Izolace bakteriálních buněk pomocí paramagnetických částic

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie Izolace bakteriálních buněk pomocí paramagnetických částic Diplomová práce Vedoucí práce: doc. Ing. René Kizek, Ph.D. Vypracoval: Bc. Eva Jílková Konzultant: Ing. Jiří Sochor, Ph.D. Brno 2012

2

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Izolace bakteriálních buněk pomocí paramagnetických vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis diplomanta.

4 Tato práce vznikla v rámci CEITEC - Středoevropského technologického institutu s pomocí výzkumné infrastruktury financované projektem CZ.1.05/1.1.00/ z Evropského fondu regionálního rozvoje.

5 PODĚKOVÁNÍ Tímto chci poděkovat za odborné vedení mé práce doc. Ing Renému Kizekovi, Ph.D., Ing. Jiřímu Sochorovi, Ph.D., Ing. Soně Křížkové, Ph.D. a celé pracovní skupině doc. Ing. René Kizeka, Ph.D. za vytvoření příjemných pracovních podmínek. Dále mé poděkování patří Mgr. Jindřichu Kynickému, Ph.D. za realizaci elektronových fotografií S. aureus. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat své rodině za podporu během celého studia.

6 ABSTRAKT Diplomová práce byla zaměřena na vývoj a optimalizaci nové a rychlé metody pro izolaci celých buněk z bakteriální kultury Staphylococcus aureus a izolaci proteinů vázajících zinek z těchto buněk za použití paramagnetických částic se specificky navázanými protilátkami. Dále se zabývá elektroforetickou detekcí proteinů vázajících zinek a elektrochemickou detekcí zinečnatých iontů. Automatizovaná izolace bakteriálních buněk a proteinů byla provedena automatickou pipetovací stanicí epmotion, tento postup byl optimalizován. Byla provedena detekce bakteriálních proteinů vázajících zinek metodou SDS - PAGE. V další části experimentu byly kvantifikovány zinečnaté ionty z buněk S. aureus za použití diferenční pulzní voltametrie. Podařilo se nám vyvinout rychlou a automatizovanou metodu pro izolaci bakterií a izolaci zinkových proteinů uvolněných z těchto bakterií. Výsledkem byla izolace buněk S. aureus pomocí paramagnetických částic v množství menším, než 100 buněk v 1 ml vzorku. Byla provedena imunoextrakce zinkových proteinů z izolovaných bakterií s výtěžkem dostatečným pro proteomickou analýzu. Klíčová slova: Staphylococcus aureus, (para)magnetické částice, Zn (II), zinkové proteiny, SDS-PAGE, diferenční pulzní voltametrie

7 ABSTRACT This thesis was focused with development a new and rapid method for isolation of bacterial cells and proteins of zinc from bacterial culture Staphylococcus aureus by paramagnetic particles. Then the thesis contains electrophoretic detection for the Znproteins and the electrochemical detection for the zinc ionts. For the automated isolation of bacterial cells and proteins was used an automatic pipetting station epmotion. Primarily, we optimized the isolation of pathogens and also immunocaptured Znproteins were characterized using sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In another part of the experiment were quantified by zinc ions from the cells of S. aureus by using differential pulse voltammetry. The results show that managed to develop a rapid and automated method for the isolation of bacteria and isolation of zinc proteins released from these bacteria. There were also purified S. aureus cells using paramagnetic particles in a volume less then 100 cells in 1 ml of sample. Last but not least was imunoextraction of Zn-proteins isolated from bacteria in a volume sufficient for proteomic analysis. Klíčová slova: Staphylococcus aureus, (para)magnetic particles, Zn (II), Zn-proteins, SDS-PAGE, differential pulse voltammetry

8 BIBLIOGRAFICKÁ CITACE JÍLKOVÁ, E. Izolace bakteriálních buněk pomocí paramagnetických částic. Brno: Mendelova univerzita v Brně, Agronomická fakulta, s. Vedoucí diplomové práce doc. Ing. René Kizek, Ph.D.

9 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Charakteristika druhu Staphylococcus aureus Taxonomie Rod Staphylococcus Druh Staphylococcus aureus Buněčná stěna grampozitivních bakterií Methicilin rezistentní kmeny S. aureus Nanotechnologie Magnetismus, typy magnetismů Paramagnetismus Superparamagnetismus (Para)magnetické částice Imunomagnetická separace Těžké kovy Těžké kovy a mikroorganismy Obrana mikroorganismů před těžkými kovy Aktivní transport kovů z cytoplazmy do vnějšího prostředí buňky Tvorba komplexů s kovy a jejich extracelulární vylučování - tzv. precipitace Volatilizace Příjem vybraných těžkých kovů jako esenciálních živin Příjem zinku mikrobiální buňkou Metalothionein Seznam materiálu Biologický materiál... 29

10 4.1.2 Chemikálie Použité přístroje Magnetické částice a jejich modifikace Příprava vzorků Příprava vzorku pro sledování růstových křivek Příprava vzorků pro detekci množství zinku Stanovení množství zinku před mineralizací Stanovení množství zinku po mineralizaci Stanovení celkových proteinů Příprava vzorku pro izolaci buněk a zinkových proteinů S. aureus Kultivace bakteriální kultury Automatická pipetovací stanice epmotion Stanovení množství metalothioneinu v izolovaných buňkách S. aureus Detekce zinek vázajících proteinů pomocí SDS-PAGE elektroforézy Ověření izolace zinek vázajících proteinů metodou Western-blotting Stanovení množství Zn (II) v izolovaných proteinech Mikroskopování MPs a buněk S. aureus Příprava vzorku pro mikroskopování VÝSLEDKY A DISKUZE Růst bakteriální kultury v přítomnosti Zn (II) Elektrochemické stanovení Zn (II) v buňkách S. aureus Magnetická separace bakteriálních buněk Automatizovaná magnetická separace bakteriálních buněk Ověření imobilizace protilátek na paramagnetické částice Magnetická separace bakteriálních buněk Mikroskopování S. aureus Stanovení koncentrace metalothioneinu a Zn (II) v izolovaných buňkách S. aureus... 49

11 5.3.6 Magnetická separace bakteriálních proteinů obsahujících zinek Stanovení proteinů obsahujících zinek Ověření izolace zinek vázajících proteinů metodou Western-blotting Elektrochemické stanovení zinku v izolovaných zinek vázajících proteinech Optimalizace stanovení zinku ZÁVĚR PREZENTACE VÝSLEDKŮ V RÁMCI DIPLOMOVÉ PRÁCE Publikace v odborných periodicích Prezentace POUŽITÁ LITERATURA SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK SEZNAM ZKRATEK... 68

12 1 ÚVOD (Para)magnetické částice (MPs) se hojně využívají k izolaci biomolekul, jako jsou nukleové kyseliny či bílkoviny. Nacházejí tak uplatnění v biomedicínských a biotechnologických oborech Jejich výhodou je vysoká reaktivita, která je způsobena příznivými fyzikálními vlastnostmi, a svojí selektivitou předčí doposud běžně používané metody izolace. Další z možností jejich uplatnění je při izolaci mikroorganismů a jejich biokomponent. Standartní mikrobiologický postup pro detekci patogenních bakterií obvykle vyžaduje nejméně čtyři kroky a nejméně čtyři různá kultivační média, proto celkový čas pro detekci cílových bakterií je několik dnů. Tento klasický prostup lze nahradit imunomagnetickou separací za využití specificky modifikovaných MPs. Staphylococcus aureus je mikroorganismus, který se přirozeně vyskytuje na kůži a sliznicích teplokrevných zvířat a lidí. U oslabených jedinců způsobuje infekce v rozsahu od mírných zánětů kůže a měkkých tkání až po život ohrožující sepse, syndrom toxického šoku a nekrotizující pneumonie. Vážným problémem je rezistence některých kmenů S. aureus k antibiotikům, např. k methicilinu. Tyto rezistentní kmeny se nejčastěji vyskytují v nemocničních zařízeních a komplikují tak léčbu pacientů. Proto se v poslední době hledá odpověď na otázku Co způsobuje rezistenci těchto kmenů?. V roce 2010 byla publikována první práce potvrzující souvislost mezi stafylokokovou rezistencí k methicilinu a zinkem. Následně bylo objeveno, že s touto rezistencí je spojený gen CzrC. Dalšími zinek-vázajícími proteiny, které mohou být spojeny s bakteriální mnohočetnou rezistencí k antibiotikům, jsou extracelulární proteasy, jako faktor rezistence HmrA. 12

13 2 CÍL PRÁCE Diplomová práce byla zaměřena na vývoj zcela nových a originálních postupů pro jednoduchou a rychlou izolaci buněk a zinkových proteinů u bakteriální kultury Staphylococcus aureus pomocí paramagnetických částic s následnou elektrochemickou detekcí. Pro řešení byly vytyčeny následující dílčí cíle: Popsat stav současné řešené problematiky Seznámit se s automatickou pipetovací stanicí epmotion Vytvořit program pro izolaci buněk a zinkových proteinů S. aureus pomocí automatické pipetovací stanice epmotion Optimalizovat podmínky navázání buněk a zinkových proteinů S. aureus na paramagnetické částice a jejich uvolnění Elektrochemicky detekovat obsah zinečnatých iontů v médiu a v mikroorganismu pomocí diferenční pulsní voltametrie Elektroforeticky detekovat zinek vázající proteiny SDS - PAGE 13

14 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Charakteristika druhu Staphylococcus aureus Taxonomie Stafylokoky patří mezi nejdéle studované bakterie. Francouzský přírodovědec Luis Pasteur a skotský chirurg Alexander Ogston byli první mikrobiologové, kteří si uvědomili souvislost mezi kokovitými bakteriemi a vznikem hnisu [1]. Pasteur roku 1880 popsal malé sférické bakterie izolované z hnisu odebraného z vředů a vzorků získaných od pacientů trpících osteomyelitidou a označil je za patogenní [2]. Ogston o dva roky později v roce 1882 poprvé použil slovo,,staphylococcus" (avšak pouze v popisném smyslu) pro označení skupiny koků, které se sdružují do shluků často v podobě hroznů a způsobují zánět a hnisání [3]. První, kdo použil tento termín v taxonomickém smyslu a identifikoval první druh Staphylococcus aureus, byl roku 1884 německý bakteriolog Rosenbach [4]. V roce 1974 byly známy pouze tři druhy stafylokoků (S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus), v současné době se do rodu Staphylococcus řadí 38 druhů, z nichž 9 má dva poddruhy a 1 tři poddruhy [1]. Obr. 1: Systematické zařazení S. aureus dle Garrity [5] 14

15 3.1.2 Rod Staphylococcus Rod Staphylococcus tvoří grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující, fakultativně anaerobní, chemoorganotrofní bakterie s respiračním a fermentativním metabolismem. Tvoří žluté až oranžové kolonie, některé druhy vytvářejí i kolonie bílé. Vyskytují se jednotlivě, v párech a nepravidelných shlucích, občas v tetrádách. Jejich růstové optimum je C. Stafylokoky patří mezi všudypřítomné bakterie, nejčastěji se vyskytují na kůži a mukózních membránách teplokrevných zvířat a člověka [6-8] Druh Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus je fakultativně anaerobní, grampozitivní, chemoorganotrofní bakterie s respiračním a fermentativním metabolismem. Buňky jsou nepohyblivé, nesporulující, sférické koky o průměru 0,5 1,5 µm. Vyskytují se samostatně, v párech nebo v nepravidelných shlucích. Vytváří typické zlatě žluté kolonie. Rozmnožuje se v teplotním rozmezí 7 45,5 C a je schopen se rozmnožovat v přítomnosti 10% NaCl. Toxiny tvoří během rozmnožování či krátce po něm, při teplotě pod 10 C toxin netvoří. Z biochemického hlediska patří mezi koaguláza pozitivní druhy. Produkuje enzym koagulázu, který způsobuje koagulaci krevní plazmy. Dále je kataláza pozitivní a oxidáza negativní [6,7]. S. aureus produkuje celou řadou faktorů virulence, např. enterotoxiny, exfolitativní toxiny, hemolyziny, leukocidiny, TSST-1 a extracelulární enzymy, které se spolu s některými povrchovými složkami podílí na jeho patogenitě [9,10]. S. aureus způsobuje velmi často různé infekce od mírných zánětů kůže a měkkých tkání až po život ohrožující sepse, syndrom toxického šoku a nekrotizující pneumonie [11]. Antigenní strukturu S. aureus tvoří několik částí: Peptidoglykan - je hlavní složkou buněčné stěny. Navozuje v těle tvorbu interleukinu-1 a opsonizačních látek. Aktivuje komplement, má endotoxinovou aktivitu a působí jako chemotaktický faktor. Na peptidoglykanu je navázána kyselina teichoová a protein A. Kyselina teichoová - navozuje tvorbu protilátek. Protein A - se váže na Fc fragment IgG, čehož se pak užívá v diagnostice u tzv. koaglutinační reakce. Dále inhibuje opsonizaci a fagocytózu - má antifagocytární a antikomplementární účinek. Adheziny - jsou kolonizační faktory. Způsobují adhezi stafylokoků na mezibuněčné nebo buněčné struktury (např. fibrinogen, fibronektin, kolagen, sialoprotein) 15

16 Vázaná koaguláza - je shlukovací faktor a zprostředkovává vazbu na fibrinogen [9,12]. Obr. 2: Mikrofotografie kolonií S. aureus pořízena pomocí skenovacího elektronového mikroskopu Buněčná stěna grampozitivních bakterií Buněčná stěna grampozitivních bakterií je relativně silná (přibližně 20 nm), polopropustná membrána s otvory okolo 100 Ångströmů (1 Å = m) tvořena převážně peptidoglykanovou vrstvou, kterou jsou proloženy lineární řetězce teichoové kyseliny spojené s cytoplazmatickou membránou. Mimo teichoové kyseliny jsou na peptidoglykanovou vrstvu vázány také polysacharidy. Ty jsou svým složením charakteristické pro různé skupiny grampozitivních bakterií neobsahuje lipidy [11]. grampozitivních bakterií. Buněčná stěna Buněčná stěna S. aureus je složena z peptidoglykanu, lipoteichoové kyseliny (LTA), teichoové kyseliny v buněčné stěně (WTA), polysacharidů a proteinů. Peptidoglykan je tvořen střídajícími se lineárními řetězci N-acetylglukosaminem a N-acetyl muramovou kyselinou. Většina stafylokoků produkuje extracelulární polysacharid poly-n-acetyl-b-1,6-glucosamin (PNAG), známý jako intercelulární polysacharid adhesin (PIA). Přítomnost tohoto polysacharidu je velmi důležitá pro vznik biofilmu. Kromě toho PIA/PNAG hraje roli v imunitní odezvě, jelikož tento polysacharid může zapouzdřit buňky a tím skrýt povrchové bílkoviny, které jsou vystaveny na povrchu stěny [13,14]. 16

17 Obr. 3: Struktura buněčné stěny grampozitivních bakterií (upraveno dle Umeda [14]) Methicilin rezistentní kmeny S. aureus S objevem penicilinu roku 1928 A. Flemingem se postupně začala vyvíjet i rezistence bakterií na antibiotika. Stafylokoky si začaly vytvářet enzym β - laktamázu, který rozkládá ATB penicilinové řady. Začátkem 60. let 20. století se začaly vyvíjet polysyntetické peniciliny, které vynikaly svojí odolností vůči působení β-laktamázy. První polysyntetický penicilin nesl název methicilin. Methicilin se váže v bakteriální buňce na proteiny vázající penicilin (PBP). PBP jsou transpeptidázy, které se účastní tvorby křížových vazeb mezi řetězci peptidoglykanu, které se podílejí na stavbě buněčné stěny. Navázáním antibiotika na PBP se zastaví tvorba peptidoglykanu a vyvolá uvolnění autolytických enzymů [15]. V roce 1961, krátce po zavedení methicilinu do klinické praxe, byly objeveny methicilin rezistentní kmeny S. aureus (MRSA) [11,15]. Rezistence na methicilin je způsobena přítomností genu meca, který je lokalizován na stafylokokové chromozomové kazetě (SCC). SCC je úsek genomové DNA dlouhý od 21 do 67 kb, kde se nachází různé geny, zejména geny pro virulenci a rezistenci. Nejznámější SCC je SCCmec, na které je lokalizován gen meca, který je zodpovědný za rezistenci k methicilinu a kóduje pozměněný protein vázající penicilin (PBP2 ). PBB2 má nižší afinitu k β - laktamům než PBP, proto jsou β - laktamy v přítomnosti PBP neúčinné [16,17]. Těžké kovy, zejména zinek, vykazují antibakteriální aktivitu. Problémem je, že si bakterie dokáží vypěstovat rezistenci k těžkým kovům. V roce 1991 bylo publikováno, že při ztrátě rezistence k methicilinu u bakterií došlo také k ztrátě rezistence vůči těžkým kovům a tetracyklinu [18]. Na druhé straně bylo zjištěno, že expozice 17

18 nutraceutiky, konkrétně derivátů zinku, produkty česneku a echinacei, způsobily rezistenci S. aureus vůči ATB [19]. Byla tak zjištěna souvislost mezi stafylokokovou rezistencí k methicilinu a zinku [20]. Moodley a spol. prokázali [21], že krmivo obohacené o tetracyklin nebo zinek zvyšují počet MRSA v nosní dutině prasat [21]. Dále bylo zjištěno, že gen czrc kódující rezistenci k zinku a kadmiu v MRSA, má vztah ke vzniku rezistence k methicilinu [22]. Tento gen je rozšířený u lidí a zvířat a kóduje tvorbu proteinů sloužících k transportu těžkých kovů. Zinek vázající endopeptidázy patří do další skupiny proteinů, které se podílí na rezistenci bakterií na zinek a ATB. Faktorem rezistence na ATB je zinek vázající endopeptidáza HmrA z MRSA [23]. HmrA je rozšířený faktor rezistence na ATB u mnoha bakteriálních druhů. Další zinek dependentní endopeptidázy ZmpA a ZmpB štěpící antimikrobiální peptidy byly objeveny v Burkholderia cenocepacia [24]. Kromě toho bylo zjištěno, že protein obsahující vazebné místo pro penicilin a zinek vázající metaloproteinázy se podílí na přenosu signálu stafylokokové rezistence k ß-laktamovým ATB [25]. Kromě výše uvedeného spojení s rezistencí vůči ATB je zinek vázán i v dalších skupinách proteinů obecně odpovědných za bakteriální patogenitu: superantigyny [26,27], lysostafin [28], další extracelulární proteázy [29], enterotoxiny [30], adhezní a transkripční faktory [31], DNA-vazebné a proteiny [32,33] a proteiny odpovědné za tvorbu biofilmu [34]. 3.2 Nanotechnologie Pojem nanotechnologie je v poslední době nejvíce používaný termín v řadě vědních oborů, techniky i laické věřejnosti. Označení nano je dlouho znám jako předpona soustavy SI a znamená mocninu 10-9, tj. jednu miliardtinu. Termín nanotechnologie je relativně nový pojem obsahující projektování, charakterizaci, produkci a aplikaci struktur, zařízení a systémů řízením tvarů a rozměrů v nanometrické škále. Jedním z prvních, kdo poukázal na možnosti nanostruktur, byl Richard Feynman. V roce 1959 ve své přednášce s názvem Tam dole je spousta místa mluvil o cílené manipulaci s atomy. V jeho době byly Feynmanovy myšlenky považovány za utopické, ale o dvacet let později vynálezy rastrovacího tunelového mikroskopu (Scanning Tunneling Microscopy) a mikroskopu atomových sil (Atomic Force Microscopy) už umožňovaly nejen pozorování, ale i manipulaci s atomy a molekulami [35-37]. Definovat tuto interdisciplinární vědní oblast a technologii je důležité pro jejich odlišení od klasických vědních a technických disciplín. Proto se často používají slova 18

19 s předponou nano-, jako např. nanomateriály, nanomedicína, nanobiotechnologie, nanoanalytika, nanoelektronika a řada dalších, ale i nanochemie a nanofyzika, což může být někdy zavádějící [35]. V současné době jsou v rámci nanotechnologie rozlišitelné čtyři hlavní proudy výzkumu a vývoje [38] : nanoelektronika nanomateriály (nanostrukturní materiály) molekulární nanotechnologie mikroskopy s nanometrovou rozlišovací schopností Jako nanomateriály, nebo též nanostrukturní materiály, se označují takové materiály, jejichž stavebními prvky jsou nanočástice s přesně definovanými vlastnostmi. Prostorové uspořádání nanočástic může vytvářet další struktury, jako například vlákna, trubice, nebo třeba tenké vstvy. Zde je zřejmé, proč se v nanotechnologii nepožaduje, aby podmínkou pro zařazení problému do nanovědy byly všechny rozměry nanometrové. Nanovlákna nacházejí významné uplatnění v lékařských aplikací, další velmi využívaný typ nanomateriálu jsou (para)magnetické částice, u nichž lze modifikovat, jejich povrch a tím, tak separovat širokou škálu látek [38-41] Magnetismus, typy magnetismů Magnetické částice se podle svých magnetických vlastností mohou označit jako paramagnetické, superparamagnetické a feromagnetické [42]. Magnetismus je fyzikální jev, který je spojen s pohybem nosičů elektrických nábojů. Elektrony rotují a obíhají kolem jádra atomu, čímž vytvářejí elementární magnetické momenty. Existují 3 hlavní typy chování částic v magnetickém poli, když částice pole zeslabují, jedná se o diamagnetismus, pokud ho mírně zesilují, jde o paramagnetismus, pokud ho výrazně zesilují, jedná se o ferromagnetismus [43,44] Paramagnetismus Paramagnetismus je způsoben přítomností atomů s nenulovým permanentním magnetickým momentem. Magnetické dipólové momenty jednotlivých částic spolu interagují nepatrně a bez přítomnosti vnějšího magnetického pole jsou orientovány nahodile. Po vložení do vnějšího magnetického pole mají částice s permanentním magnetickým dipólovým momentem snahu orientovat se souhlasně s vnějším 19

20 magnetickým polem. Tomuto ději konkuruje neuspořádaný tepelný pohyb částic. U většiny paramagnetik velikost magnetizace závisí na termodynamické teplotě T tzv. Curieovým vztahem: T = C B/T, kde C je Curieova konstanta a B je indukce [45] Superparamagnetismus Superparamagnetismus je chování magnetického celku složeného z mnoha nanočástic s feromagnetickými či ferimagnetickými vlastnostmi. Každá nanočástice má nenulovou magnetizaci, jejíž hodnota se může vlivem teplotních fluktuací překlopit na jinou hodnotu. V průměru má ale soubor nanočástic bez vnějšího magnetického pole nulovou magnetizaci. V přítomnosti pole se dipólové momenty nanočástic zorientují ve směru pole a magnetizace celého objemu je nenulová stejně jako u paramagnetik. Hodnota dosažené magnetizace je ale mnohem vyšší než u běžných paramagnetik. Roli, kterou u paramagnetika hrají jednotlivé spiny, mají u superparamagnetika feromagnetické nanočástice [46] (Para)magnetické částice Magnetizovatelné částice jsou středem velkého zájmu pro své potenciální použití v různých biologických disciplínách, biotechnologiích, environmentálních technologiích, medicíně i v analytických aplikacích [40]. Obrovskou výhodou MPs je jejich malá velikost, která dosahuje nano- až mikrometrů (100 μm - 5 nm v závislosti na tom, jaké molekuly chceme izolovat) a jejich velký funkční povrch v poměru k objemu, který je možné obalit různými biologickými molekulami, prostřednictvím kterých interagují s žádoucími látkami nebo se tak vážou na cílové buňky [39]. Těmito částicemi lze izolovat buňky, buněčné části, DNA i RNA. Velmi žádoucí jsou jejich magnetické vlastnosti, kterých se využívá při manipulaci MPs do určitých míst vystavených magnetickému poli [13,41]. Tyto částice mají většinou charakter kompozitních materiálů, které jsou složeny z vlastní fero- nebo ferimagnetické složky (zodpovědné za interakci s vnějším magnetickým polem) a složky většinou diamagnetické (nemagnetické), která zajišťuje požadovanou interakci s biologickými systémy [47,48]. Fyzikálně-chemické vlastnosti MPs, jako je velikost, úroveň magnetizace, povrch MPs jsou důležité při definování jejich užitečnosti v biologických disciplínách. Vlastnosti částic je možné ovlivnit při jejich syntéze, kdy je třeba zvolit vhodné podmínky. Částice by měly mít vhodnou 20

21 velikost, měly by být uniformní, monodisperzní. Dále se provádí různé modifikace částic, aby se zamezilo aglomeraci a aby byly částice stabilní. Pokud se jedná o in vivo aplikaci, je důležité, aby byly částice netoxické [49]. Magnetická částice je tvořena magnetickým jádrem, ochrannou vrstvou, která zabraňuje oxidaci kovu a aktivní molekulou, která je specifická dle použití magnetické částice. Jádro je nejčastěji tvořeno magnetitem (Fe 3 O 4 ), který má ferro(ferri) magnetické vlastnosti nebo maghemitem (γ-fe 2 O 3 ), kde je železo v oxidačním stavu 3+ a proto se používá pro bioaplikace. V literatuře jsou popsány další sloučeniny (CoFe 2 O 4, NiFe 2 O 4, MnFe 2 O 4 ), které mají silné magnetické vlastnosti. Použití těchto sloučenin v biomedicíně je problematické v důsledku toxicity kovů (Co, Ni, Mn). Ochranná vrstva jádra je tvořena různými látkami např. poly(glycidyl methakrylát) (PGMA), kopolymer poly(2-hydroxyethyl methakrylát-co-glycidyl methakrylát) [P(HEMA-co-GMA)] nebo kopolymer poly (2-hydroxyethyl methakrylát-co-ethylen dimethakrylát) [P(HEMA-co- EDMA)] [50,51]. Obr. 4: Paramagnetická částice používaná pro bioaplikace upraveno dle McBain [51] 3.3 Imunomagnetická separace Standartní mikrobiologický postup pro detekci patogenních bakterií obvykle vyžaduje čtyři kroky a nejméně čtyři různá kultivační média, proto celkový čas pro detekci cílových bakterií je několik dnů. Jednou z možností jak zkrátit tento čas je nahrazení selektivního kultivačního nabohacovacího kroku (obvyklá doba trvání je 24 hodin) postupem nevyžadujícím kultivaci. Ideální možností je využití specifické imunomagnetické separace (IMS) cílových bakteriálních buněk přímo z analyzovaného vzorku, nebo z neselektivního pomnožovacího média po vhodně dlouhé kultivaci. 21

22 Vlastní separační krok, tj. specifické navázání cílových buněk na imunomagnetické částice, trvá obvykle méně než jednu hodinu (nejčastěji používané kultivace jsou 10 až 60 minut) [52,53]. Pro správnou izolaci cílových buněk je důležité zvolit vhodné magnetické částice s navázanou protilátkou [39]. Komerční MPs použité v magnetické separaci jsou typické paramagnetické částice s velikostí v mikrometrech (1-10 mm) a jsou vybaveny polymerním obalem na vnější straně magnetického nanočásticového jádra. Tyto na zakázku dělané magnetické částice jsou modifikovány pomocí různých vazebných skupin pro specifické chemické vazby [54]. Pro aplikaci MPs v separačních metodách se nejčastěji využívají dva způsoby modifikace. První způsob je založen na elektronové obalové vrstvě pro elektrostatickou adsorpci biomolekul. Matsunaga et. al. [50], použil látku aminosilan 3-[2-2- aminoethy(amino)-ethylamino-propyetrimethoxysilan] k modifikaci MPs v roztoku toulenu vyvolávající hustý amino povlak na povrchu částic. Tato metoda v porovnání s konvenčními metodami umožňuje, aby se k promývání nepoužívalo organických roztoků. Tím se eliminuje vliv organických roztoků na následnou detekci signálu. Druhý způsob je založen na biomolekulách, které jsou zakotvené v částicích, tyto biomolekuly specificky vážou cílové biomolekuly [55]. Například kovalentní imobilizace, kde se na povrch částic naváže tosylová, karboxylová, amino či epoxid skupina a to buď přes N- nebo C- konec [40]. Nevýhoda tohoto typu imobilizace je v tom, že může docházet k denaturaci, interferenci se stabilizátory atd. Při nekovalentní imobilizaci se naváže avidin/ streptavidin, protein G/ protein A, His- tag (IMAC) [56]. Obr. 5: Příklad imunomagnetické separace patogenů. V prvním kroku se buňky S. aureus navázaly na paramagnetické částice, následovalo přiložení magnetu ke zkumavce a odseparování odpadu. Poté se pomocí elučního pufru uvolnily buňky S. aureus z MPs a takto izolované buňky se dále detekovaly. 22

23 3.4 Těžké kovy Těžké kovy jsou prvky z periodické tabulky s hustotou větší než 5g/cm 3. V přírodě se vyskytuje 90 prvků, z toho jich je 21 nekovů, 16 lehkých kovů a 53 jsou těžké kovy (včetně arzenu). Většina těžkých kovů patří do skupiny přechodných kovů s neúplně obsazenými d-orbitaly. Tyto neúplně obsazené d-orbitaly jim dávají možnost tvořit komplexní sloučeniny, kde kationty těžkých kovů vystupují jako centrální ionty, které mohou mít redoxní aktivitu. Výjimkou jsou Zn, Cd, Hg, které mají plně obsazené d- orbitaly [12]. Ionty těžkých kovů hrají důležitou roli jako esenciální prvky, avšak ve vyšších koncentracích jsou toxické dochází k tvorbě nespecifických komplexních sloučenin v buněčné stěně. Těžké kovy s vysokou molekulovou hmotností mají tendenci silně se vázat k sulfidovým skupinám naproti tomu dvojmocné kationty kobaltu, niklu, mědi a zinku se váží k sulfidovým skupinám středně silně. Intracelulární koncentrace kovových iontů v buňkách organismů musí být přísně kontrolována a přítomnost systému rezistence proti nim je jedním ze základních požadavků živých organismů pro udržení homeostázy [57] Těžké kovy a mikroorganismy Kovy hrají zásadní roli v životních procesech mikroorganismů. Některé kovy (např. Ca, Co, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, Ni a Zn) jsou důležité živiny a jsou pro mikroorganismy esenciální. Jiné kovy (např. Ag, Al, Cd, Au, Pb a Hg) nejsou pro mikroorganismy důležité, jsou neesenciální a potenciálně toxické pro živé organismy zejména pro mikroorganismy. Esenciální kovy fungují jako katalyzátory biochemických reakcí, jsou stabilizátory proteinových struktur a bakteriální buněčné stěny. Toxicita neesenciálních kovů je způsobena přesunem esenciálních kovů z jejich přirozených vazebných míst nebo interakcí ligandu 1 a 2. Kromě toho, esenciální i neesenciální kovy ve vysokých dávkách poškozují buněčné membrány, narušují buněčné funkce, mění specifičnost enzymů a poškozují strukturu DNA [57,58]. Těžké kovy jsou na planetě Zemi zastoupeny ve velkých množstvích a mikroorganismy jsou jim vystaveny již od prvopočátku. Proto se nabízí otázka, zda se mikrobiální systémy pro rezistenci k těžkým kovům vyvinuly jako odpověď na znečištění v několika posledních stovkách či tisících letech, nebo se jejich stáří počítá na bilióny let. Argumentem podporujícím hypotézu, že jsou tyto systémy 23

24 v mikrobiálních organismech přítomny již bilióny let, je jejich množství a široké rozšíření mezi mikroorganismy [59] Obrana mikroorganismů před těžkými kovy Vzhledem k tomu, že těžké kovy nemohou být degradovány nebo modifikovány jako toxiny organického původu, proto existuje pouze několik málo základních způsobů mechanismů ochrany, které se podílí na vzniku rezistence vůči těžkým kovům v bakteriálních buňkách, a tím na udržení vnitřní homeostázy [59,60]: Aktivní transport kovů z cytoplazmy do vnějšího prostředí buňky - ATPázy nebo chemiosmotické membránové pumpy Tvorba komplexů s kovy a jejich extracelulární vylučování - tzv. precipitace Volatilizace Intracelulární (vnitrobuněčná) akumulace Tvorba specifických vakuol Tvorba proteinů vázajících těžké kovy metalothionein, SmtA, chaperon CopZ, SilE, aj Aktivní transport kovů z cytoplazmy do vnějšího prostředí buňky Hlavní skupinou rezistentních systémů jsou efluxní pumpy. Tyto pumpy jsou ve většině případů kódovány geny nesené plazmidy. Mezi ně patří ATPázy (ATPázy grampozitvních organismů slouží k exportu Cd (II) a ATPázy pro export arzenu u gamnegativních organismů). Dále sem patří chemiosmotické membránové pumpy - efluxní systém pro export arzenu kódovaný plazmidem u grampozitivních bakterií a chromozomem v případě gramnegativních bakterií [61] Tvorba komplexů s kovy a jejich extracelulární vylučování - tzv. precipitace Precipitace může být závislá nebo nezávislá na buněčném metabolismu, může tedy probíhat jak u živých tak u neživých mikroorganismů. V živých buňkách je odstranění kovu spojeno s aktivním obranným mechanismem mikroorganismů. Mikroorganismy přítomnosti toxických kovů produkují metabolity, které precipitují s kovy na jejich povrchu. V druhém případě, u neživých mikroorganismů, dochází k vychytávání kovů pomocí chemických skupin, které jsou přítomny ve strukturách buněčných stěn [62]. 24

25 Volatilizace Mikrobiální redukcí dochází ke snížení valence kovů. Redukce může být částečná (z vyššího na nižší valenční stav) nebo úplná za vzniku elementárního kovu. Nejvíce je prostudována rtuť a většina bakterií je právě schopna ji redukovat. Hg (II) je transportována z roztoku do buněčné membrány a tam je redukováni enzymem na Hg 0 [63]. Za redukci je zodpovědný enzym reduktáza specifický ke rtuti, který je produkován genem mera. Elementární Hg 0 difunduje z buňky, jelikož by mohla být zpět oxidována, a je odstraněna z okolního roztoku vypařením [57] Příjem vybraných těžkých kovů jako esenciálních živin K funkci těžkých kovů jako esenciálních prvků je nutné, aby mikroorganismy byly schopny tyto ionty přijímat pomocí různých transportních systémů. V bakteriálních buňkách může být jeden prvek přenášen několika typy přenašečů, stejně tak jeden přenašeč může transportovat více typů kovových iontů [57]. Tab. 1: Proteinové rodiny důležité pro transport těžkých kovů upraveno dle Nies [54] Proteinová rodina Směr transportu Energie Přenášené kovy Složení přenašeče ABC Influx ATP Mn (II), Zn (II), Ni (II) ABC jádro +, Fe (II) periplazmaticky vázaný protein ABC jádro + Efflux ATP - membránový fúzní protein a faktor vnější membrány Typ P Efflux/Influx ATP Ag +, Ca (II), Cd (II), Cu (II), Mn (II), Ni (II), Fe (II), K +, Pb (II), Zn (II) 1 membránový protein Typ A Efflux ATP Arsenitan RND HoxN Efflux Influx Protonový gradient Řízeno chemiosm oticky 25 Cd (II), Co (II), Ni (II), Zn (II), Cu (II), Ag +? Co (II), Ni (II) 1 membránový protein + dimerní ATPázová podjednotka 1 protein včleněný do CPM + membránový fúzní protein + faktor vnější membrány Membránový integrální protein

26 CHR Antiport? MIT Influx CDF Efflux Řízeno chemiosm oticky Řízeno chemiosm oticky Řízeno chemiosm oticky Chroman Většina kationtů Cd (II), Co (II), Zn (II),Fe (II) Membránový integrální protein (ChrA) Membránový integrální protein (CorA) Membránový integrální protein (CzcD, ZRC1p, ZnT1) Příjem zinku mikrobiální buňkou Zinek je modrobílý, měkký, lehce tavitelný kov, který patří k nejsnáze těkajícím kovům. Ve sloučeninách se vyskytuje pouze ve formě Zn (II). Zinek má plně zaplněný d-orbital a proto netvoří komplexní sloučeniny [33]. V zemské kůře je zinek poměrně bohatě zastoupen. Průměrný obsah činí kolem 100 mg/kg [34]. Zinek patří k prvkům s výraznou biologickou aktivitou. Tento prvek je důležitou esenciální živinou je nezbytně nutný pro funkci některých enzymů a v nízkých koncentracích je přítomen ve všech (nebo většině) buněk. Problémem bakteriální buněčné homeostázy je, aby byl zinek v dostatečném množství přijímán a jeho množství bylo regulováno různými čerpadly a odtoky, které zabrání nadměrnému příjmu zinku. Pro příjem a výdej zinku v mikrobiální buňce nefungují stejné transportní systémy a některé tyto systémy jsou specifické pro zinek, jiné mohou fungovat jak pro zinek, tak pro jiné kovy [15]. Zinek je transportován několika typy přenašečů (obr. 4). Mimo nespecifického a rychlého transportu zinku, který je zprostředkován transportním systémem pro Mg (II), jsou to systémy specifické právě pro příjem zinku. V následujících čtyřech bodech jsou shrnuty typy přenašečů Zn (II), které byly popsány v buňkách mikroorganismů [57]. CorA MIT byl pozorován u Saccharomyces cerevisiae, mnoha druhů bakterií i archeí. Chemiosmotický transportní systém - MgtE, který není mezi mikroorganismy tak rozšířen jako výše zmíněný CorA. ATPáza typu P MgtA, která mnohdy transportuje zinek lépe než hořčík. ABC přenašeče, které byly popsány u Streptococcus pneumonie, Streptococcus gordonii a Escherichia coli. 26

27 Tab. 2: Transport Zn (II) mikrobiální buňkou upraveno dle Silver [56] Název Funkční rodina Směr transportu Bakterie ZnuABC ABC ATPáza Absorpce Escherichia coli MntH Nramp chemiosmoticky Absorpce E. coli ZupT ZIP chemiosmoticky Absorpce E. coli CorA Dvojmocný kationt chemiosmoticky Absorpce E. coli ZiaA P-typ ATPáza Efflux cyanobacteria ZntA P-typ ATPáza Efflux E. coli CadA P-typ ATPáza Efflux Staphylococcus aureus CzcCBA RND chemiosmoticky Efflux Ralstonia metallidurans ZntCBA RND chemiosmoticky Efflux cyanobacteria CzcD CDF chemiosmoticky Efflux R. metallidurans ZntA CDF chemiosmoticky Efflux S. aureus ZitB CDF chemiosmoticky Efflux E. coli Obr. 6: Proteinové rodiny zapojené do metabolismu zinku v bakteriální buňce upraveno dle Nies [54]. K transportu zinku dovnitř buňky slouží několik různých typů přenašečů nespecifický protein CorA, který patří do skupiny přenašečů anorganických kovů (MIT); nespecifický chemiosmotický přenašeč hořčíku (MgtE); ATPáza P-typu (ATP, 27

28 P- typ); ABC transporter. K detoxifikaci zinku z buňky jsou zapojeny skupina řídících proteinů (RND); ATPáza P-typu (ATP, P- typ) a kation-difuzní přenašeč (CDF) Metalothionein Kromě přenašečů ovlivňují koncentraci Zn (II) v buňce také zinek - vazebné proteiny, především bílkovina metalothionein (MT). MT patří do skupiny intracelularních, nízkomolekulárních na cystein (Cys) velmi bohatých proteinů (obsah Cys až 30 % v molekule proteinu) o molekulové hmotnosti od 6 10 kda [39]. Díky své vysoké afinitě k těžkým kovům, např. zinku, mědi nebo kadmiu, je jejich hlavní funkcí homeostatická kontrola a detoxikace těchto těžkých kovů u vývojově rozdílných organismů. MT byl objeven roku 1957, kdy Margoshes a Vallee izolovali MT jako hlavní protein vázající kadmium v ledvinách koně [40]. Lidský genom obsahuje 16 genů pro metalothioneiny, u myší jsou to 4 gen a nejvíce jich je u vyšších eukaryot [58,59]. Metalothioneiny jsou rozděleny do tříd MT-I, MT-II a MT-III s ohledem na primární strukturu, množství cysteinových zbytků a dle organismu, ze kterého byly izolovány. Třída MT-I zahrnuje savčí metalothioneiny tvořené aminokyselinami. Třída MT-II zahrnuje především bakteriální formy metalothioneinů (= proteiny se vzdálenou podobností k MT-I třídě; odlišující se mimo jiné v rozmístění cysteinových zbytků v molekule). Třída MT-III zahrnuje rostlinné metalothioneiny. MT-I a MT-II, jsou často izolovány se zinkem, což podporuje tvrzení, že tyto proteiny mají důležitou roli v metabolismu a ukládání těchto základních kovů. MT-I a MT-II váží sedm zinečnatých iontů, které jsou tetrahydráty koordinovány na thiolové skupiny redukovaného cysteinu ve dvou odlišných uskupeních a to jako Zn 3 Cys 9 a Zn 4 Cys 11 [58,64-66]. Bakteriální metalothioneiny byly dosud identifikovány jen v několika málo druzích kvasinek, sinic, pseudomonád, dále také v E. coli a S. aureus. Tento malý 56 aminokyselin dlouhý polypeptidový produkt genu smta obsahuje devět cysteinových reziduí, která vytváří klastry ve dvou skupinách po čtyřech a pěti cysteinech. Stejně jako cysteiny ve zvířecích metalothioneinech, pravděpodobně vážou dvojmocné kationty nezávisle v N-terminální a C-terminální části [67]. Plní tak funkci proteinů vázajících kationty kovů do své struktury a snižují tak koncentraci volných iontů v cytoplazmě kde se vyskytují [68]. 28

29 4. MATERIÁL A METODY 4.1 Seznam materiálu Biologický materiál Pro zpracování diplomové práce byl používán bakteriální kmen Staphylococcus aureus NCTC Tento kmen pochází z České sbírky mikroorganismů oddělení mikrobiologie Přírodovědecké fakulty Masarykovy Univerzity. Buňky bakteriálního kmene byly uchovávány na šikmém agaru (masopeptonový agar č. 1 - MPA 1) při teplotě 4 C a byly přeočkovávány jednou za tři týdny Chemikálie Hexahydrát dusičnanu zinečnatého, heptahydrát síranu zinečnatého, chlorid zinečnatý, kyselina dusičná, kyselina chlorovodíková, peroxid vodíku, živný bujón (masový pepton 5 g/l, NaCl 5 g/l, hovězí extrakt 1,5 g/l, kvasničný extrakt 1,5 g/l, ph = 7.4 ± 0.2, HIMEDIA, Indie), ředící pufr 1 na bakterie (0,6M NaOH, C 4 H 10 O 2 S 5ml, NaN 3 0,10g, C 6 H 8 O 7 14g, NaCl 11,5g, do 1l MiliQ H 2 O), ředící pufr 2 na bakterie (C 4 H 10 O 2 S 5ml, N 3 Na 0,10g, C 6 H 8 O 7 14g, NaCl 11,5g, do 1l MiliQ H 2 O), acetátový pufr: 0,2 M CH 3 COONa (ph 5,0; upraveno CH 3 COOH); amoniakální pufr 1M NH 3, NH 4 Cl,[Co (NH 4 ) 6 ]Cl 3 ; PBS: 0,14 M NaCl+3 mm KCl+4 mm Na 2 PO 4 ph 7,4; ACS voda. Všechny běžné chemikálie byly zakoupeny od Sigmy Aldrich, USA v ACS čistotě Použité přístroje Autokláv - Tuttnauer 2540EL (Schoeller Instruments, Česká Republika), automatická pipetovací stanice epmotion (Eppendorf, Německo), automatické pipety (Eppendorf, Německo), automatický chemický analyzátor BS-200 (Mindray, Čína), centrifuga - MiniCentrifuga/Vortex FVL-2400N Combispin (Biosan, Litva), chladnička - Fagor Innovation, flow box - DNA/RNA UV- Cleaner UVC/T-AR (Biosan, Litva) a EUROFLOW EF/S- Clean Air (Schoeller Instruments, Česká Republika), fotometr - Multiskan EX (PlivaLachema, Česká republika), mikrovlnná pec - Multiwave 3000 (Anton-Paar, Švýcarsko), spektrofotometr - SPECORD 210 (AnalytikJena, United Kingdom), Termostat - třepačka - Biometra WT17, ultrazvuková jehla - Sonopuls 29

30 mini20 (Bandelin, Německo), váhy - Analytical balances Cubis (Sartorius, Německo) a College 150 (Mettler - Toledo, Švýcarsko) Magnetické částice a jejich modifikace Imunoglobulin G (IgG) z lidského séra byl zakoupen u firmy Sigma-Aldrich, USA. Slepičí protilátky byly připraveny na zakázku (HENA, Česká republika). Pro kovalentní imobilizaci protilátek byly použity paramagnetické částice Dynabeads MyOne Tosylactivated (Invitrogen, Norsko). Bylo použito 1000 µg protilátek na 25 mg paramagnetických částic. Před navázáním byl odstraněn azid sodný, který je součástí uchovávacího roztoku, a protilátky byly okyseleny na ph 2,5 přídavkem HCl. Po 15 minutách byly protilátky vloženy do fosfátového pufru (PBS, ph=7,4). Pro všechny výměny pufrů byly použity filtry Amicon Ultra 0,5 s membránou 50 K (Millipore, USA). Kovalentní imobilizace byla provedena v celkovém objemu 625 μl v 0,1 M borátovém pufru (ph 9,5) s 0,1 M (NH 4 ) 2 SO 4 po dobu 24 hodin za mírné rotace. Volný povrch částic byl následně zablokován 0,5% BSA (hovězí sérový albumin) v PBS (w/v) s 0,05% Tween-20 (v/v) po dobu 10 h. Po zablokování byly částice třikrát promyty 1 ml 0,1% BSA v PBS (w/v) s 0,05% Tween-20 (V/V) následně byly resuspendovány v 625 μl skladovacím pufru (promývací pufr s 0,02% NaN 3 (w/v)). Funkčnost paramagnetických částic se slepičími protilátkami byla ověřena pomocí konjugátu králičí protilátky proti slepičím imunoglobulinům s křenovou peroxidázou. 4.2 Příprava vzorků Příprava vzorku pro sledování růstových křivek S. aureus byl kultivován za třepání (600 rpm, Incubator Hood TH 15, Edmund Buhler GmbH, Německo) při 37 C po dobu 6 hodin, dokud nebyl zákal kultivované kultury 0,1 při vlnové délce 600 nm (Specord 210, AnalytikJena, Německo). Narostlá bakteriální kultura byla dána do osmi 100 ml Erlenmeyerových baněk ke kterým bylo přidáno 0; 1,5; 5; 10; 25; 50; 100; 250 μm Zn (II) (ZnCl 2, ZnSO 4, Zn(NO 3 ) 2 ). Roztok byl promíchán a napipetován do plastových kyvet (AnalytikJena, Německo) o objemu 3 ml. Následně byla na spektrofotometru (SPECORD 210, AnalytikJena, Německo) v 30 minutových intervalech po dobu 24 hodin měřena absorbance při vlnové délce λ =

31 nm. Kyvetový systém byl zahříván pomocí termostatu na teplotu 37 C (F12/ED Julabo, Německo). Všechna měření byla v pěti opakováních. Výsledné absorbance byly zprůměrovány a přepočítány ke kontrolní variantě, která představovala 100 % Příprava vzorků pro detekci množství zinku 100 ml vzorku S. aureus, který byl odebrán ze šikmého agaru do živného bujónu a inkubován na třepačce při 37 ºC po dobu, než byl zákal roven absorbanci 0,1, byl dán do osmi 100ml Erlenmeyerových baněk a byl k němu přidán zinek v množství 0; 1,5; 5; 10; 25; 50; 100; 250μM (ZnSO 4, ZnCl 2, Zn(NO 3 ) 2 ). Připravené vzorky byly inkubovány a třepány 24 hodin při 37 ºC. Po 24 hodinách se z takto natřepaných vzorků bylo odebráno 2 ml vzorku do mikrozkumavek, které byly centrifugovány při 1500 rpm po dobu 15 minut. U 500µl supernatantu bylo změřeno množství zinku, zbytek byl odseparován a získané buňky byly 3 krát promyty fosfátovým pufrem o ph 7. Po posledním promytí bylo k buňkám přidáno 1,5 ml fosfátového pufru. Takto připravený vzorek byl ultrazvukován pomocí ultrazvukové jehly po dobu 2 minut. Poté byly všechny vzorky třepány 5 minut a centrifugovány 15 minut. Ze získaného supernatantu bylo odebráno 500 µl na detekci volného zinku 500 µl na detekci celkových proteinů. K získaným buňkám bez supernatantu bylo přidáno 350 µl HNO 3 a 150 µl H 2 O 2 a takto připravené vzorky byly mineralizovány. Mineralizace probíhala v Microwave Anton Paar 3000 se zvoleným programem po dobu 50 minut (10 minut 50W, 30minut 100W, 10 minut 0W). U 500 µl zmineralizovaného vzorku bylo detekováno množství vázaného zinku Stanovení množství zinku před mineralizací 100 µl vzorku bylo napipetováno do mikrozkumavky typu Eppendorf společně s 900 µl acetátového pufru (ph = 5). Mikrozkumavky s takto připraveným vzorkem byly umístněny do autosampleru 813 Compactautosampler. Samotné měření bylo provedeno na měřící jednotce VA Computrace 746 připojené k PC a ovládaném softwarem 746 VA Computrace. Stanovení Zn (II) bylo prováděno metodou diferenční pulsní voltametrie s následujícími parametry: deoxygenace s argonem 90 sekund; potenciál deposice -0,8 V; čas deposice 240 sekund; startovací potenciál měření -0,8 V; konečný potenciál měření 0,15 V; pulsní amplituda 0,025 V; pulsní čas 0,04 sekundy; napěťový krok 0, V; čas napěťového kroku 0,4 sekundy; celkový objem měřící cely 2 ml. Bylo 31

32 použito standardní tříelektrodové zapojení s pracovní elektrodou HMDE, referenční elektrodou Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou platinovou elektrodou. Obr. 7: Použité přístroje pro elektrochemické stanovení Zn (II) Stanovení množství zinku po mineralizaci Stanovení zinečnatých iontů bylo provedeno na přístroji 797 VA Stand, přístroj byl připojen k 813 kompaktnímu Autosampleru (Metrohm, Švýcarsko). Analyzátor (797 VA Computrace z Metrohm, Švýcarsko) využívá tradiční tříelektrodové zapojení. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm2, referenční elektrodou byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou platinová elektroda. Následující přístroje pro automatizovanou voltametrickou analýzu je dodáván firmou Metrohm. Měnič vzorků (Metrohm 813 Kompaktní Autosampler) provádí sekvenční analýzu až 18 vzorků v plastových zkumavkách. Pro přidání standardních roztoků a činidel, byly použity dva automaty (Metrohm 765 Dosimat), zatímco pro oplach se byly použity dvě peristaltické pumpy (Metrohm 772 čerpadlo, ovládané Metrohm 731 skříňku). Diferenční pulsní voltametrické měření byla provedena na základě těchto parametrů: probublávání argonem po dobu 90 s, počáteční potenciál -1,5 V, deposice 360 S, konečný potenciál; 0,75V; pulzní amplituda 0,025V, impulzní čas 0,04 s; krok potenciál 5,035 mv, doba kroku potenciál 0,3 s,, objem vstřikovaného vzorku 100 ml, objem cely (2 ml) byl doplněn acetátovým pufrem 1900µl. 32

33 Stanovení celkových proteinů Pro stanovení celkových proteinů byl použit automatický spektrofotometr BS 400 (Mindray, China), který se skládá z kyvetového prostoru (temperovaný na 37±0,1 C), reagenčního prostoru s karuselem pro reagencie a přípravu vzorků (temperovaný na 4±1 C) a optického detektoru. Zdrojem světla je halogeno-wolframová žárovka. Přenos vzorků a reagencí zabezpečuje robotické rameno s dávkovací jehlou. Obsah kyvet je promíchán automatickým míchadlem ihned po přidání činidla nebo vzorku o objemu 2-45 µl. Kontaminace je minimalizována díky proplachování jak dávkovací jehly, tak míchadla MilliQ vodou. Pro detekci bylo možné využít vlnových délek: 340, 380, 412, 450, 505, 546, 570, 605, 660, 700, 740, 800 nm. Stanovení celkových proteinů pomocí metody Bradfordové je podrobně popsáno v publikaci [69]. Do kyvety bylo pipetováno 190 µl barviva Coomassie Briliantová modř G-250 (0,01% Coomassie Brilliantová modř G-250; 4,7% CH 3 CH 2 OH; 8,5% H 3 PO 4 ). Následně bylo napipetováno 10 µl vzorku. Vzorek byl inkubován 10 minut při 37 C. Principem je adsorpční vazba barviva Coomassie Briliantová modř G-250 na molekulu proteinu. Absorbance byla měřena při 595 nm proti roztoku činidla. Pro výpočet bylo použito hodnoty absorbance samotné reagencie a hodnoty absorbance po 10 minutové inkubaci se vzorkem Příprava vzorku pro izolaci buněk a zinkových proteinů S. aureus Kultivace bakteriální kultury S. aureus byl kultivován na třepačce (600 rpm, Incubator Hood TH 15, Edmund Buhler GmbH, Německo) při 37 C po dobu 6 hodin, dokud nebyl zákal kultivované kultury 0,1 při vlnové délce 600 nm (Specord 210, AnalytikJena, Německo). Pro izolaci buněk a zinkových proteinů S. aureus bylo odebráno 25 ml narostlé kultury a k ní bylo přidáno 100 µm ZnCl 2, takto připravený vzorek byl kultivován na třepačce (Incubator Hood TH 15, Edmund Buhler GmbH, Německo) při 600 rpm 37 C po dobu 6 hodin Automatická pipetovací stanice epmotion Pro automatickou izolaci buněk byl využit přístroj epmotion 5075 od firmy Eppendorf (Německo). Tento přístroj obsahuje příslušenství, které je kompatibilní s automatickou pipetovací stanicí; magnetický separátor (Promega), termostat (Epthermoadapter 33

34 PCR96) a Module Reservoir, kde jsou k dispozici promývací roztoky a odpad. Přenos zabezpečuje robotické rameno s pipetovacími nástavci (TS50, TS300, TS1000) a přemisťovacího gripperu (TG-T). Vzorky jsou umístěny v adaptéru Ep 0,5/1,5/2ml. Zařízení je ovládáno mikroprocesorem a editace programové sekvence byla provedena v epeditoru 4.0. Jako pracovní jednotky byly používány 96 hluboko jamkové mikrotitrační destičky (DPW). Pro přípravu vzorků byly použity dvě platformy: Thermorack pro 24 1,5 2 ml mikrozkumavek, který byl použit pro ukládání pracovních roztoků, DPW destička o objemu 1000 µl. Imunoseparace proběhla pomocí magnetické podložky (Promegacorp, USA), následně byly odseparované vzorky přepipetovány do nové DPW destičky. Takto připravené vzorky byly použity pro elektrochemické stanovení Zn (II) a pro elektroforetické stanovení zinek vázajících proteinů metodou SDS- PAGE. EpMotion umožňuje rychlé, přesné a reprodukovatelné pipetování a dávkování kapalin. Používá se pro purifikační procesy a přípravu vzorků, bez chyb způsobených lidským faktorem. Pipetování je možné do různých formátů zkumavek a destiček např. 96 jamek, 384 jamek a další. Zaleží pouze na vlastním nastavení uživatele. Přenos může probíhat ze zkumavek do destiček mikrozkumavek a obráceně. Lze provádět přenos i ze zkumavek do destiček o stejné velikosti. Ředění nebo promíchání se může nastavit pomocí softwaru. Objemy lze nastavit od (1) 2 µl do 1000 µl (pipetováním a dávkováním). Pipetování a dávkování probíhá bez kontaktu s povrchem. Výška hladiny se snímá opticky. Umožňuje bezkontaktní rozeznávání hladiny kapalin v různých jamkách. Jedná se o čistší proces oproti manuálnímu použití a šetří drahé vodivé špičky. Rozeznává nejen výměnné hlavice, ale i jednotlivé formáty zkumavek, držáky reagencií a držáky vzorků. Programy je možno uložit a přenášet pomocí Multi- Media Card (MMC). Automatická pipetovací stanice je ukázána na obrázku 8. 34

35 Obr. 8: Automatická pipetovací stanice epmotion Stanovení množství metalothioneinu v izolovaných buňkách S. aureus Získané buňky byly třikrát promyty fosfátovým pufrem o ph 7 a následně byly zváženy (přibližně 0,2 g čerstvé váhy). Buňky byly převedeny do 2 ml zkumavky (Eppendorf), ke kterým byl přidán tekutý dusík. Takto připravený vzorek byl zpracován pomocí ručního homogenizátoru ultra-t8 TURRAX (IKA) při otáčkách po dobu 3 min. Homogenát byla převeden do nové zkumavky a vortexován 15 minut při 4 C (Vortex Genie). Supernatant byl následně ohřát a teplota vzorků byla udržována při 99 C v thermomixeru (Eppendorf, Hamburg, Německo) po dobu 15 min. za občasného promíchání a pak následného ochlazení na 4 C. Denaturované homogenní vzorky byly odstředěny při 4 C, otáček za minutu po dobu 30 min. (Eppendorf 5402). Tepelné zpracování účinně denaturuje a odstraní proteiny o vysoké molekulové hmotnosti [70]. Pro analýzu zpracovaných vzorků byla použita diferenční pulzní voltametrie Brdičkova reakce. DPV byla provedena na přístroji 747 VA Stand připojeného na 746 VA Trace Analyzer a 695 autosampleru (Metrohm, Zofingen, Švýcarsko), pomocí tradičního tříelektrodového zapojení s chlazeným zásobníkem vzorek (4 C) dle Fabrik a spol. [71]. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm2, referenční elektrodou byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou platinová elektroda. Následující přístroje pro automatizovanou voltametrickou analýzu je dodáván firmou Metrohm. 35

36 Detekce zinek vázajících proteinů pomocí SDS-PAGE elektroforézy Izolované proteiny byly detekovány pomocí SDS-PAGE elektroforézy. Elektroforéza byla provedena na aparatuře Mini Protean Tetra s gelem o rozměrech 8,3 x 7,3 cm (BioRad, USA). Koncentrace dělícího pufru byla 15 % (m/v) a koncentrace zaostřovacího gelu byla 5 % (m/v). Gely byly připraveny z 30% (m/v) zásobního roztoku akrylamidu a 1% (m/v) bisakrylamidu. Polymerace gelů probíhala při pokojové teplotě po dobu 45 minut (dělící gel) nebo 30 minut (zaostřovací gel). Před analýzou byly vzorky smíchány s nanášecím pufrem 2:1 a inkubovány při 93 C po dobu 3 minut. Pro stanovení molekulové hmotnosti byl použit standard Precision plus protein standards (Biorad, USA). Elektroforéza probíhala při 150 V podobu jedné hodiny při teplotě 23 C (PowerBasicBiorad, USA) v Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-propan-1,3- diol) - glycinovém separačním pufru (0,025 M Trizma-base, 0,19 M glycin a 3,5 mm SDS, ph = 8,3). Poté byly gely obarveny barvivem Coomassie briliantová modř [72], a následně stříbrem [73] s vynecháním fixačního kroku (1,1% (v/v) - kyselina octová, 6,4% (v/v) methanol a 0,37% (v/v) formaldehydu) a následujících dvou promývacích kroků (50% (v/v) methanol) Ověření izolace zinek vázajících proteinů metodou Western-blotting Po elektroforetické separaci byly proteiny přeneseny na polyvinyldifluoridovou (PVDF) membránu (Biometra Fast blot, Biometra, Německo). PVDF membrána byla aktivována namočením v methanolu po dobu 30 s. Dále byla membrána vložena na pět minut do vyrovnávacího pufru (12,5 mm Tris-base, 75 mm glycin a 15% (v/v) methanolu). Blotovací sendvič byl složen ze tří vrstev filtračního papíru namočeného v blotovacím pufru, z membrány, polyakrylamidového gelu a dalších tří vrstev nasáklého filtračního papíru. Blotování probíhalo 1 hodinu při konstantním proudu 0,9 ma na 1 cm 2 membrány. Po přeblotování byla membrána blokována v 1% BSA v PBS (137 mm NaCl, KCl 2,7 mm, 1,4 mm NaH 2 PO 4 a 4,3mM Na 2 HPO 4, ph 7,4) po dobu 30 min. Poté byla membrána 60 minut při 23 C inkubována se sekundární protilátkou (králičí proti slepičím imunoglobulinům značená křenovou peroxidázou v ředění 1:6000 (SigmaAldrich, USA) při teplotě 23 C. Následně byla membrána třikrát promyta fosfátovým pufrem tween 20 (PBS-T) a 5 minut inkubována s chromogenním substrátem (0,4 mg/ml 3-36

37 aminoethyl-9-karbazolového (AEC) pufru v 0,5 M acetátovém s 0,1% H 2 O 2, ph 5,5), reakce byla ukončena oplachem vodou Stanovení množství Zn (II) v izolovaných proteinech Před stanovením Zn (II) byly vzorky zmineralizovány. Mineralizace probíhala v Microwave Anton Paar se zvoleným programem po dobu 50 minut (10 minut 50W, 30minut 100W, 10 minut 0W). Vzorek (15µl) byl umístěn do MG5 skleněných lahviček, k vzorku bylo přidáno 150µl peroxidu vodíku (30% w/w) a 350µl kyseliny dusičné (65% w/w). Připravené vzorky byly uzavřeny a umístěny do 64MG5 rotoru (AntonPaar-GmbH). Rotor se vzorky byl vložen do systému a mineralizace byla provedena při následujících podmínkách: výkon 50W po dobu 10 minut, výkon 100W po dobu 30 minut, výkon 0 (chlazení) po dobu 10 minut. Bylo dosaženo maximální teploty 80 C. Příprava vzorků pro následné elektrochemické měření byla následující: 100µl mineralizovaného vzorku bylo napipetováno do zkumavek Eppendorf s 900 µl 0,2 M acetátovým pufrem (ph 5). Slepý vzorek byl připraven stejným způsobem. Samotné stanovení množství Zn (II) bylo provedeno na přístroji 797 VA Stand, přístroj byl připojen k 813 kompaktnímu Autosampleru (Metrohm, Švýcarsko). Analyzátor (797 VA Computrace z Metrohm, Švýcarsko) využívá tradiční tříelektrodové zapojení. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm 2, referenční elektrodou byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou platinová elektroda. Následující přístroje pro automatizovanou voltametrickou analýzu je dodáván firmou Metrohm Mikroskopování MPs a buněk S. aureus Příprava vzorku pro mikroskopování Pro fixaci vzorku bylo zvoleno metody spočívající v zachycení vzorku na podložní fólii, keramický filtr o zrnitosti 0,25 mikronu a čistého preparátu křemíku. Pro dokumentaci vzorků S. aureus byl použit skenovací elektronový mikroskop s optikou FEG-SEM Tescan MIRA 3 XMU (Tescan, USA). Tento model je vybaven vysoce svítícími diodami Schottky (Advanced semiconductor, USA), Everhart- Thronleyovým detektorem, vysokorychlostním scintilátorem YAG s BSE detektorem (Tescan, USA). Bakterie byly přefiltrovány přes injekční filtry (0,45 a 0,2 µm) 37

38 a promyty ve dvou krocích etanolem (70%, 100%). Sledované vzorky byly následně pokovány 5 nm zlata, byla použita vakuová naprašovačka Emitech K950X (Quorum Technologies, Velká Británie). 38

39 5 VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 Růst bakteriální kultury v přítomnosti Zn (II) Narostlá bakteriální kultura S. aureus byla dána do osmi 100 ml Erlenmeyerových baněk ke kterým bylo přidáno 0, 1,5, 5, 10, 25, 50, 100, 250 μm Zn (II) (ZnCl 2, ZnSO 4, Zn(NO 3 ) 2 ). Roztok byl promíchán a napipetován do plastových kyvet (AnalytikJena, Německo) o objemu 3 ml. Následně byla na spektrofotometru (SPECORD 210, AnalytikJena, Německo) v 30 minutových intervalech po dobu 12 hodin měřena absorbance při vlnové délce λ=600 nm. Kyvetový systém byl zahříván pomocí termostatu na teplotu 37 C (F12/ED Julabo, Německo). Všechna měření byla v pěti opakováních. V přítomnosti Zn(NO 3 ) 2 a ZnCl 2 buňky S. aureus rostly se zjevným rozdílem mezi přidanými koncentracemi oproti buňkám kultivovaným v přítomnosti ZnSO 4 (obr. 9). U vzorků s aplikací Zn(NO 3 ) 2 byl růst u jednotlivých variant vůči variantě kontrolní inhibován: u koncentrace 1,5 μm o 10 %; 5 μm o 21 %; 10 μm o 24 %; 25 μm o 32 %; 50 μm o 33 %; 100 μm o 44 %; 250 μm o 88 %. U vzorků s aplikací ZnCl 2 byl růst u jednotlivých variant vůči variantě kontrolní inhibován: u koncentrace 1,5 μm o 16 %; 5 μm o 20 %; 10 μm o 27 %; 25 μm o 46 %; 50 μm o 33 %; 100 μm o 44 %; 250 μm o 88 %. Vzorky s aplikací Zn(NO 3 ) 2 vykazovaly po aplikaci Zn (II) vysokou inhibici již u nízkých koncentrací (obr. 9). Růst u varianty ZnSO 4 byl inhibován: u koncentrace 1,5 μm o 63 %; 5 μm o 68 %; 10 μm o 70 %; 25 μm o 71 %; 50 μm o 74 %; 100 μm o 74 %; 250 μm o 74 %. Zde nebyl markantní rozdíl mezi přidanými koncentracemi, což je způsobeno tím, že v mikrobiální buňce nefunguji stejné transportní systémy, a některé tyto systémy jsou specifické pro zinek a jiné mohou fungovat jak pro zinek, tak pro jiné kovy [31,74]. Ze získaných experimentálních dat u varianty Zn(NO 3 ) 2 jednoznačně vyplývá, že použitá bakteriální kultura je značně citlivá již k nízké aplikované koncentraci. 39

40 Obr. 9: Růstové křivky S. aureus po aplikaci Zn (II) ve formě A: Zn(NO 3 ) 2, B: ZnSO 4, C: ZnCl 2 o koncentracích (0; 1,5; 5; 10; 25; 50; 100; 250 μm). Měřeno po dobu 12 hodin v 30 minutových intervalech při 37 C. 5.2 Elektrochemické stanovení Zn (II) v buňkách S. aureus Obsah zinku v buňce musí být regulován, protože u S. aureus jsou zinek-vazebná místa ve velkém přebytku. Zinek je tedy v mikroorganismech v přebytku i v běžném prostředí. Práce Hankeho [75] naznačila, že specifičnost vazby zinečnatých iontů může být spojena se zinek obsahujícími bílkovinami. Regulace buněčné homeostázy je tak usměrňována různými buněčnými mechanismy, které zabraňují nadměrnému příjmu zinku [74]. Je nutné, aby mikroorganismy byly schopny tyto ionty přijímat pomocí různých transportních systémů. V bakteriálních buňkách může být jeden prvek přenášen několika typy přenašečů, stejně tak jeden přenašeč může transportovat více typů kovových iontů [57]. V této části experimentu jsme se zaměřili na studium akumulace tří chemicky rozdílných sloučenin obsahující zinečnaté ionty ve sledované bakteriální kultuře. Byl sledován obsah zinku v supernatantu médiu, kde se mikroorganismy kultivovaly a obsah zinku v mikroorganismu. Jednak obsah zinku volného a obsah zinku celkového. Celkový zinek v buňkách je možné rozdělit na volný a vázaný. Volný zinek je obsažen 40

41 v nízkomolekulárních sloučeninách jako jsou thiolové sloučeniny nebo kofaktory enzymů. Vázaný zinek je navázán na vysokomolekulární sloučeniny, především na bílkoviny ale také na DNA nebo polysacharidy [76]. U variant s aplikací síranu zinečnatého, zvýšený příjem zinečnatých iontů do buněk až do koncentrace 50 μm neprobíhal, příjem byl zaznamenán až u koncentrací 100 μm (7,95 μm u volného zinku, 13,39 μm u celkového) a 250 μm (11,53 μm u volného zinku, 20,72 μm u celkového) (tab. 3, obr. 10B). Příjem celkových iontů Zn (II) byl u nejvyšší varianty vůči kontrolní zvýšen o 162 %. Tab. 3: Hodnoty obsahu zinečnatých iontů aplikovaných v bakteriální kultuře ve formě ZnSO 4. Aplikované množství Volný zinek Supernatant Celkový zinek ZnSO 4 0 μm 4,28 1,23 7,92 1,5 μm 4,45 1,21 6,96 5 μm 5,82 10,45 7,60 10 μm 5,09 12,99 7,35 25 μm 4,70 14,50 7,17 50 μm 4,24 19,20 7, μm 7,95 106,43 13, μm 11,53 144,40 20,72 U aplikace chloridu zinečnatého 2 se hodnoty obsahu volného zinku v mikroorganismu výrazně nezvyšovaly (tab. 4, obr. 10C). Po mineralizaci byl zaznamenán zvyšující se obsah celkového zinku od koncentrace 10 μm do koncentrace 50 μm. U skupin s aplikací 100 a 250 μm se obsah vázaného zinku snižoval (tab. 4, obr. 10C). Příjem celkových iontů Zn (II) byl u nejvyšší varianty vůči kontrolní zvýšen o 48 %, u varianty s aplikací 50 μm, kde byl příjem nejvyšší, zvýšen o 145 %. Tab. 4: Hodnoty obsahu zinečnatých iontů aplikovaných v bakteriální kultuře ve formě ZnCl 2. Aplikované množství Volný zinek Supernatant Celkový zinek ZnCl 2 0 μm 4,81 1,04 7,19 1,5 μm 5,16 1,92 7,26 41

42 5 μm 5,06 2,39 7,12 10 μm 6,60 12,43 8,70 25 μm 6,78 17,88 13,50 50 μm 7,21 33,73 17, μm 6,56 116,46 15, μm 6,22 166,06 10,69 U variant s aplikací dusičnanu zinečnatého byl průkazný příjem zaznamenán už při aplikaci 5 μm (o 17 % vůči kontrolní variantě), u mineralizovaných vzorků až koncentrace 25 μm (o 26 % vůči kontrolní variantě) (tab 5, obr. 10A). Příjem Zn (II) byl u nejvyšší varianty vůči kontrolní zvýšen o 411 %. Tab. 5: Hodnoty obsahu zinečnatých iontů aplikovaných v bakteriální kultuře ve formě Zn(NO 3 ) 2. Aplikované množství Volný zinek Supernatant Vázaný zinek Zn(NO 3 ) 2 0 μm 3,79 1,54 8,85 1,5 μm 3,87 1,93 7,89 5 μm 4,45 3,71 7,49 10 μm 5,14 12,08 8,79 25 μm 6,00 26,58 11,15 50 μm 6,30 37,51 13, μm 9,56 108,08 14, μm 41,22 138,96 45,25 Zjistili jsme, že zinečnaté ionty byly nejlépe přijímány u buněčné kultury, kde byla aplikována forma Zn(NO 3 ) 2 (tab. 5, obr. 10A). U nejvyšší aplikované varianty 250 μm byl obsah zinečnatých iontů u této varianty vyšší vůči variantě se ZnCl 2 o 94 %, u varianty s aplikací ZnSO 4 byl obsah zvýšen o 423 %. Množství zinku v supernatantu se zvyšovalo úměrně s aplikovanou dávkou zinečnatých iontů u všech tří forem (tab. 5, obr. 10). Nejnižší příjem zinku byl zaznamenán v případě aplikace ZnCl 2. Změny v příjmu zinku lze vysvětlit toxickým vlivem aniontu. Jak NO 3 -, tak SO 4 2- mohou ovlivnit membránové transportní systémy. Je známo, že S. aureus je halofil, je schopen tolerovat koncentrace NaCl více než 10 g/l. Přídavek 250 µm ZnCl 2 ovlivnil koncentraci NaCl v médiu o 0,4 %, což je zanedbatelné. V případě ZnCl 2 na rozdíl od ostatních solí je tedy možno pozorované změny připsat působení Zn (II). 42

43 Obr. 10: Detekce Zn (II) v supernatantu, v nemineralizovaném a mineralizovaném vzorku mikroorganismů po přídavku A: ZnCl 2, B: ZnSO 4, C: Zn(NO 3 ) 2 o koncentracích (0; 1,5; 5; 10; 25; 50; 100; 250 μm). 5.3 Magnetická separace bakteriálních buněk Automatizovaná magnetická separace bakteriálních buněk Naším experimentálním cílem bylo navrhnout metodický postup pro izolaci bakteriálních buněk a jejich zinek obsahujících proteinů. Abychom zvýšili množství izolovaných zinek obsahujících proteinů, tak byla buněčná kultura S. aureus vystavena působení koncentraci 100 µm ZnCl 2. Experimentální podmínky byly vybrány na základě experimentů popsaných v předchozí kapitole. Použitá koncentrace zinečnatých iontů vyvolala růstovou depresi o 20 % v porovnání s kontrolní variantou. Pro tuto experimentální část byla použita kontrolní varianta, kultura bez aplikace zinečnatých iontů. Byla navržena následující pracovní sekvence, která byla rozdělena do tří fází (obr. 11, 12 a 13). Kroky fáze I (obr. 11): 1) pipetování MPs - modifikované protilátkou (IgG) proti S. aureus (10 μl) do mikrotitrační destičky 2) promytí částic PBS (ph = 7,5) 43

44 3) napipetování bakteriální kultury (S. aureus) 4) inkubace S. aureus s MPs značenými protilátkami (IgG) proti S. aureus 5) promytí částic s navázanými bakteriemi S. aureus 6) kultivace 3 hodiny Obr. 11: Izolace buněk S. aureus přes protein A na paramagnetické částice modifikované IgG Kroky fáze II (obr.12): 1) rozbití S. aureus zachyceného na povrch MPs pomocí ultrazvuku ( t= 2 min, 450 Hz) 2) přepipetování obsahu jamek mikrotitrační destičky do zkumavek Obr. 12: Vznik bakteriálního lyzátu z izolovaných buněk S. aureus za použití ultrazvuku Kroky fáze III (obr. 13): 1) pipetování MPs - modifikované protilátkou (IgY) proti Zn proteinům (10 μl) 2) promytí částic PBS (ph = 7,5) 3) pipetování vzorku z bloku B (100 μl) 4) promytí částic s navázaným Zn roztokem PBS (ph = 7,5) 5) uvolnění Zn proteinů z protilátek - 0,1M citrátový pufr (ph = 2,5) 44

45 Obr. 13: Izolace zinek vázajících proteinů z bakteriálního lyzátu S. aureus Ověření imobilizace protilátek na paramagnetické částice Před použitím paramagnetických částic (MPs) pro izolaci buněk S. aureus a jejich zinečnatých proteinů, bylo třeba ověřit správnost imobilizace protilátek. Imobilizace protilátek byla testována dvěma způsoby, MPs s lidským IgG byly testovány experimentálně imunoextrakcí z bakteriální kultury s přídavkem 100 µm ZnCl 2 a následně byly kultivovány na mikrodestičce o celkovém objemu 250 µl. Imunoextrakce byla provedena na programovatelném rotačním disku (Biosan, Litva) v 2 ml mikrozkumavkách pro dobu 1 hodiny při teplotě 23 C. Poté byly MPs odseparovány, promyty 250 µl živného média a napipetovány do 250 µl živného média na mikrodestičku (Nunc, Germany). Dále bylo do další jamky na mikrodestičce napipetováno 250 µl samotné bakteriální kultury S. aureus a 250 µl bakteriální kultury S. aureus s přídavkem 100 µm ZnCl 2 po odseparování MPs. Destička byla vložena do spektrofotometru Multiscan Ex (Thermo Electron Corporation, USA), kde byla termostatována při 37 C a třepána 600 rpm. Absorbance byla měřena v 30 minutových intervalech po dobu 12 hodin. Pro izolaci bylo použito 5 mg/ml MPs na 500 µl bakteriální kultury. Zjistili jsme, že bakterie je možné tímto způsobem separovat z média a dále kultivovat (obr. 14A). Ověření imobilizace slepičích protilátek, bylo provedeno pomocí sekundární protilátky (králičí proti slepičímu Ig konjugovanou s křenovou peroxidázou (HRP). Sekundární protilátka byla inkubována s MPs, poté byly MPs odseparovány, promyty a byl k nim přidán chromogenní substrát tetramethylbenzidin (TMB) s H 2 O 2. Po vzniku modrého zabarvení, byly MPs odeseparovány a reakce byla zastavena kyselinou sírovou a byla měřena absorbance při 450 nm (MultiscanEx, Thermo Electron Corporation, USA). Jako kontrola byly použity králičí Ig proti myším Ig konjugované s HRP. Bylo zjištěno, že se protilátky proti slepičím imnuoglobulinům navázaly, zatímco protilátky proti myším imunoglobulinům nebyly navázány (obr. 14B). Tento pokus nám potvrdil, že se podařilo modifikovat MPs slepičími protilátkami proti Zn. 45

46 Obr. 14: Ověření imobilizace specifických protilátek na paramagnetické částice A:Funkčnost IgG na MPs byla ověřena experimentálně imunoextrakcí z bakteriální kultury s přídavkem 100 µm ZnCl 2 a následně byly kultivovány na mikrodestičce o celkovém objemu 250 µl a byla měřena absorbance v 30 minutových intervalech po dobu 12 hodin a to ve 4 jamkách - samotná mikrobiální kultura (S. aureus), MPs po kultivaci s bakteriální kulturou (S.aureus + MPs) a nenavázané buňky S. aureus na (retentát) po kultivaci MPs s bakteriální kulturou (S. aureus po odseparování MPs), samotné paramagnetické částice (MPs) B: Funkčnost MPs s anti ZnIgY byla ověřena pomocí konjugátu králičí protilátky proti slepičím imunoglobulinům s křenovou peroxidázou. Měřeno při vlnové délce 450 nm Magnetická separace bakteriálních buněk Pro imunoextrakci bakteriálních buněk S. aureus z média byly použity MPs s lidským IgG. Imunoextrakce byla provedena na programovatelném rotačním disku (Biosan, Litva) v 2 ml mikrozkumavkách pro dobu 1 hodiny při teplotě 23 C. Poté byly MPs odseparovány, promyty 250 µl živného média a napipetovány do 250 µl živného média na mikrodestičku (Nunc, Germany). Dále bylo do další jamky na mikrodestičce napipetováno 250 µl samotné bakteriální kultury S. aureus a 250 µl bakteriální kultury S. aureus s přídavkem 100 µm ZnCl 2 po odseparování MPs. Destička byla vložena do spektrofotometru, kde byla termostatována při 37 C a třepána 600 rpm. Absorbance byla měřena v 30 minutových intervalech po dobu 12 hodin. Pro izolaci bylo použito 5 mg/ml MPs na 500 µl bakteriální kultury. Zjistili jsme velmi dobrou interakci 46

47 bakteriálních buněk s použitými MPs. Uvedeným postupem bylo možné zachytit 10 4 buněk s experimentální chybou 10%. Navržený manuální postup byl následně přenesen na automatický robotický system. MPs IgG (10 μl) byly napipetovány robotem do 8 jamek destičky, kde byly dvakrát promyty kultivačním médiem (300 μl). Následovalo napipetování různého množství (0, 1, 10, 25, 100, 200, 300 a 400 µl) bakteriální kultury S. aureus s přídavkem ZnCl 2 a doplněné na celkový objem 500 µl živným médiem. V jednotlivých variantách, díky naředění médiem bylo 0; 0,1; 0,8; 8,0; 17,0; 34,0; 50,0 a 67, buněk. Následoval přenos destičky na termostatovanou pozici kde probíhala inkubace vzorků při 37 C 1 hodinu - po dobu inkubace se vzorky 1krát za 15 minut velmi pomalu promíchaly, dále se 4 krát promyly kultivačním médiem (750 μl). Po tomto kroku byly na paramagnetické částice navázány buňky S. aureus. Supernatant byl odpipetován a bylo přidáno 500 μl živného média. Následovala kultivace (na termostatované pozici robota) po dobu 3 hodin při 37 C a byla proměřena intenzita zákalu média. Byla pozorována velmi dobrá opakovatelnost experimentu s maximální chybou 5,5 %. Využití robotické pipetovací stanice výrazně snížilo další chyby způsobené obsluhou a bylo tak možné zachytit méně jako 100 buněk s experimentální chybou 4,3 % (n = 5). Izolace S. aureus na MPs byla potvrzena růstovými křivkami (obr. 11A), kde byl sledován růst mikroorganismů navázaných na MPs v čase 12 hodin. Ve všech sledovaných případech byl zaznamenán růst bakteriální kultury, tento postup byl pětkrát opakován. Bylo potvrzeno, že touto metodou je možné izolovat méně jak 100 bakterií S. aureus z objemu vzorku 500 μl. Navázání mikroorganismů na MPs bylo potvrzeno také mikroskopicky (obr. 16), kdy byla sledována kultura před imunoseparací (obr. 16A), samotné MPs (obr. 16B) a kultura uchycená na MPs (obr. 16C). 47

48 Obr. 15: Navázání S. aureus na MPs bylo potvrzeno růstovými křivkami mikroorganismu. A: Růstové křivky byly měřeny v osmi různých koncentracích, tyto koncentrace byly vztaženy na počet buněk S. aureus. B: Lineární závislost absorbance na počtu buněk S. aureus Mikroskopování S. aureus Pro pozorování a fotodokumentaci vzorků bakterie S. aureus byla použita metoda odražených elektronů na přístroji FEG-SEM Tescan MIRA 3 XMU (Tescan, USA). Tento model skenovacího elektronového mikroskopu (SEM) je vybaven nejmodernějšími detektory a snímači obrazu s nízkou hladinou hluku při rychlém skenování. SEM byl vybaven detektorem SE typu Everhart-Thronley, vysokorychlostními scintilátory YAG na BSE detektoru, detektorem panchromatické katodové luminiscence (CL) a EDX spektrometrem. Vzorky byly potaženy 3 a 5 nm uhlíku, aby se zabránilo nabíjení vzorku. Byly testovány různé podmínky pro pořízení citlivého fotozáznamu s maximálním možným zvětšením, tak aby bylo dosaženo buď minimálního, nebo maximálního kontrastu bakteriálního materiálu oproti částicím, na něž jsou navázány. Záznam probíhal při urychlovacím napětím 5, 10, 15 a 25 kv a proudech o 1-5 na. Za všech výše zmíněných podmínek byly získány uspokojivé výsledky (obr. 16). 48

49 Obr. 16: Fotografie ze skenovacího elektronového mikroskopu A: S. aureus, B: paramagnetické částice, C: S. aureus navázaný na paramagnetické částice Stanovení koncentrace metalothioneinu a Zn (II) v izolovaných buňkách S. aureus Ve všech pokusných skupinách, byl obsah metalothioneinu vyjádřený jako ng na mg proteinů a zvyšuje se s rostoucí koncentrací iontů Zn (II) v bakteriální kultuře. Průměrné zvýšení obsahu MT bylo 1,44 krát v rozmezí od 1,5 do 25 µm ZnCl 2. Při vyšších koncentracích ZnCl 2 50, 100 a 250 µm, byl nárůst 2,7; 3,5 a 5-násobně vyšší (obr. 2B). To znamená, že bakterie syntetizovaly metalothionein jako ochranné látky proti Zn (II). Role metalothioneinu v bakteriální rezistence k zinku a jiných těžkých kovů byla přezkoumána a zveřejněna dříve [77,78] a Brdičkova reakce byla úspěšně využita pro stanovení metalothioneinu u stafylokoků vystavených CdCl 2 [79]. Cekový obsah Zn (II) v buňkách je možné rozdělit na volný a vázaný. Obsah volného zinku z celkového obsahu bílkovin byl konstantní při přídavku ZnCl 2 v koncentracích nižších než 50 µm, při přídavku 100 a 250 µm ZnCl 2, se zinek 3,6 a 9-násobně zvýšil (obr. 17B). Obsah vázaného zinku z celkového obsahu bílkovin při přídavku ZnCl 2 v koncentraci nižší než 10 µm se mírně snížil ve srovnání s kontrolou. Při přídavku 25 a 50 µm ZnCl 2 obsah vázaného Zn (II) byl srovnatelný s kontrolou, ale u přídavků 100 a 250 µm ZnCl 2 bylo pozorováno 3,2 a 8,7-násobné zvýšení. Koncentrace Zn (II) v médiu, vyjádřeného na mg proteinů, byla konstantní při koncentracích nižších než 50 μm ZnCl 2 (obr. 17B). U 50 µm koncentrace ZnCl 2 byl obsah Zn (II) v médiu 12-násobné zvýšen a u přídavků 100 a 250 μm ZnCl 2 bylo zvýšení Zn (II) v médiu a násobné (obr. 17B). Získané výsledky naznačují, že bakterie byly schopné odolat koncentracím menším než 50 µm ZnCl 2 a to aktivací Zn (II) transportních mechanismů nebo syntézou ochranné sloučeniny. Na základě předchozích údajů, bylo zjištěno, 49

50 že příjem ZnCl 2 v koncentracích vyšších než 25 μm, nebyl regulován vzhledem k velikému rozdílu v extracelulárních a intracelulárních koncentracích Zn (II). Toto bylo částečně vyváženo syntézou MT, ale v koncentraci vyšší než 50 ZnCl 2 µm bakterie nemohly regulovat příjem Zn (II). To je v souladu s růstovými křivkami, kde došlo k výraznému zpomalení růstu bakterií u přídavků Zn (II) nad 50 μm. Ve srovnání s dříve publikovanými články, naše výsledky prokázaly nižší minimální inhibiční koncentraci (MIC). Aarestrup a Hasman uvádějí MIC od 0,25 do 2 mm ZnCl 2 [20], naše výsledky stanovily MIC pro 50 μm a více. Tento rozdíl může být způsoben omezenou rozpustností vyšších koncentrací ZnCl 2 v pevných agarových deskách. Obr. 17: Množství Zn (II) v bakteriálních buňkách S. aureus izolovaných pomocí MPs, množství Zn (II) v médiu a množství MT v bakteriálních buňkách. Vše vztaženo na mg celkových proteinů Magnetická separace bakteriálních proteinů obsahujících zinek Zachycení zinek obsahujících proteinů bylo uskutečněno MPs se slepičími protilátkami. Použitá modifikace umožnila zachycení subnanomolárních koncentrací zinek 50

51 obsahujících albuminu s chybou 5 %. Metodika byla využita pro imunoseparaci zinek obsahujících proteinů z bakteriálních buněk: 270, 200, 130, 70, 30, 3, 0, V průběhu automatické analýzy byla destička vyjmuta a buňky S. aureus navázané na MPs byly pomocí ultrazvukové jehly (t = 2 min, 450 Hz) rozbity. Poté byl vzniklý lyzát přepipetován robotem do čistých pozic v destičce (obr. 1B). Následně byly MPs s anti-znigy (10 μl) transportovány do destičky a promyty PBS (ph=4,5; 300 μl). Byl k nim napipetován lyzát S. aureus (90 μl), proběhla inkubace vzorků při 25 C po dobu 30 minut. Následovalo promytí PBS (ph=7,4; 700 μl) a dále třikrát citrátem (0,1M, ph=2,5, 50 μl), kdy došlo k uvolnění zinkových proteinů. Vzorky byly následně použity pro stanovení zinečnatých iontů a zinkových proteinů na SDS PAGE Stanovení proteinů obsahujících zinek Proteiny obsahující zinek byly studovány pomocí SDS - PAGE elektroforézy. Množství proteinů bylo závislé na ředění bakteriální kultury (67; 50; 34; 17; 8; 0,8; 0,1; ). Ve vzorcích byly přítomny proteiny o molekulových hmotnostech přibližně 70, 60, 45, 30, 25 a méně než 10 kda (obr. 18). Molekulová hmotnost nejintenzivnějších proužků (70, 45 a 25 kda) koresponduje s molekulovou hmotností podjednotek imunoglobulinů (velká podjednotka, Fab fragment a malá podjednotka), které se do extraktu uvolňují v procesu ultrazvukové homogenizace. Proteiny o velikosti 25 kda představují skupinu proteinů specificky vázajících ionty těžkých kovů (metalothioneiny) viz obr. 18. V získaných extraktech byl MT potvrzen a jeho množství mezi kontrolní variantou a variantou ovlivněnou zinečnatými ionty vzrostl o více jako 250 %. 51

52 Obr. 18: Detekované zinek vázající proteiny závislé na ředění bakteriální kultury (67; 50; 34; 17; 8; 0,8; 0,1; ) Ověření izolace zinek vázajících proteinů metodou Western-blotting SDS-PAGE bakteriálního lyzátu po imunoseparaci je uveden na obr. 19C. Z výsledků vyplývá, že některé proteiny byly odstraněny navázány na MPs, zatímco některé proteiny se nenavázaly. Což je způsobeno omezenou kapacitou povrchu MPs a množstvím navázaných protilátek (obr. 19A, C). Proteiny byly uvolněny 0,1 M citrátem o ph 2,5. Zdrojem proteinů v eluátu mohou být bakteriální proteiny, nebo také části slepičích protilátek uvolněné z povrchu MPs. Přítomnost části slepičích protilátek byla testována metodou Western-blotting. Po elektroforetické separaci byly proteiny přeneseny na polyvinyldifluoridovou (PVDF) membránu (Biometra Fast blot, Biometra, Německo). PVDF membrána byla aktivována namočením v methanolu po dobu 30 s. Dále byla membrána vložena na pět minut do vyrovnávacího pufru (12,5 mm Tris-base, 75 mm glycin a 15% (v/v) methanolu). Blotovací sendvič byl složen ze tří vrstev filtračního papíru namočeného v blotovacím pufru, z membrány, polyakrylamidového gelu a dalších tří vrstev nasáklého filtračního papíru. Blotování probíhalo 1 hodinu při konstantním proudu 0,9 ma na 1 cm 2 membrány. Po přeblotování byla membrána blokována v 1% BSA v PBS (137 mm NaCl, KCl 2,7 mm, 1,4 mm NaH 2 PO 4 a 4,3mM Na 2 HPO 4, ph 7,4) po dobu 30 min. Poté byla membrána 60 minut při 23 C inkubována se sekundární protilátkou 52

53 (králičí proti slepičím imunoglobulinům značená křenovou peroxidázou v ředění 1:6000 (SigmaAldrich, USA) při teplotě 23 C. Následně byla membrána třikrát promyta fosfátovým pufrem tween 20 (PBS-T) a 5 minut inkubována s chromogenním substrátem (0,4 mg/ml 3-aminoethyl-9-karbazolového pufru v 0,5 M acetátovém s 0,1% H 2 O 2, ph 5,5), reakce byla ukončena oplachem vodou. Výsledkem nám jsou tři bandy, které korespondují svojí velikostí s lehkým a těžkým řetězcem (70 a 25 kda) a také s Fab-fragmentem (50 kda). Žádné jiné proužky nebyly detekovány (u eluátu pro buněk, byl přítomen nepatrný band o velikosti 60 kda. Tato molekulová hmotnost odpovídá proteinu A (obr. 19B). Obr. 19: Ověření funkčnosti izolace pomocí MPs. A: Bakteriální lyzát (lyzát) před imunomagnetickou separací z něhož se zinek vázající proteiny navázaly na MPs (eluát) 53

54 a část se na MPs nenavázala z důvodů omezené kapacity (retentát). B: PVDF membrána se zobrazenými podjednotkami slepičích Ig a Fab fragmentem, C: SDS PAGE pro lyzát a retentát proteinů vázajících zinek po imunomagnetické separace bakteriální kultury S. aureus Elektrochemické stanovení zinku v izolovaných zinek vázajících proteinech Množství zinečnatých iontů v proteinech obsahujících zinek bylo potvrzeno jeho stanovením elektrochemicky technikou diferenční pulzní voltametrie. Pro vlastní analýzu zinečnatých iontů byla provedena optimalizace detekce Optimalizace stanovení zinku Nejdříve bylo optimalizováno množství aplikovaného vzorku (buněčného lyzátu). Malé množství aplikovaného biologického vzorku (10-30 µl) poskytovalo dobře definované signály zinečnatých iontů (Ep = 1,04 V), ale relativní chyba stanovení se pohybovala mezi 9 12 %. (n = 6). Aplikace mezi 50 až 100 µl vzorku bylo výhodné. Získané voltamogramy byly velmi dobře reprodukovatelné (RSD 4 6 %). Vyšší množství aplikovaného vzorku již vedlo ke zhoršení detekce zinečnatých iontů (především u mineralizátů, změna ph) a iontové síly pufrovacího základního elektrolytu. V experimentu bylo tedy dále používáno 100 µl vzorku, který byl napipetován do mikrozkumavky společně s 900 µl acetátového pufru (ph = 5). Mikrozkumavky s takto připraveným vzorkem byly umístěny do autosampleru. Měření bylo prováděno metodou diferenční pulzní voltametrie s následujícími parametry: deoxygenace argonem 120 sekund; potenciál deposice -1,2 V; čas deposice 240 sekund; startovací potenciál měření -1,2 V; konečný potenciál měření -0,5 V; pulsní amplituda 0,025 V; pulsní čas 0,04 sekundy; napěťový krok 0, V; čas napěťového kroku 0,4 sekundy; celkový objem měřící cely 2 ml. Tab. 6: Množství Zn (II) v izolovaných buňkách S. aureus Množství mikroorganismů ( 10 3 ) 67,0 50,0 34,0 17,0 8,0 0,8 0,1 0 Koncentrace Zn (II) v kultuře (μg ml -1 ) 2,22 1,21 0,51 0,19 0,13 0,08 0,

55 Bylo zjištěno, že množství zinku se zvyšuje se vzrůstajícím počtem buněk a reflektuje tak obsažené zinkové proteiny (tab. 6, obr. 20A). Obr. 20: Stanovené množství Zn (II) v proteinech vázajících zinek v buňkách S. aureus. A: Množství Zn (II) stanoveného v proteinech u různého počtu izolovaných buněk S. aureus. B: Lineární závislost výšky píku na koncentraci Zn (II). 55