pro neustálený stav? Jaká živina a z jakého důvodu se nejčastěji v chemostatu používá jako limitující? Uvědomte si rozdílné nároky na přípravné a dokončovací operace pro jednotlivé typy kultivací (vsádkové vs. kontinuální) Jaké jsou důvody pro použití kontinuální kultivace s recyklem biomasy a kontinuální vícestupňové kultivace? 44

45 8. Aerace a přestup kyslíku (realizace aerace, mechanismus přestupu kyslíku, KLa). Podněty k zopakování si Vlivy na rozpustnost plynů ve vodě. Henryho zákon. Kinetika sdílení hmoty. Difuze, konvekce, přestup a prostup hmoty. Disperzní soustavy plyn-kapalina. Jaké jsou funkce kyslíku v (mikro)organismu? Distributory vzduchu Systémy bez mechanického míchání porézní materiály (keramika, sklo, sintrovaná legovaná ocel) trubkové distributory Systémy s mechanickým mícháním trysky (menší průtoky vzduchu) aerační věnce (větší průtoky vzduchu) (otvory 1-5 mm podle typu mikroorganismu riziko zarůstání) Umístěny jsou centrálně pod míchadlem a alespoň jedna řada otvorů je na spodní straně aby mohla kapalina vytéct. 45

46 Vliv rychlosti proudění na přestup hmoty Proudění v kapalině Proudění v plynu Dispergace Dispergací se rozumí rozbíjení plynových bublin na menší. Tímto procesem se větší mezifázového rozhraní a intenzifikuje přestup hmoty (a tepla). Smykové napětí Vyvolání smykového napětí: vysoká výtoková rychlost plynu do kapaliny (otvory aerační věnec, frita, tryska ) systémy s pneumatickým mícháním (nutný vysoký tlak plynu) mechanické míchadlo (malá výtoková rychlost plynu = menší tlak = menší náklady na aeraci) Vlastnosti disperze (z hlediska přenosu hmoty) stupeň dispergace velikost zádrže dispergované fáze doba zdržení zádrže plynu v kapalině stabilita disperze (koalescence bublin) Koalescence Koalescencí se rozumí spojování se plynových bublin ve větší, čímž dochází ke zmenšení mezifázového rozhraní a tím snížení přestupu hmoty (a tepla). Oba procesy dispergace i koalescence probíhají ve vsádce souběžně. Disperzní systémy z hlediska koalescence bublin jsou: koalescentní systémy (čistá voda) nekoalescentní systémy (voda + sole, alkoholy, povrchově aktivní látky) Velikost bublin Velikost bublin je jedním ze základních parametrů ovlivňujících přestup hmoty. Bubliny se podle velikosti dělí na: malé bubliny D b 0,5 mm o dlouhá doba zdržení o malý objem 46

47 o rigidní povrch o velké mezifázové rozhraní střední bubliny D b 0,5-6 mm o nejlepší pro přestup hmoty - optimální kombinace velikosti mezifázového povrchu, objemu a velikosti (umožňující deformace bubliny při pohybu) o optimální velikost je D b 2-3 mm D b velké bubliny 6 mm o krátká doba zdržení o velký objem o oscilace tvaru při pohybu o malé mezifázové rozhraní Mechanismus přenosu kyslíku Podle typu proudění je možné rozdělit sdílení hmoty difúzí nebo konvekcí (prouděním). Čím turbulentnější proudění tím slabší stacionární vrstva a tím lepší přestup hmoty přes fázové rozhraní a zároveň lepší sdílení hmoty konvekcí (prouděním) v kapalině. Veličiny pro kvantitativní popis spotřeby kyslíku Výtěžnostní koeficienty (O2) vztažený na biomasu dx YX / O úprava 2 dc L dc dt L 1 Y X / O 2 dx dt 1 Y X / O 2 X vztažený na produkt Y P / O 2 dp dc L úprava dc dt L 1 Y P / O 2 dp dt Spotřeba kyslíku, q O2 Celková rychlost spotřeby kyslíku vztažená na jednotkový objem reaktoru [mg.gsuš -1.h -1 ] q, 1 O 2 YX / O 2 X 47

48 q O2 Specifická (měrná) rychlost spotřeby kyslíku tzv. respirace buněk vztažená na jednotku sušiny buněk [mg.l -1.h -1 ], = q O2 X q O2 Kinetika přestupu kyslíku přes mezifázové rozhraní g/l Přestup hmoty přes mezifázové rozhraní závisí na: plocha mezifázového rozhraní rozdíl koncentrací (hnací síla) konstanta úměrnosti (závisí na látce, prostředí a podmínkách) Kinetickou rovnici popisující kinetiku přestup kyslíku (hmotnostní tok) lze tedy napsat ve tvaru: dm O2 = K dt L a (C C L ) V Kde: KLa je objemový součinitel přestupu kyslíku (h -1 ) KL je celkový součinitel přestupu kyslíku z plynu do kapaliny (m.h -1 ) a je měrný mezifázový povrch (m -1 ) (m 2 /m 3 ) C* je rovnovážná koncentrace rozpuštěného kyslíku (mg.l -1 ) CL je aktuální koncentrace rozpuštěného kyslíku (mg.l -1 ) Hmotová bilance kyslíku Za předpokladu že není produkt a není chemická reakce spotřebovávající kyslík, můžeme pro jednotlivé kultivace sestavit rovnice popisující změnu koncentrace kyslíku v čase: Vsádková kultivace [vstup] + [zdroj] = [výstup] + [akumulace] Akumulace (vsádková kultivace) d(c L V) = V dc L dt dt Bilance kyslíku (vsádková kultivace) [K L a (C C L ) V] + [ 1 μ X] = [0] + [V dc L Y X/O2 dt ] dc L dt = K La (C C L ) 1 μ X Y X/O2 Rovnovážná koncentrace kyslíku ve vodě je v závislá především na teplotě a množství solí a její hodnota je ~ 9 mg.l -1 (POUZE!). Bilance kyslíku pro vsádkovou kultivaci s postupným živením a kontinuální kultivaci se odvodí postupem ekvivalentním k bilanci substrátu pro tyto typy kultivací. Není třeba je znát u zkoušky. Pěnění média Pěna vzniká aerací nebo vývinem plynu v médiu obsahujícím pěnotvorné činidlo, které se hromadí na mezifázovém rozhraní a tvoří tam stabilizující film a tím podporuje vznik a stabilitu pěny. Pěnotvorná činidla jsou především proteiny a jiné látky (detergenty, saponiny). 48

49 Metody odpěňování mechanické nástavec na hřídeli míchadla nad hladinou = mechanické rozbíjení pěny chemické přídavek povrchově aktivních látek odpěňovadel (vyšší alkoholy, mastné kyseliny, speciální minerální oleje) Narušují film nebo vytěsňují pěnotvorné činidlo z fázového rozhraní l-g nebo mění povrchové napětí v opačném směru než pěnotvorné činidlo a tím destabilizují pěnu. Často ale výrazně zhoršují přestup hmoty mezi plynnou a kapalnou fází (zvyšují odpor tím, že tvoří vrstvu na mezifázovém rozhraní) a tím především zhoršují přestup kyslíku., Stanovení KLa, c* a q O2. Existuje několik metod stanovení konstant pro popis přestupu kyslíku, jednou z nich je dynamická metoda. Provedení dynamické metody Výpočty konstant 49

50 Příklad Vypočtěte konstanty C *, q, O2 a KLa z hodnot naměřených při dynamické metodě: Přerušení dodávky vzduchu: čas s DOC mg.l -1 5,2 4,6 4,0 3,3 2,5 1,8 1,1 Obnovení vzdušnění: čas s DOC mg.l -1 1,2 2,3 3,1 3,7 4,0 4,3 4,5 4,7 5,0 5,1 5,2 5,3 5,4 Náměty k přemýšlení a procvičení znalostí Jakými způsoby je možné zvýšit dodávku kyslíku buňkám při kultivaci? Za jakých podmínek kultivace se zvyšuje riziko limitace kyslíkem? Z čeho se skládá člen bilanční rovnice popisující kinetiku přestupu kyslíku z plynu do kapaliny? Jaké jsou pozitivní a negativní vlastnosti jednotlivých velkostí bublin (malé, střední a velké) z hlediska přestupu kyslíku z plynné do kapalné fáze? Proč je velikost 2-3 mm nejlepší? Cvičně sestavte bilanční rovnice pro kyslík pro vsádkovou kultivaci s postupným živením a kontinuální kultivaci (nebudou vyžadovány u zkoušky). Definujte pěnu z hlediska disperzních soustav. Jaké látky způsobují pěnění média při kultivaci? Jaký je zdroj těchto látek při kultivaci buněk? Jaký vliv má aerace na pěnění média? Popište laboratorní pokus (dynamická metoda) a jeho vyhodnocení pro získání, konstant KLa, c* a q O2. 50

51 9. Míchání (typy míchání v biotechnologických provozech, specifika míchání bioreaktorů). Podněty k zopakování si Newtonowské vs. nenewtonovské kapaliny. Hydromechanické procesy. Proudění tekutin. Bezrozměrná kritéria podobnosti. Míchání je hydromechanický proces, při němž dochází k přemisťování částic systému, aby se získala nebo zachovala rovnoměrnost rozložení vlastností Účel míchání homogenizace (koncentrace, teplota) suspendace dispergace (jedné fáze do druhé) intenzifikace (sdílení hybnosti, tepla a hmoty snížení tloušťky laminární podvrstvy) Typy míchání o Mechanické vibrační rotační o Pneumatické o Hydraulické Mechanické míchání rotační míchadla Typy rotačních míchadel Pomaloběžná o o Rychloběžná o o Rotační pomaloběžná míchadla kotvové šnekové axiální vrtulové radiální turbínové (otevřené, uzavřené), lopatkové, listové kotvové míchadlo šnekové míchadlo Použití: husté, viskózní, nenewtonovské kapaliny 51

52 Rotační rychloběžná míchadla Axiální lopatkové míchadlo Radiální vrtulové míchadlo turbínové míchadlo bez dělícího kotouče turbínové míchadlo s dělícím kotoučem Schéma mechanicky míchaného reaktoru geometrie systému s turbínovým míchadlem b - šířka narážek b = 0,1D C - vzdálenost míchadla nade dnem C = 0,2D 0,5D d - průměr míchadla d = 0,25D 0,5D h - výška lopatek míchadla h = 0,2d H - výška plnění vsádky H = D viskózní kapaliny = větší d Proudění v mechanicky míchaném reaktoru (turbínové míchadlo) primární (většina E) o tangenciální (rotační) sekundární (kvalita míchání) o radiální o axiální 52

53 Použití vrtulového a turbínového míchadla v biotechnologických procesech Turbínové míchadlo větší střižné síly dispergace plynu lepší distribuce bublin v aerovaných bioreaktorech Vrtulové míchadlo intenzivnější míchání, lepší homogenizace - velká tzv. čerpací kapacita příprava médií (rozpouštění solí), příprava suspenze křemeliny (viz filtrace) Narážky Narážky brání vzniku středového výru a roztočení kapaliny tj. tangenciálnímu proudění. Standardně jsou osazovány 4 narážky o šířce 0,1D. Mechanické míchání - vibrační míchadla a kývavé míchání 53

54 Výpočet příkonu rotačního míchadla - příkonová charakteristika kritéria Re, Fr, Eu Re Reynoldsovo Fr Froudovo Po příkonové kritérium Po f Fr,,... f ( ) Re, 2 1 P Turbínové míchadlo vyžaduje vyšší příkon. Míchání v aerovaném bioreaktoru V aerovaném systému je menší hustota promíchávané vsádky tj. příkon míchadla může být menší. Čím větší je plynová zádrž tím menší příkon je potřebný. (graf a funkce jsou ilustrativní není třeba je znát u zkoušky) Smykové napětí N D V g počet otáček průměr míchadla objemový průtok plynu V okolí míchadla je velké smykové napětí, které vyvolává střižné síly, což může vést až k poškození buněk. Náchylné tento typ mechanického namáhání hlavně vláknité mikroorganismy. Ty reagují změna morfologie - vytvářejí tzv. klubíčka (pelety). Velikost poškození závisí na: intenzitě době setrvání frekvenci průchodu 54

55 Hydraulické a hydrodynamické míchání V případě hydraulického míchání se přečerpává velký objem kapaliny za malého tlaku. V případě hydrodynamického míchání malý objem kapaliny za velkého tlaku přičemž vstup do reaktoru je řešen tryskou. Kapalina je do reaktoru přiváděna tangenciálně, což způsobí tangenciální proudění. Pneumatické míchání U aerovaných systémů jde zároveň o míchání i aeraci. Využívá se i u anaerobních systémů např. metanogeneze, kdy je plynem (vznikajícím metanem) přiváděným dospod reaktoru promícháván obsah. Méně účinný systém míchání i přestupu kyslíku ale pro řadu biotechnologických procesů dostačující. Výhodou je jednoduchost, nízké investiční i provozní náklady a absence pohyblivých částí (menší poruchovost). Náměty k přemýšlení a procvičení znalostí Do jakého typu proudění se transformuje většina mechanické energie dodané míchadlem? Je to žádoucí? Lze to ovlivnit? Promyslete rozdíly funkce vrtulového a lopatkového míchadla a vhodnosti jejich použití. Jaký typ míchadla byste použily v aerovaném mechanicky míchaném reaktoru a proč? Jaké jsou důvody odolnosti mikroorganismů proti mechanickým vlivům prostředí? Jak se liší mechanická odolnost základních typů mikroorganismů (bakterie, kvasinky, plísně)? Jaká je reakce vláknitých mikroorganismů na mechanický stres při míchání? Jaké má tato reakce negativní důsledky? Jaké vláknité mikroorganismy jsou technologicky významné? Jakému mechanicky míchanému systému je třeba dodat více energie (příkon míchadla)? Systému bez nebo s narážkami. Systému aretovanému nebo bez aerace. Jaké jsou důvody? Jak vysoká koncentrace buněk, především vláknitých mikroorganismů, ovlivňuje hydromechanické vlastnosti vsádky? 55

56 10. Bioreaktory (rozdělení, konstrukce, použití). Podněty k zopakování si Chemické reaktory. Pístovým tok. Rozdělení bioreaktorů Z hlediska velikosti na laboratorní (asi do 30 dm 3 ) čtvrtprovozní ( dm 3 ) poloprovozní (100 dm 3 5 m 3 ) provozní (větší než 5 m 3 ) Podle způsobu provádění procesu vsádkové reaktory vsádkové reaktory s postupným živením kontinuální reaktory Podle druhu použitého biokatalyzátoru reaktory pro kultivaci buněk reaktory pro enzymové reakce Podle formy použitého biokatalyzátoru reaktory pro kultivaci volných buněk nebo enzymů reaktory s vázanými buňkami nebo enzymy Z hlediska potřebnosti aerace aerobní anaerobní Podle způsobu míchání s mechanickým mícháním s pneumatickým mícháním s hydraulickým mícháním Konstrukční materiály bioreaktorů Požadavky na konstrukční materiály bioreaktorů: kvalita povrchu (leštěné) mechanické odolnost - tvrdost (tlakové nádoby) chemická odolnost (ph médií, ph při mytí) produkty metabolismu - ph 1 (citronová kyselina) 10 (lyze buněk) (naleptání = ztenčení, nerovnosti povrchu, uvolňování iontů do média) Při projektování a realizaci reaktorů je třeba se vyvarovat rohů (konstrukce) a štěrbin nebo spár (spojování materiálů). 56

57 Materiál Charakteristika Použití Železo litina C ~ 1%, S ~ 0,5% hlavní konstrukční křehká, poměrně odolná proti korozi materiál bioreaktorů méně ušlechtilý materiál, některé konstrukční prvky a dalšího Měď Hliník Sklo Plasty ocel snížený obsah C a S kujná, tažná vlastnosti podle obsahu C a S a legujících prvků uhlíková legovaná Označení a rozdělení ocelí - třídy oceli (první dvojčíslí z pětimístného kódu) XX XXX Třída 17 (17 XXX) zahrnuje legované nerez oceli mimo jiné pro výrobu potravinářských strojů a zařízení. Legujícími prvky jsou převážně Cr, V, W, Mo, Ni, Mn. odolné proti korozi legování způsobí, že jsou mechanicky méně odolné s horší vodivostí tepla, houževnatější (hůře se obrábí), náročnější na svařování pružná, tažná, málo mechanicky odolná, pasivuje se vrstvou oxidu/hydroxidu tažný, poměrně málo mechanicky a chemicky odolný (rozpouští se v zásaditém prostředí) průhledné, chemicky odolné, relativně levné, tlakově odolné PE, PP, PVC, Teflon podle technologie výroby a použitého monomeru široká škála vlastností a tím i použití, levné, klávovatelné (PP, teflon) přístrojového vybavení biotechnologického provozu dnes specifická uplatnění varny, destilační aparatury téměř nepoužívaný potrubí, průhledy, laboratorní fermentory, kultivace fototrofních organismů potrubí, hadičky, membrány, kyvety, laboratorní vybavení Pryže Silikonové pryže Keramika Dřevo = vulkanizovaný kaučuk pružné, chemicky méně odolné chemicky odolné, stárnutí pomalejší oproti pryžím zátky, těsnění sterilovatelné zátky, hadičky, těsnění chemicky a mechanicky (pevnost) velmi odolné filtry, (malé) distributory vzduchu mechanicky poměrně odolné, pružné, podléhá zkáze specifické použití - starší ocetnice, sudy, kádě (pivo, víno ) 57

58 Osazení nádoby reaktoru Vlastní nádoba reaktoru je osazena množstvím prvků: měřící sondy vstupy/výstupy kapalných médií vstupy/výstupy plynů pojistný ventil armatury narážky distributor vzduchu míchadlo + pohon/převodovka duplikátor/chladící registry Základní typy bioreaktorů podle konstrukce Vsádkový míchaný reaktor (submerzní) Základní charakteristiky jsou: Koncentrace živin, buněk i metabolických produktů se mění v čase je ale shodná v celém objemu reaktoru. Cyklický provoz, nízká produktivita, náročné na obsluhu, nejčastěji průmyslově používané. Speciální a aseptické technologie výroby antibiotik, organických kyselin, potravinářský průmysl Kontinuální míchaný reaktor (submerzní) Koncentrace všech složek se nemění v čase (ustálený stav) ani s polohou v reaktoru. Kontinuální provoz, vysoká produktivita, většinou technologie méně náročné na asepticitu procesu. Průmyslová aplikace pro produkci mikrobiální biomasy nebo primárních produktů; čištění odpadních vod (v kombinaci s recyklem biomasy). 58

59 Biofilmový reaktor (náplňový s imobilizovanými buňkami) Koncentrace všech složek není časově závislá (ustálený stav). Koncentrace všech složek závisí na poloze v systému (obdoba pístového toku). Poměrně obtížná regulace množství biomasy v systému. Průmyslová aplikace pro starší způsob výrobu octa (moderní submerzně) a zpracování odpadních vod nebo plynů. Reaktor s fluidní vrstvou Fluidní vrstvu tvoří s vločky aktivovaného kalu nebo shluky buněk nebo buňky imobilizované na nosiči. Koncentrace všech složek není časově závislá (ustálený stav). Koncentrace všech složek nezávisí na poloze v systému (obdoba mechanicky míchaného reaktoru). Vsádkový - výroba piva (CKT) (vznos vývin CO2, konvexní proudění rozdíly teplot) Kontinuální - čištění odpadních vod. (vznos vzestupné proudění média) Náměty k přemýšlení a procvičení znalostí Proč jsou vyžadovány materiály pro konstrukci bioreaktorů s co nejhladším povrchem? Proč se snažíme minimalizovat počet koutů a vestaveb uvnitř bioreaktoru? Jakými základními prvky je bioreaktor osazen? Ujasněte si rozdíl mezi celkovým a pracovním objemem reaktoru. Jaké jsou důvody jejich rozdílných hodnot? Ujasněte si, jak mění základní parametry (S, X, V, T) jednak v čase a jednak v objemu reaktoru a výšce nebo délce lože reaktoru v jednotlivých typech bioreaktorů. 59

60 11. Měřené a regulované veličiny při kultivaci buněk. Základy regulace bioprocesů (regulační okruh, typy regulátorů, veličiny v regulaci). Podněty k zopakování si Čidla pro měření teploty, ph, redox potenciálu, kyslíku. Základní pojmy regulace Regulační obvod regulovaná soustava zařízení, na kterém se provádí regulace (reaktor) regulátor zařízení, které uskutečňuje regulaci. Na základě změřených veličin rozhoduje jak reagovat na danou situaci a v jaké intenzitě akční člen zařízení, které na základě výstupu z regulátoru vlastní akci provede (ventil, čerpadlo) Veličiny v regulaci regulovaná veličina y je výstupní veličinou regulované soustavy řídicí veličina w její hodnota vyjadřuje požadovanou hodnotu veličiny regulované poruchová veličina - z každá veličina, jejíž změna způsobí změnu regulované veličiny akční veličina u akční člen převádí výstup z regulátoru (v) na akční veličinu, jejímž působením na regulovanou soustavu se uskutečňuje regulace Regulační odchylka Regulační odchylka (e) je základem regulace a vypočítá se jako rozdíl mezi veličinou řídící (požadovanou) a aktuální hodnotou regulované veličiny. e = w - y Regulační odchylka může být kladná nebo záporná s různě velkou absolutní hodnotou, vyhodnocuje ji regulátor a na jejím základě rozhodne o zásahu. Znaménko určuje směr zásahu (např. zvýšení nebo snížení průtoku dávkovacího čerpadla) a velikost absolutní hodnoty určuje intenzitu zásahu ( ). Cílem regulace je odstranit (minimalizovat) regulační odchylku. 60

61 Blokové schéma zpětnovazebního regulačního obvodu Základní druhy regulace Spojitá regulace o spojitá změna akční veličiny (PID regulátory) o regulátor ovládá akční člen spojitě o příklad: turbidistat, regulace teploty Nespojitá regulace Dvoupolohová regulace (0/1 zavřeno/otevřeno) o regulátor ovládá akční člen dvoupolohově o příklad: regulace ph, teploty (na obrázku) Spojitý PID regulátor Výstup z regulátoru se počítá na základě aktuální hodnoty regulační odchylky pomocí matematické funkce, jejíž obecný tvar je (netřeba umět): de( t) v r0. e( t) r 1. e( t). dt r1. dt P Má Proporcionální, Integrační a Derivační složku proto PID regulátor. Velmi přesná regulace ale také náročná na nastavení (konstanty regulátoru); ne vždy nutná. Dvoupolohový regulátor 0 I D Regulátor ovládá akční člen dvoupolohově - vypnuto/zapnuto, zavřeno/otevřeno. Regulátor musí být vybaven hysterezí (necitlivostí ) aby neustále nekmital okolo požadované hodnoty. Jednoduchá, méně přesná ale často dostačující regulace. 61

62 Typový příklad - regulace ph Příklad regulace ph na 70,2. To znamená, že pokud ph klesá tak regulátor sepne (= reguluje = spustí přítok zásady) až na 6,8 (ne na 7) a pokud dojde k vzestupu hodnoty ph regulátor sepne (= reguluje = spustí přítok kyseliny) při ph 7,2 (ne na 7). Pásmo necitlivosti regulátoru (hystereze) je tedy mezi 6,8 a 7,2. Typový příklad - regulace turbidistatu Kontinuální míchaný reaktor v režimu turbidistat produkce biomasy: regulovaná veličina (y) = koncentrace buněk poruchová veličina (z) = změna růstové rychlosti buněk => změna koncentrace buněk výstup z regulátoru (v) = impulz do regulačního ventilu (akční člen), který se více nebo méně otevře a tím ovlivní akční veličinu v tomto případě průtok média akční veličina (u) = zvýšení nebo snížení průtoku média, které má za následek zvětšení nebo zmenšení hodnoty zřeďovací rychlost a tím změnu koncentrace buněk na požadovanou hodnotu 1. Zvolíme, jakou hodnotu koncentrace v reaktoru požadujeme např. 5 mg.l -1 (= řídící veličina) 2. Měřící člen regulátoru zaznamenává aktuální hodnotu koncentrace buněk v reaktoru a porovnávací člen kontinuálně počítá regulační odchylku. Pokud je například aktuální koncentrace buněk v reaktoru 5,2 mg.l -1 je regulační odchylka 5-5,2 = -0,2 mg.l -1. Ústřední člen regulátoru na základě matematického vztahu vypočítá, jaký signál se má poslat do akčního členu. (podstatné je znaménko podle toho rozhodne, jestli akční člen sníží nebo zvýší hodnotu akční veličiny = např. otevře více nebo přivře regulační ventil na přívodním potrubí kapalného média a také absolutní hodnota odchylky čím je větší tím více otevře nebo přivře ventil) 3. Akční člen na základě informace ústředního členu regulátoru upraví akční veličinu v našem případě průtok kapalného média konkrétně při regulační odchylce -0,2 sníží přítok média a tím sníží zřeďovací rychlost, čímž se přítokuje méně substrátu a tím klesne koncentrace buněk v reaktoru (optimálně přesně na požadovaných 5 mg.l -1 ). Obdobný postup je pro ostatní regulované veličiny - ph, teplotu, výšku hladiny, rozpuštěný kyslík. Typový příklad - regulace na základě hodnoty rozpuštěného kyslíku Pro účinnou regulaci koncentrace substrátu (udržování koncentrace v optimálním intervalu) pomocí CL je potřeba znát vztah mezi mini. Stanoví se empiricky změřením nebo i výpočtem z matematického modelu. 62

63 Regulované veličiny a k nim náležející akční veličiny regulovaná veličina akční veličina teplota Q nebo 0/1 chladícího/ohřevného média nebo elektrický příkon ph Q nebo 0/1 kyseliny nebo louhu rozpuštěný kyslík Q vzduchu/o2 výška hladiny Q nebo 0/1 přítok média množství pěny 0/1 dávkování odpěňovacího prostředku koncentrace substrátu Q nebo 0/1 přítok média koncentrace produktu Q nebo 0/1 přítok média koncentrace buněk Q nebo 0/1 přítok média (Q - turbidistat) akční člen (změna): Q průtok 0/1 vypnuto/zapnuto Regulace technologického procesu jako celku Technologická linka obsahuje množství jednotlivých technologií, které je potřeba regulovat jednak jednotlivě, tak i jako celek. Regulace jednotlivých technologií/procesů se vzájemně ovlivňují a proto je velmi náročné sladit regulace jednotlivých procesů tak aby bylo dosaženo dlouhodobě optimálního a stabilního provozu dané technologie. Většinou je tato regulace realizována na zakázku specializovanými firmami s dlouholetými zkušenostmi. Náměty k přemýšlení a procvičení znalostí Vysvětlete pojem zpětnovazebná regulace. Popište regulaci teploty, pěnění, rozpuštěného kyslíku, výšku hladiny v bioreaktoru. Koncentrace rozpuštěného kyslíku se často využívá při regulaci procesu. Proč právě ona je vhodná pro tento účel? U jakých typů kultivací byste tento způsob použili? Uveďte příklady poruchových veličin (z). Jak vzrůst koncentrace buněk v průběhu kultivace ovlivňuje parametry kultivace a její regulaci? 63

64 Dokončovací operace biotechnologických výrob (konvenční separační technologie, dezintegrace buněk, membránové separační technologie, extrakce, srážení, destilace, sušení, stripování, CIP). Výrobní linka biotechnologického procesu. Podněty k zopakování si Základy procesů a popis zařízení filtrace, odstřeďování, destilace, extrakce, srážení, sušení, výměníky tepla chemické inženýrství. Integrované systémy biotechnologického procesu Integrované systémy znamenají spojení bioprocesu a separace produktu. Výsledkem je snížení nákladů na dokončovací operace a tím i celé výroby. Mohou být realizovány: interním recyklem buněk kontinuálním stripováním těkavého produktu z média vhodným plynem (vzduch, N2) a jeho následnou separací z plynu (kondenzace, vymražení, sorpční nebo membránové procesy). Jedná se např. o produkci kyselin, ethanolu, biorozpouštědel (aceton, butanol). Dokončovací operace biotechnologických výrob (downstream procesy) Dokončovací operace obecně zahrnují: separace biomasy z médií po fermentaci (usazování, odstřeďování, filtrace) izolace, čištění a stabilizace produktů o extracelulární produkty - separační procesy jako filtrace, srážení, membránové a chromatografické techniky o intracelulární produkty - dezintegrace buněk + separační procesy čištění odpadních produktů (pevných, kapalných a plynných) Separační procesy separace buněk z kultivačního média separace produktu z kultivačního média separace produktu z buněk separace produktu od nečistot Filtrace Odstranění pevných částic z plynu nebo kapaliny 64

65 Dělení filtrace podle velikosti pórů Základní pojmy separačních technik. Filtrace - dělení suspenzí a membránové procesy dělení převážně roztoků. Účelem procesu filtrace může být: získání plynu nebo kapaliny získání pevných částic získání plynu nebo kapaliny i pevných částic Z hlediska provedení se rozděluje na: kontinuální diskontinuální Hnací síla je rozdíl tlaků (Δp); může být i gravitace. Realizace rozdílu tlaků je možná dvojí: přetlak nad filtrační přepážkou podtlak pod filtrační přepážkou (vakuový filtr) Materiál filtrační přepážky: vrstva zrnitého materiálu (písek, koks, naplavovací filtry) porézní materiály (porézní keramika, plasty, kov) vláknité materiály (filtrační plachetky textilní, papírové, skleněná vlákna) 65

66 Filtrace kapalin Pískový filtr Provozuje se v cyklu filtrace zpětný proplach. Náplní je praný písek o definované velikosti (a specifickém vrstvení). Typické nasazení je při úpravě pitné vody nebo v čističkách odpadních vod. Svíčkový filtr Materiál svíček jsou speciální syntetické vláknité materiály. Provozuje se v cyklu filtrace - výměna svíček Svíčkový naplavovací filtr Materiál svíček je keramika nebo legovaná ocel. Vlastní filtrační vrstva je naplavená vrstva zrnitého materiálu typicky křemelina. Provozuje se v cyklu naplavení křemeliny - filtrace - odstřelení křemeliny a filtračního koláče 66

67 Deskový filtr Podstatou konstrukce je střídání desky a rámu, mezi nimiž je tzv. plachetka jako filtrační materiál. Provozuje se v cyklu filtrace rozebrání + vyčištění. Vakuový rotační filtr Konstrukčně může být realizován jako bubnový nebo pásový. Provozuje se v cyklu přisátí suspenze ve vaně propláchnutí odříznutí filtračního koláče. Filtrace plynů Rukávový filtr Materiál svíček jsou speciální textilie. Provozuje se v cyklu filtrace oklepání* nebo výměna filtrační textilie Svíčkový filtr Viz filtrace kapalin. 67

68 Usazování Oddělení dispergovaných částic od plynu nebo kapaliny působením objemové síly (gravitační nebo odstředivá síla). Účelem procesu může být: získání plynu nebo kapaliny získání pevných částic získání plynu nebo kapaliny i pevných částic roztřídění částic různých vlastností (různá rychlost usazování) Hnací síla procesu je gravitační zrychlení (g). g Vu Vf Vp gravitační zrychlení rychlost usazování rychlost proudění výsledná rychlost usazování Usazováky vertikální a horizontální Usazováky s rotací suspenze Usazováky se změnou toku suspenze Usazováky se provozují s periodickým nebo kontinuálním odebíráním separovaných pevných částí. 68

69 Odstřeďování Oddělení dispergovaných částic od plynu nebo kapaliny působením objemové síly (odstředivá síla). Hnací síla je odstředivé zrychlení (ω 2 r). ω r Vu Vt Vp úhlová rychlost poloměr rychlost usazování tečná rychlost výsledná rychlost usazování Odstředivá síla (P) P = m. r. ω 2 Relativní odstředivá síla (R) Vyjadřuje poměr mezi odstředivým zrychlením a zrychlením tíhovým = násobky g (bezrozměrné). Různé g v různých částech kyvety! Monogram pro zjištění g P = 1,117. r. N Provozují se ve: vsádkovém (diskontinuálním) uspořádání cyklus odstředění oddělení odstředěné kapaliny a pevného podílu kontinuálním uspořádání kontinuální odvádění odstředěné kapaliny a pevného podílu Speciální odstředivky (v mikrobiologii a biochemii) Chlazené 69

70 Ultracentrifugy ( x g - oddělení biopolymerů a subcelulárních částic v hustotním gradientu - diskontinuální a kontinuální - (glukóza ) - nutno podtlak/vakuum v prostoru s rotorem! izopyknický bod stejná hustota prostředí a částice separace fragmentů buněk gradientová centrifugace (gradient hustoty v kyvetě) diferenciální centrifugace (postupné zvyšování otáček) Oddělení Suspenzí (buňky, fragmenty buněk, kaly ) Emulzí (extrakce, odstřeďování mléka) Podle konstrukce rotory úhlové o úhel k ose otáčení o pro větší otáčky ( g ) výkyvné o kyvety volně zavěšeny v čepech (kyveta vodorovně při centrifugaci) o velké tření o dlouhá sedimentační dráha částice Membránové procesy Hnací silou každého membránového procesu je transmembránový gradient. procesy s gradientem tlaku o mikrofiltrace o ultrafiltrace o nanofiltrace o reversní osmóza - transport rozpouštědla membránou (díky vysokému tlaku vyššímu než osmotický), soli a nízkomolekulární složky neprocházejí procesy s gradientem chemického potenciálu o pervaporace dělení kapalné směsi organických látek průchodem membránou do vakua nebo nosného plynu na principu různé rozpustnosti a rychlosti migrace par směsi membránou o permeace plynů oddělení plynů na základě různé rychlosti pronikání jednotlivých plynů skrze membránu o dialýsa - oddělení látek s různou rozpustností a velikostí přes polopropustnou membránu o osmósa přechod rozpouštědla přes polopropustnou membránu proti směru koncentračního spádu (do roztoku s vyšší koncentrací látek) procesy s gradientem elektrického potenciálu o elektrodialýza migrace iontů v elektrickém poli mezi katodou a anodou. Mezi roztoky jsou dvě membrány polopropustné ionexové membrány, které propouštějí selektivně pouze kationty (katexové membrány) nebo anionty (anexové membrány) v prostoru mezi nimi se kumuluje rozpuštěná látka (sůl) o membránová elektrolysa produkty elektrolýzy (na katodě a anodě jsou oddělené dvěma polopropustnými membránami (pro ionty migrující k elektrodám) 70

71 procesy s gradientem teploty o membránová destilace - dělení par horké směsi látek průchodem mikroporézní nesmáčivou membránou do chladnějšího prostoru (např. šetrné odvodňování) Dezintegrace buněk Slouží k získání intracelulárních produktů (enzymy, organely). Mechanické způsoby dezintegrace Střídavé zmražování a rozmražování French press (protlačování tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) X-press (protlačování zmražené suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) Ultrazvuk Mlýnek se skleněnými balotinami (kuličky) Fyzikální, chemické způsoby dezintegrace Osmotický šok (koncentrovaný roztok velmi zředěný extrakce intracelulárních látek) Přídavek tenzidů (poškození buněčné membrány) Přídavek toluenu (rozpouštění fosfolipidů buň. stěny a cytoplazmatické membrány) Enzymové způsoby dezintegrace Lysozym (v kombinaci s osmotickým šokem) enzym z vaječného bílku (dále např. krev, sliny) selektivně štěpící glykosidové vazby v peptidoglykanech v buněčné stěně bakterií Extrakce Antibiotika, nepolární látky, organické makromolekuly mohou být isolovány/čištěny extrakcí vhodným rozpouštědlem a jeho následným odpařením. Srážení Srážení znamená převedení rozpustné formy na nerozpustnou s následnou filtrací. Sráží je buď produkt nebo naopak nečistoty. Ca(OH)2 - organické kyseliny změnou ph, zvýšení obsahu vody - organické makromolekuly Destilace Destilace znamená oddělení těkavých produktů od média a jejich zakoncentrování. ethanol, kyselina octová, biorozpouštědla (aceton, butanol) Stripování Stripování těkavých produktů (těkavé kyseliny, biorozpouštědla, ethanol) plynem např. dusíkem. Stabilizace Pro stabilizaci se používá sušení, lyofilizace, navázání na nosič a jiné metody. Sanitace Souhrn činností, které zabezpečují plnění hygienických a technologických požadavků biotechnologických výrob: Úklid - odstranění nečistot (nejen) v interiéru technologické haly Čištění - odstranění nečistot (zbytky média, biomasy, stěnové nárůsty ) 71

72 Dezinfekce odstranění/usmrcení mikroorganismů Dezinsekce - odstranění/usmrcení hmyzu Deratizace - odstranění/usmrcení hlodavců Důležité je pořadí kroků: 1. čištění 2. výplach/oplach vodou odstranění sanitačních látek - agresivní a často mikrobicidní/mikrobistatické látky 3. dezinfekce/sterilace (vždy pouze čistého zařízení) Postup čištění reaktoru (propaření) (výplach) čištění cirkulací čistícího roztoku (vhodně umístěné trysky) výplach Čistící (sanitační) činidla lze rozdělit do tří skupin: kyselé prostředky HNO3 (~ 0,5%), H3PO4 zásadité prostředky NaOH (~ 1%) detergenty Většinou se čištění prování za vyšších teplot, někdy téměř 100 C z důvodu vyšší účinnosti. Z výše uvedeného je evidentní, že konstrukční materiály bioreaktorů, armatur, elektrod, sond musejí být značně odolné. CIP stanice CIP (Cleaning In Place) je technologický celek pro provádění sanitace technologie. Skládá se ze zásobníků sanitačních prostředků a vody, ohřevu, čerpadel, potrubí a armatur. Je nutné satinovat celou výrobní technologii: reaktor, pomocná zařízení (tlakové mytí, vestavěné trysky) potrubí, armatury (cirkulace sanitačního prostředku) Příklad průmyslové CIP stanice Sterilizace SIP stanice SIP (Sterilization In Place) je technologický celek pro provádění sterilizace technologie. Někdy je SIP a CIP jeden technologický celek. 72

73 Pro udržení asepticity procesu je nutné dezinfikovat/sterilovat celou část výrobní technologie kde je aseptický provoz: celá technologie párou (reaktor často znovu se sterilací média) potrubí/armatury párou a reaktor spolu s médiem nepřímím ohřevem (sterilace média) Náměty k přemýšlení a procvičení znalostí Jaká je hnací síla filtrace, odstřeďování, usazování a jak ji zrealizujete. Jaký je mechanismus působení kyselých, zásaditých látek a detergentů na buňky? Uveďte sled kroků dokončovacích operací včetně používaných zařízení pro získání biomasy jako finálního produktu. Uveďte sled kroků dokončovacích operací včetně používaných zařízení při produkci primárního produktu s ohledem na to. Uveďte sled kroků dokončovacích operací včetně používaných zařízení při produkci sekundárního produktu s ohledem na to, jestli jsou intracelulární nebo extracelulární. 73

74 14. Biotechnologie a bioreaktory pro zpracování odpadů z biotechnologických výrob. Podněty k zopakování si Rozpustnost organických látek ve vodě, hydrofobicita, Henryho zákon. Porovnání produkčních a dekontaminačních biotechnologií Biotechnologie a bioreaktory při čištění odpadů mají specifické odlišnosti v porovnání s technologiemi produkčními: Substrát a minerální živiny Jako substrát (zdroj uhlíku a energie) pro mikroorganismy jsou polutanty často toxické nebo inhibující, což způsobuje malé μ. V některých případech polutant slouží jako finální akceptor elektronů odstraňování dusičnanů/dusitanů z vody nebo vysoce halogenovaných látek; je tedy nutná přítomnost substrátu zdroje uhlíku a energie. Často směsné polutanty, někdy vyžadující významně odlišné degradační schopnosti nebo podmínky prostředí. Příklady: o H2S + NH3 + VOCs emise z ČOV: H2S degradují chemolitotrofové a VOCs chemoorganotrofové mikroorganismy; navíc degradací H2S vzniká H2SO4, výrazně snižující ph, což nevyhovuje většině chemoorganotrofů. o Methanogeneze (viz níže). o Jednotlivé polutanty ve směsi Často pouze částečná znalost složení polutantů a přítomnosti minerálních živin. Mikroorganismy Téměř vždy použití směsných mikrobiálních kultur o nelze udržet aseptický provoz o směs mikroorganismů má mnohem širší spektrum degradačních schopností a je mnohem flexibilnější při změnách prostředí, polutantů a parametrů odpadních plynů nebo kapalin Změny (často výrazné) v poměru a zastoupení jednotlivých taxonů směsné mikrobiální kultury v průběhu dlouhodobého provozu. Často ustavení komplexního ekosystému - mikrobiální eukaryota a prokaryota (degradéři; z pohledu ekosystému - producenti, kořist), protozoa a někdy i členovci (z pohledu ekosystému - dravci). Parametry a řízení procesu Kolísání parametrů vstupujících médií způsobuje stres mikrobiální populaci a obtížné řízení procesu: o průtok (mění se zřeďovací rychlost a doby zdržení!) o koncentrace a přítomnost jednotlivých složek minerální živiny, substrát, toxické látky o fyzikálně-chemické vlastnosti média (ph, T, redox potenciál ) o periody bez vstupující odpadní vody nebo vzduchu nebo s malou až žádnou koncentrací polutantů a tedy hladovění - mikroorganismy bez zdroje energie nebo i kyslíku (směnné nebo periodicky pracující technologiezdroje znečištění). Omezené možnosti ovlivnění a úpravy parametrů vstupujících médií. Omezené možnosti řízení procesu. 74

75 Reaktory Často kombinace nízké koncentrace polutantu (limitace), špatně degradovatelného polutantu (= malá μ) a vysokých průtoků kapaliny (= velká D) tj. nutnost použití recyklu biomasy nebo imobilizovaných buněk. Většinou konstrukčně jednoduché a provozně nenáročné bioreaktory. Převážně kontinuální (i když kolísavá) produkce znečištěné odpadní vody nebo vzduchu tj. použití kontinuálních procesů a reaktorů. Často využívané náplňové reaktory a submerzní reaktory s recyklem biomasy. Z těchto odlišností vyplívají specifika přístupu k návrhu a provozování dekontaminačních technologií v porovnání s produkčními technologiemi. Čištění odpadních vod Čistírny odpadních vod (ČOV) Odpadní vody podniků se mohou smluvně čistit v komunální ČOV (malé podniky, málo toxické nebo hygienicky závadné odpadní vody) nebo v podnikové ČOV (velké podniky, toxické nebo hygienicky závadné odpadní vody). Podnikové ČOV někdy smluvně čistí i komunální odpadní vody vesnic/měst, kde stojí. Vodu znečišťuje široké spektrum organických látek biologického (biomakromolekuly nebo jejich fragmenty) nebo průmyslového (uhlovodíky nebo kyslíkaté, halogenované nebo nitrované organické látky) původu nebo anorganických látek (dusičnany, dusitany, fosforečnany, rozpuštěný amoniak nebo sulfan, těžko kovy). Často je chemické znečištění doprovázeno mikrobiálním například přítomnost koliformních bakterií. Vyjadřování znečištění vody CHSK Udává množství kyslíku (mg.l -1 ), které se přepočte ze spotřeby oxidačního činidla (manganistan nebo dichroman draselný), a které je třeba k úplné oxidaci organických látek obsažených ve vodě. BSK5 Udává množství kyslíku (mg.l -1 ), které je třeba k degradaci biologicky odbouratelných organických látek obsažených ve vodě za pět dní za pomoci mikrobiální populace. Čím vyšší hodnoty parametrů tím větší organické znečištění vody. Pouze v některých případech specifických nebo vysoce toxických látek se používá jejich koncentrace (mg.l -1 ). Technologická linka malých ČOV Č LP BČ DN TČ UN česle lapač písku biologické čištění dosazovací nádrž terciální čištění uskladňovací nádrž na přebytečný kal 75

76 Technologická linka velkých ČOV Biologické čištění Aerobní (organické znečištění CO2 a H2O) Skrápěný náplňový reaktor (biofilm) Rotační biofilmové reaktory (biofilm) malé ČOV u rodinných domků Aktivační nádrž = submerzní probublávaný reaktor (aktivovaný kal) Vegetační čištění (kořenové čistírny) Anaerobní (organické znečištění CO2 a CH4) Anaerobní submerzní reaktory Terciální čištění Stabilizační nádrže (anaerobní, aerobní převážně bakterie a řasy) Vegetační čištění (kořenové čistírny) Metanogeneze Metanogeneze (produkce bioplynu z biomasy) není jeden proces, ale skládá se z několika procesů, vyžadujících značně rozdílné podmínky i mikroorganismy. Řízení tohoto procesu je tedy technologicky náročné. Proces Popis procesu Mikroorganismy Hydrolýza hydrolýza biopolymerů na monomery, spotřeba Fermentační - O 2, částečná acidogeneze fakultativně anaerobní bakterie Bacillus, Clostridium, Micrococcus, Acidogeneze Č VN LP UN LT BČ DN TČ KH OD Produkce octové kyseliny a dalších nižších mastných kyselin z monomerů Produkce octové kyseliny z nižších mastných kyselin česle vyrovnávací nádrž lapač písku usazovací nádrž lapač tuku biologické čištění dosazovací nádrž terciální čištění kalové hospodářství odstředivka Pseudomonas Syntrofní Syntrophobacter, Syntrophomonas, Syntrophus Acetogeneze syntrofní druhy - acidogeneze, acetogeneze, produkce CO2 a H2 homoacetogeny - acetogeneze, acidogeneze, Acetogenní Clostridium, Lactobacillus, Bifidobacterium, 76

77 Metanogeneze produkce CO2 Hydrogenotrofní metanogeny CO2 + 4H2 CH4 + 2H2O Acetotrofní metanogeny CH3COOH CH4 + CO2 Kalové hospodářství (stabilizace kalu) Aktivovaný kal je podle legislativy odpad a musí se s ním také tak zacházet. Zpracování kompostování anaerobní zpracování (methanogeneze) Čištění odpadních plynů Butyribacterium Metanogenní Methanobacterium, Methanocuccus, Methanobacter, Methanogenium (striktně anaerobní bakterie) Znečišťující látky plynů jsou těkavé organické (uhlovodíky, kyslíkaté, halogenované sirné organické látky) nebo anorganické látky (NH3, H2S). Těkavé organické látky jsou známé pod zkratkou VOCs (Volatile Organic Compounds). Vedle jejich přímé toxicity, zapojení do chemických a fotochemických v atmosféře (vznik toxických produktů a finálně smogu) nebo negativního ovlivňování funkcí atmosféry (skleníkový efekt, ničení stratosférického ozónu) se sleduje i obtěžování zápachem. Vyjadřování znečištění plynu Většinou se vyjadřuje jako kombinace hmotnostního toku z kontaminující technologie a maximální dosahované koncentrace a často bez rozlišení jednotlivých látek ze směsi polutantů například tzv. suma VOCs těkavých organických látek (Volatile Organic Compounds). V případech specifických nebo vysoce toxických látek se používá a sleduje jejich přesná koncentrace (např. u tzv. dioxinů). Bioreaktory pro čištění odpadních plynů Biofilmové reaktory náplňové biofiltr biotrickling filtr (skrápěná kolona) rotační diskový filtr Submerzní reaktory biologická pračka plynů probublávaná kolona airlift Vedle přestupu kyslíku do vodné fáze a následně do buněk je klíčový proces dekontaminace i kinetika přestupu polutantů do vodné fáze a do buněk (na rozdíl od čištění odpadních vod). V tomto ohledu jsou při dekontaminaci zvýhodněné dobře rozpustné polutanty a kinetika přestupu hmoty špatně rozpustných polutantů (např. uhlovodíky) může být limitujícím faktorem celého procesu. Základní typy reaktorů používaných při čištění odpadní vody a plynu Čištění odpadních vod má mnohem hlubší historii a vzhledem k podobnosti (aerobních) procesů byly základní typy reaktorů pro čištění vody převzaty a modifikovány pro použití při čištění odpadních plynů. 77

78 Při zpracovávání odpadních plynů je vedle přestupu kyslíku z plynné fáze do kapalné (stejně jako při čištění odpadní vody) klíčový i přestup polutantů z plynné fáze do kapalné (není u čištění odpadní vody). Rozpustnost ve vodě a Henryho konstanta polutantu hrají zásadní roli v přestupu hmoty a tím i v odstranění polutantu z odpadního plynu. Polutanty s malou rozpustností a vysokou Henryho konstantou jsou tedy znevýhodněny a kinetika jejich přestupu do kapalné fáze může být limitující proces pro dekontaminační technologii. Většinou však je limitujícím krokem vlastní biodegradace nebo kinetika přestupu kyslíku. Z důvodu kinetiky přestupu polutantu z plynné fáze do kapalné jsou bioreaktory s nízkým obsahem vodné fáze (biofiltr) vhodnější pro špatně rozpustné polutanty (uhlovodíky) zatímco bioreaktory s vysokým obsahem vodné fáze (skrápěný bioreaktor, probublávaná kolona, airlift) jsou vhodnější pro velmi dobře rozpustné polutanty. Odpadní vody Znečištěná voda kontinuálně proudí skrze náplňový materiál lože s imobilizovanou mikrobiální kulturou, která degraduje obsažené polutanty (tzv. ponořené lože). Nutno použít imobilizaci buněk D > μ. Aerace má za úkol pouze dodávku kyslíku. Biofiltr Odpadní plyny Znečištěný vzduch kontinuálně proudí skrze lože, kde polutanty přestupují do vodné fáze a jsou degradovány imobilizovanou mikrobiální kulturou. Voda s přídavkem minerálních živin je periodicky dávkována (1-2 x denně) a zajišťuje dostatečnou vlhkost lože (biofilmu) a přísun minerálních živin. Znečištěná voda kontinuálně stéká po náplňovém materiálu s imobilizovanou mikrobiální kulturou, která degraduje obsažené polutanty. Nutno použít imobilizaci buněk D > μ. Aerace má za úkol pouze dodávku kyslíku; může být i pasivní s využitím komínového efektu. Skrápěný bioreaktor (biotrickling filtr) Znečištěný vzduch kontinuálně proudí skrze lože, kde polutanty přestupují do vodné fáze a jsou degradovány imobilizovanou mikrobiální kulturou. Voda s přídavkem minerálních živin je cirkulována a zajišťuje dostatečnou vlhkost lože (biofilmu) a přísun minerálních živin a lepší distribuci kyslíku a polutantů. 78

79 Submerzní bioreaktory - probublávaná kolona; airlift Do znečištěné vody je před vstupem do reaktoru dávkována biomasa pomocí recyklu biomasy (tzv. aktivace/aktivační technologie využití aktivovaného kalu). Vzniklá suspenze pak kontinuálně proudí reaktorem, kde jsou degradovány obsažené polutanty. Po výstupu je biomasa oddělena od vyčištěné vody a vracena na začátek procesu. Nutno použít recykl buněk D > μ. Aerace má za úkol míchání (pneumatické) a dodávku kyslíku. Znečištěný vzduch je kontinuálně probubláván skrze vodu s přídavkem minerálních živin, kde polutanty přestupují z bublin plynu do vodné fáze a jsou degradovány suspendovanou mikrobiální kulturou (submerzní proces). Voda slouží jako prostředí pro mikroorganismy a pro rozpuštění polutantů a kyslíku. Poznámka: - kapalina; - plyn (vzduch) 79